생리활성 저분자 펩타이드(BBI, Lunasin and Leginsulin)를 포함하는 콩 추출물을 제조하는 열수추출법 A Novel Method for Enrichment of Three Bioactive Peptides (BBI, Lunasin and Leginsulin) from Soybean Seeds원문보기
콩(Glycine max)은 항암활성을 가지는 것으로 예측되는 다양한 단백질 저해제류, 피테이트(phytate), 피토스테롤(phytosterols), 사포닌(saponins), 이소플라본(isoflavones) 등의 피토화합물(phytochemicals)을 가지고 있다. 이러한 다양한 기능성 성분 중, 본 연구에서는 생리활성 ...
콩(Glycine max)은 항암활성을 가지는 것으로 예측되는 다양한 단백질 저해제류, 피테이트(phytate), 피토스테롤(phytosterols), 사포닌(saponins), 이소플라본(isoflavones) 등의 피토화합물(phytochemicals)을 가지고 있다. 이러한 다양한 기능성 성분 중, 본 연구에서는 생리활성 저분자 항암 펩타이드인 BBI, Lunasin 및 Leginsulin에 초점을 맞춰 연구했다. BBI는 대두로부터 1940년대 분리되었으며, Trypsin과 chymotrypsin을 각각의 반응 부위에서 억제하는 단백질이며, 전립선암, 대장암, 유방암, 피부암 등에 효과가 있다고 알려져 있다. Lunasin은 대두를 비롯하여 보리, 밀 등에서도 발견되며, 유방암, 전립선암, 대장암, 폐암, 구강암, 자궁경부암 등에 효과가 있다고 알려져 있다. Leginsulin은 호르몬 유사 생리활성 저분자 펩타이드로, 인슐린, 세포신호 전달의 효과가 있다고 알려져 있다. 이와 같은 대두 내의 유용 펩타이드 각각을 분리하려는 시도는 있어왔으나, 다양한 시약을 사용함에 따라 복잡하고 시간이 오래 걸리는 방법이었다. 또한 세 펩타이드를 동시에 고농도로 빠르고 쉽게 분리하는 방법이 개발되어 있지 않았다. 따라서 본 연구에서는 콩에서 항암 펩타이드로 알려진 세 생리활성 펩타이드 BBI, Lunasin 및 Leginsulin을 경제적으로 대량 추출하는 방법인 열수추출법을 개발했다. 본 연구의 열수추출법은 콩 종자를 열수 추출하여 BBI, Lunasin 및 Leginsulin을 함께 분리하기 위하여, 대두 5 g에 물 15 ml을 넣은 후, 4℃에서 24시간 불려준다. 물을 버린 후, 물 15 ml을 넣은 후, 55℃에서 24시간 진탕가열한다. 진탕가열 후 상등액만 새로운 50 ml 튜브로 옮겨 95℃에서 10 분간 가열한다. 가열 후 고속원심분리기로 1200 rpm에서 15분간 고속 회전시킨 뒤, 이의 상등액을 새로운 50 ml 튜브로 옮겨 4℃ 또는 -20℃에 저장한다. 이렇게 추출된 열수추출물을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 10 에서 15 kDa에서 한 밴드로만 존재했다. 콩으로부터 추출물을 제조할 때, 증류수 대신에 0.1 M PBS, 0.1 M Tris(pH 7.6) 또는 250 mM potassium phosphate(KH2PO4)을 이용하여 동일한 조건으로 단백질을 추출한 결과를 SDS-PAGE를 통해 비교 분석했다. 그 결과, 증류수로 추출한 결과에서 반복적이고 단백질 패턴이 단일밴드로 나타나 증류수를 이용한 방법으로 채택했다. 이렇게 콩으로부터 추출된 열수추출물에서 세 가지 생체활성 펩타이드(BBI, Lunasin 및 Leginsulin)의 존재를 확인하기 위해, 제작한 BBI, Lunasin 및 Leginsulin 항체를 이용해 Western blot 분석을 수행하였고, 세 펩타이드가 모두 존재함을 확인했다. 이 중, BBI는 Trypsin과 chymotrypsin 저해제로써, 열수추출물에서 BBI의 존재를 다시 한번 확인하기 위해 Trypsin과 chymotrypsin 저해제 활성 분석을 수행한 결과, 열수추출물에서 두 저해제 활성이 감소됨을 확인했다. 이러한 열수추출법에 따라 분리된 BBI, Lunasin 및 Leginsulin가 어디서 유래된 것인지 알아보기 위해 SDS-PAGE 분석 및 Western blot 분석을 수행했다. 그 결과, 세 펩타이드 중, 배아 분획 (WE)에서 검출 된 Leginsulin만이, 콩 씨앗 배아에 주로 국한되어 있음을 시사했다. 열수추출물이 액체 상태이기 때문에 발생하는 보관상의 어려움을 해결하기 위하여, 열수추출물을 60℃에서 0 atm으로 24시간 동안 동결건조하여 분말화하였다. 이 과정에서 얻은 분말을 SDS-PAGE로 확인한 결과, 열수추출물과 동일하게 나타났으며, 열수추출물과 같이 Western blot 분석 결과, BBI, Lunasin및 Leginsulin이 모두 존재함을 확인했다. 콩 품종 별 세 항암 펩타이드의 함량 차이를 확인하기 위하여, 25가지 품종의 대두를 열수추출하여 BBI, Lunasin 및 Leginsulin의 함량을 SDS-PAGE분석 및 Western blot 분석을 통해 비교했다. 그 결과, 각 품종별로 BBI, Lunasin 및 Leginsulin의 함유량이 조금씩 다른 것을 알 수 있었으며, 세 항암 단백질이 새단백 품종에서 높았으며, 쥐눈이콩 품종 중에서는 종자 표면에 분이 있는 종자에서 다량 함유되어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 열수추출법은 기존의 단백질 추출법에서 콩을 갈아야 하는 불편함과 다양한 시약, 방법이 들어가던 것과는 달리 간단하고 빠르게 추출 할 수 있는 획기적인 방법이라 생각한다. 또한 다른 용매 없이 물로만 추출 시 식품으로 가공`제조가 가능하단 점에서, 산업화에 유리하다 생각한다. 이러한 열수추출법을 이용하여 품종에 따라 쉽게 확인이 가능하다면, 이 열수추출물을 마커로 활용하여 기능성 품종개발 및 육종연구에 크게 활용이 가능 할 것으로 예상된다.
콩(Glycine max)은 항암활성을 가지는 것으로 예측되는 다양한 단백질 저해제류, 피테이트(phytate), 피토스테롤(phytosterols), 사포닌(saponins), 이소플라본(isoflavones) 등의 피토화합물(phytochemicals)을 가지고 있다. 이러한 다양한 기능성 성분 중, 본 연구에서는 생리활성 저분자 항암 펩타이드인 BBI, Lunasin 및 Leginsulin에 초점을 맞춰 연구했다. BBI는 대두로부터 1940년대 분리되었으며, Trypsin과 chymotrypsin을 각각의 반응 부위에서 억제하는 단백질이며, 전립선암, 대장암, 유방암, 피부암 등에 효과가 있다고 알려져 있다. Lunasin은 대두를 비롯하여 보리, 밀 등에서도 발견되며, 유방암, 전립선암, 대장암, 폐암, 구강암, 자궁경부암 등에 효과가 있다고 알려져 있다. Leginsulin은 호르몬 유사 생리활성 저분자 펩타이드로, 인슐린, 세포신호 전달의 효과가 있다고 알려져 있다. 이와 같은 대두 내의 유용 펩타이드 각각을 분리하려는 시도는 있어왔으나, 다양한 시약을 사용함에 따라 복잡하고 시간이 오래 걸리는 방법이었다. 또한 세 펩타이드를 동시에 고농도로 빠르고 쉽게 분리하는 방법이 개발되어 있지 않았다. 따라서 본 연구에서는 콩에서 항암 펩타이드로 알려진 세 생리활성 펩타이드 BBI, Lunasin 및 Leginsulin을 경제적으로 대량 추출하는 방법인 열수추출법을 개발했다. 본 연구의 열수추출법은 콩 종자를 열수 추출하여 BBI, Lunasin 및 Leginsulin을 함께 분리하기 위하여, 대두 5 g에 물 15 ml을 넣은 후, 4℃에서 24시간 불려준다. 물을 버린 후, 물 15 ml을 넣은 후, 55℃에서 24시간 진탕가열한다. 진탕가열 후 상등액만 새로운 50 ml 튜브로 옮겨 95℃에서 10 분간 가열한다. 가열 후 고속원심분리기로 1200 rpm에서 15분간 고속 회전시킨 뒤, 이의 상등액을 새로운 50 ml 튜브로 옮겨 4℃ 또는 -20℃에 저장한다. 이렇게 추출된 열수추출물을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 10 에서 15 kDa에서 한 밴드로만 존재했다. 콩으로부터 추출물을 제조할 때, 증류수 대신에 0.1 M PBS, 0.1 M Tris(pH 7.6) 또는 250 mM potassium phosphate(KH2PO4)을 이용하여 동일한 조건으로 단백질을 추출한 결과를 SDS-PAGE를 통해 비교 분석했다. 그 결과, 증류수로 추출한 결과에서 반복적이고 단백질 패턴이 단일밴드로 나타나 증류수를 이용한 방법으로 채택했다. 이렇게 콩으로부터 추출된 열수추출물에서 세 가지 생체활성 펩타이드(BBI, Lunasin 및 Leginsulin)의 존재를 확인하기 위해, 제작한 BBI, Lunasin 및 Leginsulin 항체를 이용해 Western blot 분석을 수행하였고, 세 펩타이드가 모두 존재함을 확인했다. 이 중, BBI는 Trypsin과 chymotrypsin 저해제로써, 열수추출물에서 BBI의 존재를 다시 한번 확인하기 위해 Trypsin과 chymotrypsin 저해제 활성 분석을 수행한 결과, 열수추출물에서 두 저해제 활성이 감소됨을 확인했다. 이러한 열수추출법에 따라 분리된 BBI, Lunasin 및 Leginsulin가 어디서 유래된 것인지 알아보기 위해 SDS-PAGE 분석 및 Western blot 분석을 수행했다. 그 결과, 세 펩타이드 중, 배아 분획 (WE)에서 검출 된 Leginsulin만이, 콩 씨앗 배아에 주로 국한되어 있음을 시사했다. 열수추출물이 액체 상태이기 때문에 발생하는 보관상의 어려움을 해결하기 위하여, 열수추출물을 60℃에서 0 atm으로 24시간 동안 동결건조하여 분말화하였다. 이 과정에서 얻은 분말을 SDS-PAGE로 확인한 결과, 열수추출물과 동일하게 나타났으며, 열수추출물과 같이 Western blot 분석 결과, BBI, Lunasin및 Leginsulin이 모두 존재함을 확인했다. 콩 품종 별 세 항암 펩타이드의 함량 차이를 확인하기 위하여, 25가지 품종의 대두를 열수추출하여 BBI, Lunasin 및 Leginsulin의 함량을 SDS-PAGE분석 및 Western blot 분석을 통해 비교했다. 그 결과, 각 품종별로 BBI, Lunasin 및 Leginsulin의 함유량이 조금씩 다른 것을 알 수 있었으며, 세 항암 단백질이 새단백 품종에서 높았으며, 쥐눈이콩 품종 중에서는 종자 표면에 분이 있는 종자에서 다량 함유되어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 열수추출법은 기존의 단백질 추출법에서 콩을 갈아야 하는 불편함과 다양한 시약, 방법이 들어가던 것과는 달리 간단하고 빠르게 추출 할 수 있는 획기적인 방법이라 생각한다. 또한 다른 용매 없이 물로만 추출 시 식품으로 가공`제조가 가능하단 점에서, 산업화에 유리하다 생각한다. 이러한 열수추출법을 이용하여 품종에 따라 쉽게 확인이 가능하다면, 이 열수추출물을 마커로 활용하여 기능성 품종개발 및 육종연구에 크게 활용이 가능 할 것으로 예상된다.
Soybean has been widely known that it contains various functional ingredients such as trypsin inhibitor, lecithin, phytic acid, pinitol, saponin, functional peptides, and isoflavone. In this study, we focused on Bowman-Birk Protease Inhibitor (BBI, 8 kDa), Lunasin (5.5 kDa), and Leginsulin (4 kDa), ...
Soybean has been widely known that it contains various functional ingredients such as trypsin inhibitor, lecithin, phytic acid, pinitol, saponin, functional peptides, and isoflavone. In this study, we focused on Bowman-Birk Protease Inhibitor (BBI, 8 kDa), Lunasin (5.5 kDa), and Leginsulin (4 kDa), which are well known as anticancer peptide, anti-inflammatory peptide, and cell signaling molecule. The conventional processes for protein purification are complicated, time consuming, low yield, and costive. So far, it was not reported that three bioactive peptides (BBI, Lunasin, and Leginsulin) from seed can be isolated and purified at the same time. In this study, we first reports a novel method to simultaneously purify BBI, Lunasin, and Leginsulin from soybean seeds using the warm water extraction method. Efficiency and purity of BBI, Lunasin, and Leginsulin were confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis, resulting that three bioactive peptides are predominantly enriched in warm water extract fraction. We also monitored accumulation of the three bioactive peptides from twenty four varieties of soybean seeds as well using Western blot. Among them, BBI, Lunasin, and Leginsulin, were highly accumulated in Socheong 2 compared to Daewon, Saedanbaek, and Neulchan. Therefore, our warm water extraction method is reliable, simple, time-consuming, and cost-effective and useful for high efficient enrichment of three bioactive peptides from soybean seeds.
Soybean has been widely known that it contains various functional ingredients such as trypsin inhibitor, lecithin, phytic acid, pinitol, saponin, functional peptides, and isoflavone. In this study, we focused on Bowman-Birk Protease Inhibitor (BBI, 8 kDa), Lunasin (5.5 kDa), and Leginsulin (4 kDa), which are well known as anticancer peptide, anti-inflammatory peptide, and cell signaling molecule. The conventional processes for protein purification are complicated, time consuming, low yield, and costive. So far, it was not reported that three bioactive peptides (BBI, Lunasin, and Leginsulin) from seed can be isolated and purified at the same time. In this study, we first reports a novel method to simultaneously purify BBI, Lunasin, and Leginsulin from soybean seeds using the warm water extraction method. Efficiency and purity of BBI, Lunasin, and Leginsulin were confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis, resulting that three bioactive peptides are predominantly enriched in warm water extract fraction. We also monitored accumulation of the three bioactive peptides from twenty four varieties of soybean seeds as well using Western blot. Among them, BBI, Lunasin, and Leginsulin, were highly accumulated in Socheong 2 compared to Daewon, Saedanbaek, and Neulchan. Therefore, our warm water extraction method is reliable, simple, time-consuming, and cost-effective and useful for high efficient enrichment of three bioactive peptides from soybean seeds.
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