KRAS는 인간 종양에서 가장 빈번히 변이되는 암 유전자이며 그 활성화 돌연변이는 중요한 치료 표적이 된다. CRISPR-Cas 시스템의 Cas9과 single-guide RNA (sgRNA) 복합체는 특정 DNA 서열을 인식하고 관련 유전자를 편집할 수 있도록 이중가닥 절단을 만든다. 여기서 우리는 CRISPR을 이용하여 암세포에서 돌연변이 KRAS 대립유전자를 특이적으로 인식하도록 하였다. 우리는 리포터 시스템을 사용하여 sgRNA를 스크리닝하고, Cas9 및 sgRNA를 ...
KRAS는 인간 종양에서 가장 빈번히 변이되는 암 유전자이며 그 활성화 돌연변이는 중요한 치료 표적이 된다. CRISPR-Cas 시스템의 Cas9과 single-guide RNA (sgRNA) 복합체는 특정 DNA 서열을 인식하고 관련 유전자를 편집할 수 있도록 이중가닥 절단을 만든다. 여기서 우리는 CRISPR을 이용하여 암세포에서 돌연변이 KRAS 대립유전자를 특이적으로 인식하도록 하였다. 우리는 리포터 시스템을 사용하여 sgRNA를 스크리닝하고, Cas9 및 sgRNA를 렌티바이러스 전달 후 암세포에서 그 영향을 검증하였다. 구체적으로는, Cas9 및 sgRNA의 전달 후에 시험관 내 암세포의 생존과 증식, 종양 형성 및 생체 내 종양의 성장을 측정하였다. 우리는 야생형 대립유전자에의 영향없이 돌연변이 KRAS만을 효과적으로 표적화하는 sgRNA를 개발하였다. Cas9을 발현하는 렌티바이러스를 이용해 형질 전환시킨 KRAS 돌연변이 암세포에서 doxycycline에 의해 발현이 제어되는 sgRNA를 발현시켰을 때, 돌연변이 KRAS 유전자를 파괴하고 시험관 내 및 생체 내에서 암세포의 억제가 유도되었다. Cas9 및 sgRNA를 발현하는 렌티바이러스 및 아데노관련바이러스의 종양 내 주입은 면역 결핍 마우스에서 생체 내 종양 성장억제를 유도하였다. 야생형 KRAS를 함유한 세포에서의 Cas9 및 sgRNA의 발현은 유전자를 거의 변화시키지 않았고, 시험관 내 및 생체 내에서 세포의 생존 또는 증식을 변화시키지 않았다. 본 연구는 CRISPR가 암의 드라이버 돌연변이(driver mutation)를 표적으로 하는데 이용될 수 있다는 개념을 증명함으로써 드라이버 돌연변이 관련 암의 특정 염기서열 특이적 치료법의 개발 가능성을 제시한다.
KRAS는 인간 종양에서 가장 빈번히 변이되는 암 유전자이며 그 활성화 돌연변이는 중요한 치료 표적이 된다. CRISPR-Cas 시스템의 Cas9과 single-guide RNA (sgRNA) 복합체는 특정 DNA 서열을 인식하고 관련 유전자를 편집할 수 있도록 이중가닥 절단을 만든다. 여기서 우리는 CRISPR을 이용하여 암세포에서 돌연변이 KRAS 대립유전자를 특이적으로 인식하도록 하였다. 우리는 리포터 시스템을 사용하여 sgRNA를 스크리닝하고, Cas9 및 sgRNA를 렌티바이러스 전달 후 암세포에서 그 영향을 검증하였다. 구체적으로는, Cas9 및 sgRNA의 전달 후에 시험관 내 암세포의 생존과 증식, 종양 형성 및 생체 내 종양의 성장을 측정하였다. 우리는 야생형 대립유전자에의 영향없이 돌연변이 KRAS만을 효과적으로 표적화하는 sgRNA를 개발하였다. Cas9을 발현하는 렌티바이러스를 이용해 형질 전환시킨 KRAS 돌연변이 암세포에서 doxycycline에 의해 발현이 제어되는 sgRNA를 발현시켰을 때, 돌연변이 KRAS 유전자를 파괴하고 시험관 내 및 생체 내에서 암세포의 억제가 유도되었다. Cas9 및 sgRNA를 발현하는 렌티바이러스 및 아데노관련바이러스의 종양 내 주입은 면역 결핍 마우스에서 생체 내 종양 성장억제를 유도하였다. 야생형 KRAS를 함유한 세포에서의 Cas9 및 sgRNA의 발현은 유전자를 거의 변화시키지 않았고, 시험관 내 및 생체 내에서 세포의 생존 또는 증식을 변화시키지 않았다. 본 연구는 CRISPR가 암의 드라이버 돌연변이(driver mutation)를 표적으로 하는데 이용될 수 있다는 개념을 증명함으로써 드라이버 돌연변이 관련 암의 특정 염기서열 특이적 치료법의 개발 가능성을 제시한다.
KRAS is the most frequently mutated oncogene in human tumors and its activating mutations represents important therapeutic targets. The combination of Cas9 and guide RNA from the CRISPR-Cas system recognizes a specific DNA sequence and makes a double-strand break, which enables editing of the releva...
KRAS is the most frequently mutated oncogene in human tumors and its activating mutations represents important therapeutic targets. The combination of Cas9 and guide RNA from the CRISPR-Cas system recognizes a specific DNA sequence and makes a double-strand break, which enables editing of the relevant genes. Here we harnessed CRISPR to specifically target mutant KRAS alleles in cancer cells. We screened guide RNAs using a reporter system and validated them in cancer cells after lentiviral delivery of Cas9 and guide RNA. The survival, proliferation, and tumorigenicity of cancer cells in vitro and the growth of tumors in vivo were determined after delivery of Cas9 and guide RNA. We identified guide RNAs that efficiently target mutant KRAS without significant alterations of the wild-type allele. Doxycycline-inducible expression of this guide RNA in KRAS mutant cancer cells transduced with a lentiviral vector encoding Cas9 disrupted the mutant KRAS gene, leading to inhibition of cancer cell proliferation both in vitro and in vivo. Intratumoral injection of delivery of lentivirus and adeno-associated virus expressing Cas9 and sgRNA suppressed tumor growth in vivo in immunodeficient mice. Expression of Cas9 and the guide RNA in cells containing wild-type KRAS barely changed the gene and did not alter cell survival or proliferation either in vitro and in vivo. Our study provides a proof-of-concept that CRISPR can be utilized to target driver mutations of cancers, opening a novel class of sequence-specific therapeutic modalities for certain subsets of driver mutation-associated cancers.
KRAS is the most frequently mutated oncogene in human tumors and its activating mutations represents important therapeutic targets. The combination of Cas9 and guide RNA from the CRISPR-Cas system recognizes a specific DNA sequence and makes a double-strand break, which enables editing of the relevant genes. Here we harnessed CRISPR to specifically target mutant KRAS alleles in cancer cells. We screened guide RNAs using a reporter system and validated them in cancer cells after lentiviral delivery of Cas9 and guide RNA. The survival, proliferation, and tumorigenicity of cancer cells in vitro and the growth of tumors in vivo were determined after delivery of Cas9 and guide RNA. We identified guide RNAs that efficiently target mutant KRAS without significant alterations of the wild-type allele. Doxycycline-inducible expression of this guide RNA in KRAS mutant cancer cells transduced with a lentiviral vector encoding Cas9 disrupted the mutant KRAS gene, leading to inhibition of cancer cell proliferation both in vitro and in vivo. Intratumoral injection of delivery of lentivirus and adeno-associated virus expressing Cas9 and sgRNA suppressed tumor growth in vivo in immunodeficient mice. Expression of Cas9 and the guide RNA in cells containing wild-type KRAS barely changed the gene and did not alter cell survival or proliferation either in vitro and in vivo. Our study provides a proof-of-concept that CRISPR can be utilized to target driver mutations of cancers, opening a novel class of sequence-specific therapeutic modalities for certain subsets of driver mutation-associated cancers.
주제어
#Cas9-CRISPR 유전자가위 암 유전자 KRAS 유전자치료 CRISPR-Cas9 oncogene gene therapy
학위논문 정보
저자
이상은
학위수여기관
연세대학교 대학원
학위구분
국내석사
학과
의과학과
지도교수
김형범
발행연도
2018
총페이지
45장
키워드
Cas9-CRISPR 유전자가위 암 유전자 KRAS 유전자치료 CRISPR-Cas9 oncogene gene therapy
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