FAO/WHO(2002) 정의에 따르면 프로바이오틱스는 건강한 사람의 장에 살며, 적절한 양을 섭취 하였을 때 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 의미한다. 프로바이오틱스는 장 건강에 도움이 되는 것으로 잘 알려져 있으며, 이 외에도 대사 질환 개선, 면역 조절, 콜레스테롤 감소 등과 같은 다양한 기능성이 계속해서 밝혀지고 있다. 이러한 프로바이오틱스가 제품으로 활용되기 위해서는 균의 안정성 및 안전성에 대한 과학적 근거를 확보하는 것이 중요하다. 즉 일반 식품이나 의약품과 달리 생균(live cell)을 사용하기 때문에 제조, 보관 및 유통 시 생균수를 최대한 높게 유지해야 하며, 섭취했을 때 감염, ...
FAO/WHO(2002) 정의에 따르면 프로바이오틱스는 건강한 사람의 장에 살며, 적절한 양을 섭취 하였을 때 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 의미한다. 프로바이오틱스는 장 건강에 도움이 되는 것으로 잘 알려져 있으며, 이 외에도 대사 질환 개선, 면역 조절, 콜레스테롤 감소 등과 같은 다양한 기능성이 계속해서 밝혀지고 있다. 이러한 프로바이오틱스가 제품으로 활용되기 위해서는 균의 안정성 및 안전성에 대한 과학적 근거를 확보하는 것이 중요하다. 즉 일반 식품이나 의약품과 달리 생균(live cell)을 사용하기 때문에 제조, 보관 및 유통 시 생균수를 최대한 높게 유지해야 하며, 섭취했을 때 감염, 뮤신 분해, 용혈성 등과 같은 독성을 나타내지 않아야 한다. 본 연구의 목적은 유아의 분변 및 식품으로부터 in vitro 테스트를 통하여 선발된 안전성, 안정성 및 항산화능이 우수한 후보주에 대하여 in vivo 효능을 조사한 다음, 이들의 최적 배양 조건을 확립하는 것이다. 유아의 분변 및 전통식품을 de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 또는 transoligo−saccharide (TOS)-propionate 선택배지에 배양하여 분리한 젖산균들에 대하여 현미경 관찰 및 16S rRNA 분석을 거쳐 401주의 젖산균을 확보하였다. 그리고 내산성 및 내담즙성 테스트를 통하여 안정성을 비교한 후 항산화능을 분석하여 프로바이오틱스로서 기능성을 평가하였다. 그 결과, 410주 중 내산성 80% 이상, 내담즙성 100% 이상, 항산화능 75% 이상을 모두 만족하면서 동시에 식약처 고시형 5속 19종에 속하는 51주의 젖산균을 선발하였다. 이 균주들에 대하여 프로바이오틱스의 인체 안전성 지표인 용혈성, 젤라틴 분해능 및 우레아제 활성을 조사한 결과 모두 음성으로 확인되었다. 그리고 51주에 대하여 당 이용성, 효소 활성 및 배양성 테스트 결과를 종합하여 5균주 (Enterococcus faecium CKDB003, Lactobacillus acidophilus CKDB007, Streptococcus thermophilus CKDB021, Bifidobacterium bifidum CKDB001, Bifidobacterium animalis subsp. lactis CKDB005) 를 선발한 다음, 항생제 내성 및 RAPD pattern을 추가로 조사한 다음 이 균주들을 최종 후보주로 선정하였다. 또한 기존 in vivo 연구에서 콜레스테롤 개선 효과를 갖는 것으로 보고었던 Pdiococcus pentosaceus KID7도 후보주에 포함하여 연구를 수행하였다. 새로 분리한 5균주와 P. pentosaceus KID7을 변비 유발 모델동물 (loperamide-3 mg/kg in Sprague Dawley rats)에 단일 균주 형태 또는 혼합 균주 형태로 경구투여(108 CFU/kg∙day, 14days)한 다음 변비 개선 효과를 분석하였다. P. pentosaceus KID7 단독투여 실험군, P. pentosaceus KID7를 제외한5균주 혼합제품 투여 실험군 및 6균주 혼합제품 투여 실험군에서 정상대조군 및 음성 대조군에 비하여 분변의 무게와 수분함량이 크게 높아지는 결과를 확인하였다 (p < 0.05). 소화관 이동율에 있어서는, 프로바이오틱스를 투여한 모든 실험군에서 음성 대조군보다 증가하였으며, 특히 6균주 혼합제품 투여 실험군에서 가장 크게 증가하였다. 또한 소화관의 점막 길이와 점액 분비 및 맹장에서의 단쇄지방산(short chain fatty acid, SCFA) 생산에 있어서도 프로바이오틱스를 투여한 모든 실험군에서 음성대조군보다 증가하였고, 특히6균주 혼합제품 투여 실험군에서 가장 높은 효과를 보였다 (p < 0.05). 추가로 메타지놈 분석 결과 P. pentosaceus KID7 투여 실험군, 5균주 혼합제품 투여 실험군 및 6균주 혼합제품 투여 실험군에서 Lactobacillus sp. 의 비율이 각각 61.94%, 60.31%, 51.94%로 다른 실험군에 비하여 상대적으로 높은 비율을 나타냈다. 변비 개선 효과가 확인된 6균주에 대한 배양 조건 최적화 연구와 안정성 향상 연구를 진행하였다. 이를 위하여 배양공정 및 배양 이후 공정에서 젖산균의 스트레스에 대한 반응과 이에 따른 안정성 분석을 위해 다양한 실험을 수행하였다. 우선 L. plantarum CKDB007의 배양 후 농축액에 20가지 아미노산을 첨가한 다음 동결건조 안정성 및 저장 안정성을 평가하였을 때, 가장 효과적인 아미노산은 프롤린이었다. 또한, 배양 중에 프롤린을 첨가한 경우에도 안정성이 크게 향상되었으며, 배양액의 삼투압과 세포 내 프롤린 농도는 배양이 진행됨에 따라 비례적으로 증가하였다. 그리고 배양하는 동안 최적 프롤린 첨가시점과 첨가농도에 대하여 조사한 결과, 대수증식기 중반 이후에 프롤린을 5 g/L 농도로 첨가하는 것이 바람직하였다. 이러한 결과를 바탕으로 후보주로 선정된 6가지 유산균에 대하여 배양 중 프롤린을 첨가하였을 때, 균주에 따라 차이가 있었지만 6균주 모두 배양 중 프롤린을 첨가한 경우 안정성이 증가하였다. 또한 동결건조 후 분말의 내산성과 내담즙성도 증가하는 경향을 보였지만, 균주별로 개선 정도 및 유의성에는 차이를 나타내었다. 위의 실험 결과들을 종합해 볼 때, 신규 분리한 젖산균 (E. faecium CKDB003, L. acidophilus CKDB007, S. thermophilus CKDB021, B. bifidum CKDB001, B. lactis CKDB005)은 in vitro에서 프로바이오틱스로서 갖추어야 할 기본 특성을 보유한 것으로 확인되었다. 그리고 5균주와 콜레스테롤 개선 효능이 있는 것으로 알려진 P. pentosaceus KID7을 포함하는 6균주 모두 in vivo 동물실험에서 변비 개선 효과가 우수하였으며, 특히 6균주를 혼합하여 투여할 경우 가장 효과적이었다. 마지막으로 배양 과정에서 프롤린을 첨가할 경우 균주에 따라 차이가 있었지만 6균주 모두 저장안정성 및 장관환경 안정성이 증가하였다.
FAO/WHO(2002) 정의에 따르면 프로바이오틱스는 건강한 사람의 장에 살며, 적절한 양을 섭취 하였을 때 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 의미한다. 프로바이오틱스는 장 건강에 도움이 되는 것으로 잘 알려져 있으며, 이 외에도 대사 질환 개선, 면역 조절, 콜레스테롤 감소 등과 같은 다양한 기능성이 계속해서 밝혀지고 있다. 이러한 프로바이오틱스가 제품으로 활용되기 위해서는 균의 안정성 및 안전성에 대한 과학적 근거를 확보하는 것이 중요하다. 즉 일반 식품이나 의약품과 달리 생균(live cell)을 사용하기 때문에 제조, 보관 및 유통 시 생균수를 최대한 높게 유지해야 하며, 섭취했을 때 감염, 뮤신 분해, 용혈성 등과 같은 독성을 나타내지 않아야 한다. 본 연구의 목적은 유아의 분변 및 식품으로부터 in vitro 테스트를 통하여 선발된 안전성, 안정성 및 항산화능이 우수한 후보주에 대하여 in vivo 효능을 조사한 다음, 이들의 최적 배양 조건을 확립하는 것이다. 유아의 분변 및 전통식품을 de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 또는 transoligo−saccharide (TOS)-propionate 선택배지에 배양하여 분리한 젖산균들에 대하여 현미경 관찰 및 16S rRNA 분석을 거쳐 401주의 젖산균을 확보하였다. 그리고 내산성 및 내담즙성 테스트를 통하여 안정성을 비교한 후 항산화능을 분석하여 프로바이오틱스로서 기능성을 평가하였다. 그 결과, 410주 중 내산성 80% 이상, 내담즙성 100% 이상, 항산화능 75% 이상을 모두 만족하면서 동시에 식약처 고시형 5속 19종에 속하는 51주의 젖산균을 선발하였다. 이 균주들에 대하여 프로바이오틱스의 인체 안전성 지표인 용혈성, 젤라틴 분해능 및 우레아제 활성을 조사한 결과 모두 음성으로 확인되었다. 그리고 51주에 대하여 당 이용성, 효소 활성 및 배양성 테스트 결과를 종합하여 5균주 (Enterococcus faecium CKDB003, Lactobacillus acidophilus CKDB007, Streptococcus thermophilus CKDB021, Bifidobacterium bifidum CKDB001, Bifidobacterium animalis subsp. lactis CKDB005) 를 선발한 다음, 항생제 내성 및 RAPD pattern을 추가로 조사한 다음 이 균주들을 최종 후보주로 선정하였다. 또한 기존 in vivo 연구에서 콜레스테롤 개선 효과를 갖는 것으로 보고었던 Pdiococcus pentosaceus KID7도 후보주에 포함하여 연구를 수행하였다. 새로 분리한 5균주와 P. pentosaceus KID7을 변비 유발 모델동물 (loperamide-3 mg/kg in Sprague Dawley rats)에 단일 균주 형태 또는 혼합 균주 형태로 경구투여(108 CFU/kg∙day, 14days)한 다음 변비 개선 효과를 분석하였다. P. pentosaceus KID7 단독투여 실험군, P. pentosaceus KID7를 제외한5균주 혼합제품 투여 실험군 및 6균주 혼합제품 투여 실험군에서 정상대조군 및 음성 대조군에 비하여 분변의 무게와 수분함량이 크게 높아지는 결과를 확인하였다 (p < 0.05). 소화관 이동율에 있어서는, 프로바이오틱스를 투여한 모든 실험군에서 음성 대조군보다 증가하였으며, 특히 6균주 혼합제품 투여 실험군에서 가장 크게 증가하였다. 또한 소화관의 점막 길이와 점액 분비 및 맹장에서의 단쇄지방산(short chain fatty acid, SCFA) 생산에 있어서도 프로바이오틱스를 투여한 모든 실험군에서 음성대조군보다 증가하였고, 특히6균주 혼합제품 투여 실험군에서 가장 높은 효과를 보였다 (p < 0.05). 추가로 메타지놈 분석 결과 P. pentosaceus KID7 투여 실험군, 5균주 혼합제품 투여 실험군 및 6균주 혼합제품 투여 실험군에서 Lactobacillus sp. 의 비율이 각각 61.94%, 60.31%, 51.94%로 다른 실험군에 비하여 상대적으로 높은 비율을 나타냈다. 변비 개선 효과가 확인된 6균주에 대한 배양 조건 최적화 연구와 안정성 향상 연구를 진행하였다. 이를 위하여 배양공정 및 배양 이후 공정에서 젖산균의 스트레스에 대한 반응과 이에 따른 안정성 분석을 위해 다양한 실험을 수행하였다. 우선 L. plantarum CKDB007의 배양 후 농축액에 20가지 아미노산을 첨가한 다음 동결건조 안정성 및 저장 안정성을 평가하였을 때, 가장 효과적인 아미노산은 프롤린이었다. 또한, 배양 중에 프롤린을 첨가한 경우에도 안정성이 크게 향상되었으며, 배양액의 삼투압과 세포 내 프롤린 농도는 배양이 진행됨에 따라 비례적으로 증가하였다. 그리고 배양하는 동안 최적 프롤린 첨가시점과 첨가농도에 대하여 조사한 결과, 대수증식기 중반 이후에 프롤린을 5 g/L 농도로 첨가하는 것이 바람직하였다. 이러한 결과를 바탕으로 후보주로 선정된 6가지 유산균에 대하여 배양 중 프롤린을 첨가하였을 때, 균주에 따라 차이가 있었지만 6균주 모두 배양 중 프롤린을 첨가한 경우 안정성이 증가하였다. 또한 동결건조 후 분말의 내산성과 내담즙성도 증가하는 경향을 보였지만, 균주별로 개선 정도 및 유의성에는 차이를 나타내었다. 위의 실험 결과들을 종합해 볼 때, 신규 분리한 젖산균 (E. faecium CKDB003, L. acidophilus CKDB007, S. thermophilus CKDB021, B. bifidum CKDB001, B. lactis CKDB005)은 in vitro에서 프로바이오틱스로서 갖추어야 할 기본 특성을 보유한 것으로 확인되었다. 그리고 5균주와 콜레스테롤 개선 효능이 있는 것으로 알려진 P. pentosaceus KID7을 포함하는 6균주 모두 in vivo 동물실험에서 변비 개선 효과가 우수하였으며, 특히 6균주를 혼합하여 투여할 경우 가장 효과적이었다. 마지막으로 배양 과정에서 프롤린을 첨가할 경우 균주에 따라 차이가 있었지만 6균주 모두 저장안정성 및 장관환경 안정성이 증가하였다.
According to the FAO and WHO, probiotics are live microorganisms which, in adequate amounts, confer a health benefit to their hosts. Scientific evidence is steadily accumulating about the beneficial impact of lactic acid bacteria (“LAB”) on various aspects of host health, including metabolic syndrom...
According to the FAO and WHO, probiotics are live microorganisms which, in adequate amounts, confer a health benefit to their hosts. Scientific evidence is steadily accumulating about the beneficial impact of lactic acid bacteria (“LAB”) on various aspects of host health, including metabolic syndromes, immune disorders, and inflammatory bowel diseases. Unlike other food or drug ingredients, probiotics are unique in that they are consumed when they are alive, which means that their consumption carries risks such as infection, toxin production, mucin degradation, and hemolysis. Therefore, controlling microbial activity and stability is one of the most important factors for maximizing probiotic potency. The purpose of this study was to isolate candidate LAB strains from infant feces and food and to analyze their stability, safety, and antioxidant effects. Candidate strains were then selected for further study on their efficacy in relieving loperamide (3 mg/kg)-induced constipation in Sprague Dawley rats. Each candidate strain was then developed with an optimal culture process. The LAB characteristics were analyzed after being cultured in MRS and TOS-propionate selective isolation media. As a result, 410 strains from 9 genera and 42 species were selected after morphological observation and 16S rRNA analysis. Acid and bile salt tolerance tests were conducted to determine the stability of the selected strains. The selected strains’ antioxidant activity was also measured to evaluate their suitability as probiotics. Of the 410 candidate strains, 51 met the criteria of having an acid tolerance greater than 80%, a bile salt tolerance greater than 100%, and antioxidant activity greater than 75%. The metabolic characteristics of these 51 strains were profiled by investigating their sugar fermentation patterns and enzymatic activity. Probiotics for human use should not pose any risk or danger to the host after intake, so the 51 strains were tested for hemolysis, gelatinase, and urease activity. No detrimental activities were observed. Five strains (Enterococcus faecium CKDB003, Lactobacillus acidophilus CKDB007, Streptococcus thermophilus CKDB021, Bifidobacterium bifidum CKDB001, and Bifidobacterium animalis subsp. lactis CKDB005) were then selected as they met additional antibiotic resistance criteria. Pediococcus pentosaceus KID7, which had been reported as having a cholesterol-lowering effect, was also selected for further experiment. A single bacterium or a mixture of bacteria from the final six experimental strains were administered as probiotics to Sprague Dawley rats with loperamide (3 mg/kg)-induced constipation to investigate their efficacy in relieving constipation. The LABs were orally administered to the rats at a concentration of 108 CFU/kg per day for 14 days. The quantity of the stool of the rats that were administered P. pentosaceus KID7 (PP), the mixture of all of the final strains except for P. pentosaceus KID7 (“CKDB”), and the mixture of all six strains (“CKDBP”) was found to be significantly higher than that of the negative and constipation-induced control groups (p < 0.05). The intestinal transit ratio was significantly higher for all of the experimental groups than for the control group. The group that had the highest intestinal transit ratio was the group that was administered CKDBP (p < 0.05). Mucosal length and mucus secretion were significantly better for all experimental groups than for the control group. The CKDBP was found to be the most effective according to immunohistochemistry (“IHC”) staining and total short chain fatty acid content analyses (p < 0.05). The groups that were administered PP, CKDB, and CKDBP had the three highest Lactobacillus sp. ratios of 61.94%, 60.31% and 51.94%, respectively, based on metagenomic analysis. Finally, the experiment to determine optimal culture conditions and how to enhance stability were conducted using the six strains that were proven to be effective for reducing constipation and Lactobacillus plantarum CKDB007, one of 51 strains isolated in this study. Various tests were conducted to monitor LAB stress responses and stability during the downstream and bacterial culture processes. Twenty amino acids were added to the concentrate after culturing L. plantarum CKDB007 strain. Proline was seen to remarkably increase the storage stability of the probiotics in freeze-dried powder form. Moreover, even when proline was added during the cultivation process, the stability of the freeze-dried powder also significantly increased. Furthermore, osmotic pressure and intracellular proline concentration were seen to increase proportionally during the L. plantarum CKDB007 culturing process. During the culturing process, the optimum feeding time was found to be the midlogarithmic growth phase and the optimum concentration was found to be 5 g/L. Although, the stability of the strains in freeze-dried powder form was significantly increased when they were fed with proline, there were other noticeable differences between the strains. The acid resistance and bile salt tolerance of all six strains in freeze-dried powder form increased when they were fed proline during the culture process, although the degree to which they improved and the statistical significance of the results differed for each strain. In summary, the basic probiotic characteristics of the newly-isolated strains were investigated in vitro. They were found to be effective in reducing constipation, especially when mixed together. Feeding the strains proline during the culture process significantly increased their stability.
According to the FAO and WHO, probiotics are live microorganisms which, in adequate amounts, confer a health benefit to their hosts. Scientific evidence is steadily accumulating about the beneficial impact of lactic acid bacteria (“LAB”) on various aspects of host health, including metabolic syndromes, immune disorders, and inflammatory bowel diseases. Unlike other food or drug ingredients, probiotics are unique in that they are consumed when they are alive, which means that their consumption carries risks such as infection, toxin production, mucin degradation, and hemolysis. Therefore, controlling microbial activity and stability is one of the most important factors for maximizing probiotic potency. The purpose of this study was to isolate candidate LAB strains from infant feces and food and to analyze their stability, safety, and antioxidant effects. Candidate strains were then selected for further study on their efficacy in relieving loperamide (3 mg/kg)-induced constipation in Sprague Dawley rats. Each candidate strain was then developed with an optimal culture process. The LAB characteristics were analyzed after being cultured in MRS and TOS-propionate selective isolation media. As a result, 410 strains from 9 genera and 42 species were selected after morphological observation and 16S rRNA analysis. Acid and bile salt tolerance tests were conducted to determine the stability of the selected strains. The selected strains’ antioxidant activity was also measured to evaluate their suitability as probiotics. Of the 410 candidate strains, 51 met the criteria of having an acid tolerance greater than 80%, a bile salt tolerance greater than 100%, and antioxidant activity greater than 75%. The metabolic characteristics of these 51 strains were profiled by investigating their sugar fermentation patterns and enzymatic activity. Probiotics for human use should not pose any risk or danger to the host after intake, so the 51 strains were tested for hemolysis, gelatinase, and urease activity. No detrimental activities were observed. Five strains (Enterococcus faecium CKDB003, Lactobacillus acidophilus CKDB007, Streptococcus thermophilus CKDB021, Bifidobacterium bifidum CKDB001, and Bifidobacterium animalis subsp. lactis CKDB005) were then selected as they met additional antibiotic resistance criteria. Pediococcus pentosaceus KID7, which had been reported as having a cholesterol-lowering effect, was also selected for further experiment. A single bacterium or a mixture of bacteria from the final six experimental strains were administered as probiotics to Sprague Dawley rats with loperamide (3 mg/kg)-induced constipation to investigate their efficacy in relieving constipation. The LABs were orally administered to the rats at a concentration of 108 CFU/kg per day for 14 days. The quantity of the stool of the rats that were administered P. pentosaceus KID7 (PP), the mixture of all of the final strains except for P. pentosaceus KID7 (“CKDB”), and the mixture of all six strains (“CKDBP”) was found to be significantly higher than that of the negative and constipation-induced control groups (p < 0.05). The intestinal transit ratio was significantly higher for all of the experimental groups than for the control group. The group that had the highest intestinal transit ratio was the group that was administered CKDBP (p < 0.05). Mucosal length and mucus secretion were significantly better for all experimental groups than for the control group. The CKDBP was found to be the most effective according to immunohistochemistry (“IHC”) staining and total short chain fatty acid content analyses (p < 0.05). The groups that were administered PP, CKDB, and CKDBP had the three highest Lactobacillus sp. ratios of 61.94%, 60.31% and 51.94%, respectively, based on metagenomic analysis. Finally, the experiment to determine optimal culture conditions and how to enhance stability were conducted using the six strains that were proven to be effective for reducing constipation and Lactobacillus plantarum CKDB007, one of 51 strains isolated in this study. Various tests were conducted to monitor LAB stress responses and stability during the downstream and bacterial culture processes. Twenty amino acids were added to the concentrate after culturing L. plantarum CKDB007 strain. Proline was seen to remarkably increase the storage stability of the probiotics in freeze-dried powder form. Moreover, even when proline was added during the cultivation process, the stability of the freeze-dried powder also significantly increased. Furthermore, osmotic pressure and intracellular proline concentration were seen to increase proportionally during the L. plantarum CKDB007 culturing process. During the culturing process, the optimum feeding time was found to be the midlogarithmic growth phase and the optimum concentration was found to be 5 g/L. Although, the stability of the strains in freeze-dried powder form was significantly increased when they were fed with proline, there were other noticeable differences between the strains. The acid resistance and bile salt tolerance of all six strains in freeze-dried powder form increased when they were fed proline during the culture process, although the degree to which they improved and the statistical significance of the results differed for each strain. In summary, the basic probiotic characteristics of the newly-isolated strains were investigated in vitro. They were found to be effective in reducing constipation, especially when mixed together. Feeding the strains proline during the culture process significantly increased their stability.
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