[학위논문]백색지방의 갈색지방화를 유도하는 새로운 물질의 탐색 및 분자메커니즘 규명 Identification of Novel Dietary and Pharmacological Agents Recruit White-Fat Browning and Elucidating their Molecular Mechanism원문보기
자밀
(Graduate School of Daegu University
생명공학과 Adipocyte biology
국내박사)
비만은 에너지 섭취량이 에너지 소비량을 초과할 때 주로 발생하며 지방을 과도하게 축적하는 특징을 가진다. 칼로리 섭취 제한은 비만에 대한 일차적인 방어 수단으로 간주되지만, 이 방법은 과잉 칼로리 섭취 시 갈색 지방 조직의 기능에 장애를 가진 사람들에게는 떨림 없는 열 생성을 통해 ...
비만은 에너지 섭취량이 에너지 소비량을 초과할 때 주로 발생하며 지방을 과도하게 축적하는 특징을 가진다. 칼로리 섭취 제한은 비만에 대한 일차적인 방어 수단으로 간주되지만, 이 방법은 과잉 칼로리 섭취 시 갈색 지방 조직의 기능에 장애를 가진 사람들에게는 떨림 없는 열 생성을 통해 열에너지를 분산시키는 기능에 문제가 있어 큰 도움이 되지 않는다. 이와 관련하여 백색 지방 세포의 갈색 지방화 방법은 비만에 대해 획기적인 치료 방법으로 고려된다. 최근 성인 대상에서 갈색 지방 조직 (BAT)을 발견 한 후 비만 퇴치 전략으로 BAT의 활성화 및 백색 지방 조직 (WAT)에서의 갈색 지방화로 지방 세포 내의 에너지 소비를 촉진하여 지방 축적을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 의미에서 백색 지방 조직에서 갈색 지방화 유도는 비만과 관련된 합병증 치료를 위한 매력적인 방법이다.
갈색 및 백색 지방 세포는 각각 다른 계통에서 기원하며 서로 다른 전구 세포에서 시작되고 있지만 상호 전환이 가능하다. 백색 지방 세포 내 UCP1의 발현은 일부 외부 자극에 의해 백색 지방 저장고에 열 발생 능력을 가지게 되며 표현형으로는 베이지색 또는 brite (흰색 내 갈색)로 특징지어진다. 이 UCP1에 의한 열 생성은 적응성 열 발산이라 하며 UCP1은 전자 수송 체인을 에너지 생산에서 분리하여 열에너지를 방출한다. 추위에 노출되거나 약리학적 β3 -아드레날린 수용체 활성화에 의해 지방 전구 세포에서 WAT를 재구성하여 WAT 내에 brite 지방세포 발현하는 중요한 요소이다. 백색 지방 세포에서 PGC-1α 및 UCP1 같은 갈색 지방 세포에 대한 이소성 단백질 발현은 BAT와 같은 특이적 반응을 유도한다. 최근 연구에서는 갈색 지방 발현 촉진제의 동정을 목표로 한 PRDM16과 같은 새로운 brite 특이 마커들을 확인했다.
최근에는 WAT의 갈색 지방화에 기여하는 약리학적 및 식이 요법에 대한 이해가 이루어졌으며 capsaicin, berberine, orexin 및 irisin을 포함한 많은 물질이 포유동물의 에너지 소비를 증가시키고 지방 축적을 감소시키는 방법으로 제안되었다. 따라서 본 연구에서는 백색 지방 세포에서 갈색 지방화를 유도하기 위해 curcumin, limonene, honokiol 및 nobiletin과 같은 다양한 새로운 식이 요법 및 약리학적 약물을 성공적으로 스크리닝 했다.
본 연구에서 실시한 첫 번째 연구는 광범위하게 연구된 천연 화합물인 curcumin의 갈색 지방화 유도 효과를 규명하였다. 배양된 백색 지방 세포에서 brite 표현형 유도에 있어 curcumin의 효과를 조사하기 위해 백색 지방세포 모델로 3T3-L1 세포와 쥐의 사타구니 백색 지방 조직(WAT)으로 부터 분리 된 백색 지방 세포 (primary)를 사용하였다. 우리는 갈색 지방화 유도 물질 (cocktail)과 curcumin은 상승 작용에 의해 brite 표현형을 유도하였고 갈색 지방 특수 유전자인 Cidea, Fgf21, Tbx1, Tmem26 뿐만 아니라 PGC-1α, PRDM16, UCP1 단백질을 유도한다는 사실을 발견하였다. Tmem26과 Tbx1은 갈색 지방의 특이적인 마커이며 베이지 세포에서 두 마커는 매우 풍부하게 존재한다는 것이 입증 되었다. 본 연구 결과에서 curcumin이 mitochondrial biogenesis의 주 기능을 가진 PGC-1α의 증가뿐만 아니라 투과 전자 현미경을 통해 미토콘드리아 생합성을 증가 시킨다는 것을 증명했다. 또한 curcumin은 hormone-senitive lipase (HSL) 와 p-acyl-CoA carboxylase (p-ACC)의 단백질 수준을 증가시켜 지방 분해의 증가와 지방 형성의 억제하는 역할을 제안했다. Dorsomorphin은 PRDM16과 UCP1의 발현을 억제하고 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR)은 PRDM16과 UCP1 발현을 증가시키는 기초 하에 curcumin은 AMP 활성 단백질 효소를 유도하여 UCP1 및 갈색 지방 세포의 특이적 마커 단백질이 증가되었다. 따라서 이 연구에서 curcumin은 갈색 지방과 같은 표현형의 유도뿐만 아니라 지방 생성의 억제에서 이중 조절 역할을 하며 비만 치료에 좋은 영향을 미칠 수 있음을 제시한다.
잠재적인 갈색 지방화 효과를 가지고 있는 또 식이 요법 및 천연 물질을 찾는 중 limonene을 발견했고 이에 따른 분자적 메커니즘을 밝혀냈다. Limonene의 흰색 지방 세포에서 갈색 지방화 유도를 확인하기 위해 RT-PCR, 면역 블롯 분석 및 면역 형광 염색을 통해 갈색 지방 특이 적 유전자 및 단백질의 발현 수준을 분석하였다. Limonene은 증가된 미토콘드리아 생합성 및 함량과 면역 형광에서 높은 감도를 보였다. 또한 Limonene은 ACO, COX4, CPT1, CYT C, HSL, p-ACC, p-AMPK, 및 PLIN 단백질들의 수준을 높여 지방 분해 및 지질 대사에 큰 역할을 암시했다. Limonene으로부터 유도 된 갈색 지방화 작용 및 메커니즘을 밝히기 위해 우리는 3T3-L1 지방 세포에 β3-AR 제해제인 L-748,337 (10 μM)을 처리했다. Limonene은 β3-AR을 직접 활성화 시켰고, 결과적으로 갈색 지방 세포 특이적 마커인 PGC-1α, PRDM16 및 UCP1의 발현을 증가시켰다. β3-AR의 저해제인 L-748,337 처리군은 갈색 지방 세포 특이적 마커인 PRDM16과 UCP1의 발현이 감소하였다. 마찬가지로, limonene은 ERK를 활성화시켜 갈색 지방 세포 특이적 마커인 PGC1-1α 및 UCP1의 발현을 증가시켰고 ERK 저해제인 FR180204 처리에서는 PGC1-1α와 UCP1의 발현이 감소하였다. 그러나 JNK와 p38 MAPK와 같은 다른 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 경로에서는 limonene에 의한 갈색 지방화에 관련이 없었다.
또한 honokiol 물질이 백색 지방 세포의 갈색 지방화와 세포사멸 유도에 있어 이중적 역할을 하는지 조사하였다. 천연 화합물에 의한 지방 세포의 사멸은 비만을 치료하기 위한 새로운 전략으로 여겨진다. 흥미롭게도 본 연구 결과에서 honokiol은 3T3-L1 지방 세포에서 갈색 지방 세포와 같은 표현형의 증가와 세포 사멸에 의한 항비만 효과를 나타내었다. 또한 3T3-L1 및 HIB1B 지방 세포에서의 honokiol에 의한 세포 사멸 촉진 및 억제에 대한 조절을 관찰하였다. 이 연구에서 honokiol는 mRNA 수준과 단백질 수준 모두에서 PGC1-α, PRMD16 및 UCP1을 비롯한 주요 갈색 지방 마커의 발현을 상향 조절하는 사실을 입증했다. 또한, 실험 결과에서 honokiol 처리는 ERK의 활성화를 보여주며 ERK 저해제(FR180204) 처리군에서는 UCP1과 PGC1-α 발현이 감소되었다. 따라서 이 발현의 비교를 통해 honokiol의 ERK 활성화를 통해 3T3-L1 지방 세포에서 갈색 지방화 세포로 유도 한다는 가설을 검증 하였다.
마지막 연구에서는 nobiletin이 백색 지방 세포의 열 발생과 세포 내 스트레스를 개선하는 것을 중점으로 연구하였다. Nobiletin 처리는 Cd137, Cidea, Tbx1 및 Tmem26과 같은 갈색 지방 세포 특이적 유전자의 발현 수준을 급속히 상승시켰다. Nobiletin은 백색 지방 세포를 갈색 지방화 형성에 큰 역할을 하는 핵심 전사 인자인 C/EBPβ, PPARδ 및 PPARα의 발현을 증가시켰다. Nobiletin은 perilipin (PLIN)과 sirtuin 1 (SIRT1)의 발현을 자극하여 지질 대사를 증가시키는 것으로 보였다. 백색 지방 세포에서 PLIN의 발현은 갈색 지방과 같은 표현형을 유도하여 식이 요법으로도 비만을 예방할 수 있다. 또한, p-ACC 및 p-HSL 와 같은 지방 분해 단백질의 인산화뿐만 아니라 SREBP 및 FAS와 같은 지방 생성 단백질의 하향 조절에 관여한다. 베이지 지방 세포는 외부 자극의 강력한 규제에 의해 열 생성을 하는 특징을 가진다. 일반적인 온도조건이나 β3-AR 촉매제와 같은 외부자극 회수 시 베이지 지방 세포는 백색 지방 세포로 다시 역전된다. 즉, 백색 지방 세포의 갈색 지방화 과정을 역전 시키는 것이다. ATG5와 ATG12의 유도를 통해 자가포식(autophagy)이 유도되고 “베이지 지방 세포에서의 백색 지방 세포화"로 역방향 변환이 일어난다. 이 실험의 결과에서 nobiletin은 ATG5와 ATG12의 발현을 감소시키며 미도콘드리아 분해를 예방하고 갈색 지방 세포와 유사한 표현형을 유지할 수 있음을 시사한다. 그 외에도 nobiletin이 처리 된 3T3-L1 백색 지방 세포에서 JNK와 c-JUN의 발현이 감소 된 것을 확인하였다. 과도한 지방 형성은 JNK의 중재로 인슐린 저항성에 관련이 되어있다. 우리는 nobiletin과 JNK 억제제 (SP)를 사용하여 약리학적 억제를 추가로 확립하였고 또한 nobiletin은 미토콘드리아 내에 중요한 단백질 PGC-1α의 발현을 상승적으로 증가시켰다. 결론적으로 nobiletin은 갈색 지방 세포와 같은 표현형 유도와 JNK의 지방 세포 스트레스 개선 및 지방 대사 조절에 관여하는 것을 입증했다.
본 논문은 비만 및 비만 관련 대사 장애에 대한 약물 개발(nutraceuticals)에 중점을 두고 있다. 이를 위해 본 연구에서는 새로운 식이 및 약리학적 화합물을 통해 갈색 지방 세포 유사 표현형을 유도하고 그 작용 방식을 밝혀냈다. 따라서 본 연구는 지속적인 열 생성 방법을 추진함으로써 비만을 해결하기 위한 치료 방법을 제공 한다.
비만은 에너지 섭취량이 에너지 소비량을 초과할 때 주로 발생하며 지방을 과도하게 축적하는 특징을 가진다. 칼로리 섭취 제한은 비만에 대한 일차적인 방어 수단으로 간주되지만, 이 방법은 과잉 칼로리 섭취 시 갈색 지방 조직의 기능에 장애를 가진 사람들에게는 떨림 없는 열 생성을 통해 열에너지를 분산시키는 기능에 문제가 있어 큰 도움이 되지 않는다. 이와 관련하여 백색 지방 세포의 갈색 지방화 방법은 비만에 대해 획기적인 치료 방법으로 고려된다. 최근 성인 대상에서 갈색 지방 조직 (BAT)을 발견 한 후 비만 퇴치 전략으로 BAT의 활성화 및 백색 지방 조직 (WAT)에서의 갈색 지방화로 지방 세포 내의 에너지 소비를 촉진하여 지방 축적을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 의미에서 백색 지방 조직에서 갈색 지방화 유도는 비만과 관련된 합병증 치료를 위한 매력적인 방법이다.
갈색 및 백색 지방 세포는 각각 다른 계통에서 기원하며 서로 다른 전구 세포에서 시작되고 있지만 상호 전환이 가능하다. 백색 지방 세포 내 UCP1의 발현은 일부 외부 자극에 의해 백색 지방 저장고에 열 발생 능력을 가지게 되며 표현형으로는 베이지색 또는 brite (흰색 내 갈색)로 특징지어진다. 이 UCP1에 의한 열 생성은 적응성 열 발산이라 하며 UCP1은 전자 수송 체인을 에너지 생산에서 분리하여 열에너지를 방출한다. 추위에 노출되거나 약리학적 β3 -아드레날린 수용체 활성화에 의해 지방 전구 세포에서 WAT를 재구성하여 WAT 내에 brite 지방세포 발현하는 중요한 요소이다. 백색 지방 세포에서 PGC-1α 및 UCP1 같은 갈색 지방 세포에 대한 이소성 단백질 발현은 BAT와 같은 특이적 반응을 유도한다. 최근 연구에서는 갈색 지방 발현 촉진제의 동정을 목표로 한 PRDM16과 같은 새로운 brite 특이 마커들을 확인했다.
최근에는 WAT의 갈색 지방화에 기여하는 약리학적 및 식이 요법에 대한 이해가 이루어졌으며 capsaicin, berberine, orexin 및 irisin을 포함한 많은 물질이 포유동물의 에너지 소비를 증가시키고 지방 축적을 감소시키는 방법으로 제안되었다. 따라서 본 연구에서는 백색 지방 세포에서 갈색 지방화를 유도하기 위해 curcumin, limonene, honokiol 및 nobiletin과 같은 다양한 새로운 식이 요법 및 약리학적 약물을 성공적으로 스크리닝 했다.
본 연구에서 실시한 첫 번째 연구는 광범위하게 연구된 천연 화합물인 curcumin의 갈색 지방화 유도 효과를 규명하였다. 배양된 백색 지방 세포에서 brite 표현형 유도에 있어 curcumin의 효과를 조사하기 위해 백색 지방세포 모델로 3T3-L1 세포와 쥐의 사타구니 백색 지방 조직(WAT)으로 부터 분리 된 백색 지방 세포 (primary)를 사용하였다. 우리는 갈색 지방화 유도 물질 (cocktail)과 curcumin은 상승 작용에 의해 brite 표현형을 유도하였고 갈색 지방 특수 유전자인 Cidea, Fgf21, Tbx1, Tmem26 뿐만 아니라 PGC-1α, PRDM16, UCP1 단백질을 유도한다는 사실을 발견하였다. Tmem26과 Tbx1은 갈색 지방의 특이적인 마커이며 베이지 세포에서 두 마커는 매우 풍부하게 존재한다는 것이 입증 되었다. 본 연구 결과에서 curcumin이 mitochondrial biogenesis의 주 기능을 가진 PGC-1α의 증가뿐만 아니라 투과 전자 현미경을 통해 미토콘드리아 생합성을 증가 시킨다는 것을 증명했다. 또한 curcumin은 hormone-senitive lipase (HSL) 와 p-acyl-CoA carboxylase (p-ACC)의 단백질 수준을 증가시켜 지방 분해의 증가와 지방 형성의 억제하는 역할을 제안했다. Dorsomorphin은 PRDM16과 UCP1의 발현을 억제하고 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR)은 PRDM16과 UCP1 발현을 증가시키는 기초 하에 curcumin은 AMP 활성 단백질 효소를 유도하여 UCP1 및 갈색 지방 세포의 특이적 마커 단백질이 증가되었다. 따라서 이 연구에서 curcumin은 갈색 지방과 같은 표현형의 유도뿐만 아니라 지방 생성의 억제에서 이중 조절 역할을 하며 비만 치료에 좋은 영향을 미칠 수 있음을 제시한다.
잠재적인 갈색 지방화 효과를 가지고 있는 또 식이 요법 및 천연 물질을 찾는 중 limonene을 발견했고 이에 따른 분자적 메커니즘을 밝혀냈다. Limonene의 흰색 지방 세포에서 갈색 지방화 유도를 확인하기 위해 RT-PCR, 면역 블롯 분석 및 면역 형광 염색을 통해 갈색 지방 특이 적 유전자 및 단백질의 발현 수준을 분석하였다. Limonene은 증가된 미토콘드리아 생합성 및 함량과 면역 형광에서 높은 감도를 보였다. 또한 Limonene은 ACO, COX4, CPT1, CYT C, HSL, p-ACC, p-AMPK, 및 PLIN 단백질들의 수준을 높여 지방 분해 및 지질 대사에 큰 역할을 암시했다. Limonene으로부터 유도 된 갈색 지방화 작용 및 메커니즘을 밝히기 위해 우리는 3T3-L1 지방 세포에 β3-AR 제해제인 L-748,337 (10 μM)을 처리했다. Limonene은 β3-AR을 직접 활성화 시켰고, 결과적으로 갈색 지방 세포 특이적 마커인 PGC-1α, PRDM16 및 UCP1의 발현을 증가시켰다. β3-AR의 저해제인 L-748,337 처리군은 갈색 지방 세포 특이적 마커인 PRDM16과 UCP1의 발현이 감소하였다. 마찬가지로, limonene은 ERK를 활성화시켜 갈색 지방 세포 특이적 마커인 PGC1-1α 및 UCP1의 발현을 증가시켰고 ERK 저해제인 FR180204 처리에서는 PGC1-1α와 UCP1의 발현이 감소하였다. 그러나 JNK와 p38 MAPK와 같은 다른 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 경로에서는 limonene에 의한 갈색 지방화에 관련이 없었다.
또한 honokiol 물질이 백색 지방 세포의 갈색 지방화와 세포사멸 유도에 있어 이중적 역할을 하는지 조사하였다. 천연 화합물에 의한 지방 세포의 사멸은 비만을 치료하기 위한 새로운 전략으로 여겨진다. 흥미롭게도 본 연구 결과에서 honokiol은 3T3-L1 지방 세포에서 갈색 지방 세포와 같은 표현형의 증가와 세포 사멸에 의한 항비만 효과를 나타내었다. 또한 3T3-L1 및 HIB1B 지방 세포에서의 honokiol에 의한 세포 사멸 촉진 및 억제에 대한 조절을 관찰하였다. 이 연구에서 honokiol는 mRNA 수준과 단백질 수준 모두에서 PGC1-α, PRMD16 및 UCP1을 비롯한 주요 갈색 지방 마커의 발현을 상향 조절하는 사실을 입증했다. 또한, 실험 결과에서 honokiol 처리는 ERK의 활성화를 보여주며 ERK 저해제(FR180204) 처리군에서는 UCP1과 PGC1-α 발현이 감소되었다. 따라서 이 발현의 비교를 통해 honokiol의 ERK 활성화를 통해 3T3-L1 지방 세포에서 갈색 지방화 세포로 유도 한다는 가설을 검증 하였다.
마지막 연구에서는 nobiletin이 백색 지방 세포의 열 발생과 세포 내 스트레스를 개선하는 것을 중점으로 연구하였다. Nobiletin 처리는 Cd137, Cidea, Tbx1 및 Tmem26과 같은 갈색 지방 세포 특이적 유전자의 발현 수준을 급속히 상승시켰다. Nobiletin은 백색 지방 세포를 갈색 지방화 형성에 큰 역할을 하는 핵심 전사 인자인 C/EBPβ, PPARδ 및 PPARα의 발현을 증가시켰다. Nobiletin은 perilipin (PLIN)과 sirtuin 1 (SIRT1)의 발현을 자극하여 지질 대사를 증가시키는 것으로 보였다. 백색 지방 세포에서 PLIN의 발현은 갈색 지방과 같은 표현형을 유도하여 식이 요법으로도 비만을 예방할 수 있다. 또한, p-ACC 및 p-HSL 와 같은 지방 분해 단백질의 인산화뿐만 아니라 SREBP 및 FAS와 같은 지방 생성 단백질의 하향 조절에 관여한다. 베이지 지방 세포는 외부 자극의 강력한 규제에 의해 열 생성을 하는 특징을 가진다. 일반적인 온도조건이나 β3-AR 촉매제와 같은 외부자극 회수 시 베이지 지방 세포는 백색 지방 세포로 다시 역전된다. 즉, 백색 지방 세포의 갈색 지방화 과정을 역전 시키는 것이다. ATG5와 ATG12의 유도를 통해 자가포식(autophagy)이 유도되고 “베이지 지방 세포에서의 백색 지방 세포화"로 역방향 변환이 일어난다. 이 실험의 결과에서 nobiletin은 ATG5와 ATG12의 발현을 감소시키며 미도콘드리아 분해를 예방하고 갈색 지방 세포와 유사한 표현형을 유지할 수 있음을 시사한다. 그 외에도 nobiletin이 처리 된 3T3-L1 백색 지방 세포에서 JNK와 c-JUN의 발현이 감소 된 것을 확인하였다. 과도한 지방 형성은 JNK의 중재로 인슐린 저항성에 관련이 되어있다. 우리는 nobiletin과 JNK 억제제 (SP)를 사용하여 약리학적 억제를 추가로 확립하였고 또한 nobiletin은 미토콘드리아 내에 중요한 단백질 PGC-1α의 발현을 상승적으로 증가시켰다. 결론적으로 nobiletin은 갈색 지방 세포와 같은 표현형 유도와 JNK의 지방 세포 스트레스 개선 및 지방 대사 조절에 관여하는 것을 입증했다.
본 논문은 비만 및 비만 관련 대사 장애에 대한 약물 개발(nutraceuticals)에 중점을 두고 있다. 이를 위해 본 연구에서는 새로운 식이 및 약리학적 화합물을 통해 갈색 지방 세포 유사 표현형을 유도하고 그 작용 방식을 밝혀냈다. 따라서 본 연구는 지속적인 열 생성 방법을 추진함으로써 비만을 해결하기 위한 치료 방법을 제공 한다.
Obesity develops when energy intake exceeds energy expenditure and is mainly characterized by excessive deposition of adipose tissues. Restriction of caloric intake is considered to be first line defense against obesity, but this strategy does not help people with dysfunctional development of brown ...
Obesity develops when energy intake exceeds energy expenditure and is mainly characterized by excessive deposition of adipose tissues. Restriction of caloric intake is considered to be first line defense against obesity, but this strategy does not help people with dysfunctional development of brown fat tissue, which dissipates surplus calorie intake into heat energy via a process known as non-shivering thermogenesis. In this regard, browning of white adipocytes is considered as an alternative strategy against diet-induced obesity. After the recent finding of brown adipose tissue (BAT) in adult human subjects, strategies for combating obesity have shifted from preventing fat accumulation to promoting energy expenditure by activation of BAT and browning of white adipose tissue (WAT). In this sense, induction of white fat browning represents an attractive potential strategy for the treatment of obesity and related complications. Although brown and white adipocytes originate from different cell lineages and each lineage has a different progenitor, they are readily interconvertable to each other. Expression of UCP1 in multilocular cells with thermogenic capability to develop in white fat depots with some external stimuli is being characterized as beige or brite (brown in white). This UCP1-driven heat dissipation is known as adaptive thermogenesis. UCP1 uncouples the electron transport chain from energy production, resulting in release of heat energy. Cold exposure and pharmacological activation of β3-adrenergic receptors are key factors in the appearance of brite adipocytes in WAT via promotion of WAT remodeling by adipocyte progenitors. Ectopic expression of hallmark proteins for brown adipocytes such as UCP1 and PGC-1α in white adipocytes induces acquisition of BAT features. More recent studies identified novel brite-specific markers such as PRDM16 that have been targeted for identification of brown fat-stimulating agents. Recent advances have been made in the understanding of pharmacological and dietary agents that contribute to browning of WAT, and a number of dietary compounds have been proposed as tools for increasing energy expenditure and decreasing fat accumulation in mammals, including capsaicin, berberine, orexin and irisin. To this end, I have successfully screened various novel dietary and pharmacological agents such as curcumin, limonene, honokiol and nobiletin for induction of browning in white adipocytes. The first study I conducted was to study the browning effect of widely studied natural medicinal compound, curcumin. In order to investigate the effect of curcumin in induction of brite phenotype in cultured white adipocytes, we used two different white adipocyte cell models, 3T3-L1 and primary white adipocytes isolated from inguinal WAT of rats. We successfully demonstrated that curcumin along with a browning cocktail could synergistically induce the brite phenotype and drive the BAT thermogenic program through significant elevation of brown fat-specific genes such as Fgf21, Cidea, Tmem26 and Tbx1 as well as proteins such as UCP1, PGC-1α and PRDM16. It was demonstrated that Tmem26 and Tbx1 are brown fat-specific markers, and brite cells are highly enriched in these two markers. Our data further demonstrated that curcumin increased mitochondrial biogenesis, as evidenced by transmission electronic microscopic detection as well as elevated expression of PGC-1α, a master regulator of mitochondrial biogenesis and function. Curcumin also increased protein levels of hormone-sensitive lipase and p-acyl-CoA carboxylase, suggesting its possible role in augmentation of lipolysis and suppression of lipogenesis. Increased expression of UCP1 and other brown adipocyte-specific markers was possibly mediated by curcumin-induced activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) based on the fact that inhibition of AMPK by dorsomorphin abolished expression of PRDM16 and UCP1 while the activator 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide elevated expression of these brown marker proteins. Our findings thus suggest that curcumin plays a dual modulatory role in inhibition of adipogenesis as well as induction of the brown fat-like phenotype and thus may have potential therapeutic implications for treatment of obesity. In search of another novel phytochemical and dietary agent having potential browning effect, we have found the limonene and tried to elucidate the molecular mechanism behind its mode of action. Limonene-induced browning in white adipocytes was investigated by determining expression levels of brown fat-specific genes and proteins by real-time RT-PCR, immunoblot analysis, and immunocytochemical staining. Limonene enhanced mitochondrial biogenesis, as evidenced by increased mitochondrial content and immunofluorescent intensity. Limonene also significantly elevated protein levels of HSL, PLIN, p-AMPK, p-ACC, ACO, COX4, CPT1, and CYT C, suggesting its possible role in enhancement of lipolysis and lipid catabolism. To determine the possible molecular mechanism behind limonene-induced browning and elucidate its mode of action, we treated 3T3-L1 adipocytes with a β3-AR antagonist, L-748,337 (10 μM). Limonene directly activated β3-AR and consequently increased expression of brown adipocyte specific markers, including PRDM16, PGC-1α, and UCP1. Elevated expression of key brown adipocyte-specific markers, PRDM16 and UCP1, was eliminated by treatment with β3-AR antagonist, L-748,337. Similarly, limonene activated ERK and up-regulation of key brown adipocyte specific markers, PGC-1α and UCP1, were eliminated by treatment with ERK antagonist, FR180204. However, other mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways such as JNK and p38 MAPK were not associated with limonene-induced browning effects. In addition, our study has established a dual modulatory role of honokiol in inducing browning and apoptosis of adipocytes. Targeting of adipocyte apoptosis by natural compounds is considered to be a novel strategy for obesity treatment. Intriguingly, our results demonstrate that honokiol exhibits its potential anti-obesity effects by both stimulation of apoptosis and augmentation of the brown adipocyte-like phenotype in 3T3-L1 adipocytes. We observed differential regulation of apoptosis by honokiol in promotion and inhibition of apoptosis in 3T3-L1 and HIB1B adipocytes, respectively. Our study profoundly demonstrates that honokiol up-regulates the expression of key brown fat markers, including PGC-1α, PRDM16, and UCP1, at both the mRNA and protein levels. Moreover, our results show activation of ERK upon honokiol treatment which was later abolished by the p-ERK antagonist (FR180204), followed by diminished expression of UCP1 and PGC-1α. Thus, these expression patterns validate our hypothesis and suggest induction of the brown adipocyte-like phenotype in 3T3-L1 adipocytes through ERK activation. The last part of our study was focused on sustained nobiletin-induced thermogenic program and its role in ameliorating adipogenic stress in white adipocytes. Nobiletin treatment rapidly elevated the expression levels of beige-specific genes such as Cd137, Cidea, Tbx1, and Tmem26. Further, nobiletin enhanced expression of the key transcription factors C/EBPβ, PPARδ, and PPARα, which are responsible for remodeling of white adipocytes. Nobiletin appears to promote lipid catabolism by stimulating expression of perilipin (PLIN) and Sirtuin 1(SIRT1). Overexpression of PLIN in white adipocytes prevents diet-induced obesity by inducing the brown fat-like phenotype. Moreover, we addressed the enhanced phosphorylation of lipolytic proteins such as p-HSL and p-ACC as well as the down-regulation of lipogenic proteins such as SREBP and FAS. Regulation of the robust thermogenic program by external stimuli is one of the hallmark features of beige adipocytes. However, under thermo-neutral conditions or upon withdrawal of external stimuli such as β3-AR agonists, beige adipocytes reverse the browning process, which is known as whitening of adipocytes. This reverse transition from “browning to whitening” is marked by autophagy-induced mitochondrial degradation through induction of ATG5/ATG12. Our results show decreased expression of ATG5/ATG12, suggesting that nobiletin may sustain the brown adipocyte-like phenotype via prevention of mitochondrial degradation. Apart from it we have found the reduced expression of JNK and c-JUN in nobiletin-treated 3T3-L1 adipocytes. Of note, excessive adipogenesis is linked to JNK-mediated insulin resistance. We further established the combined pharmacological inhibition of JNK using its inhibitor (SP), and nobiletin synergistically enhanced expression of the key mitochondrial protein PGC-1α. In conclusion, our results demonstrate that nobiletin regulates the function of adipocytes by inducing the brown adipocyte-like phenotype combined with amelioration of JNK-mediated adipogenic stress. This thesis is focused on a drug development (nutraceuticals) against obesity and its associated metabolic disorders. To this end, we identified novel dietary and pharmacological compounds for induction of brown adipocyte-like phenotype and elucidated their mode of action. Thus our study may offer a non-toxic therapeutic opportunity to combat obesity by driving the sustained thermogenic program.
Obesity develops when energy intake exceeds energy expenditure and is mainly characterized by excessive deposition of adipose tissues. Restriction of caloric intake is considered to be first line defense against obesity, but this strategy does not help people with dysfunctional development of brown fat tissue, which dissipates surplus calorie intake into heat energy via a process known as non-shivering thermogenesis. In this regard, browning of white adipocytes is considered as an alternative strategy against diet-induced obesity. After the recent finding of brown adipose tissue (BAT) in adult human subjects, strategies for combating obesity have shifted from preventing fat accumulation to promoting energy expenditure by activation of BAT and browning of white adipose tissue (WAT). In this sense, induction of white fat browning represents an attractive potential strategy for the treatment of obesity and related complications. Although brown and white adipocytes originate from different cell lineages and each lineage has a different progenitor, they are readily interconvertable to each other. Expression of UCP1 in multilocular cells with thermogenic capability to develop in white fat depots with some external stimuli is being characterized as beige or brite (brown in white). This UCP1-driven heat dissipation is known as adaptive thermogenesis. UCP1 uncouples the electron transport chain from energy production, resulting in release of heat energy. Cold exposure and pharmacological activation of β3-adrenergic receptors are key factors in the appearance of brite adipocytes in WAT via promotion of WAT remodeling by adipocyte progenitors. Ectopic expression of hallmark proteins for brown adipocytes such as UCP1 and PGC-1α in white adipocytes induces acquisition of BAT features. More recent studies identified novel brite-specific markers such as PRDM16 that have been targeted for identification of brown fat-stimulating agents. Recent advances have been made in the understanding of pharmacological and dietary agents that contribute to browning of WAT, and a number of dietary compounds have been proposed as tools for increasing energy expenditure and decreasing fat accumulation in mammals, including capsaicin, berberine, orexin and irisin. To this end, I have successfully screened various novel dietary and pharmacological agents such as curcumin, limonene, honokiol and nobiletin for induction of browning in white adipocytes. The first study I conducted was to study the browning effect of widely studied natural medicinal compound, curcumin. In order to investigate the effect of curcumin in induction of brite phenotype in cultured white adipocytes, we used two different white adipocyte cell models, 3T3-L1 and primary white adipocytes isolated from inguinal WAT of rats. We successfully demonstrated that curcumin along with a browning cocktail could synergistically induce the brite phenotype and drive the BAT thermogenic program through significant elevation of brown fat-specific genes such as Fgf21, Cidea, Tmem26 and Tbx1 as well as proteins such as UCP1, PGC-1α and PRDM16. It was demonstrated that Tmem26 and Tbx1 are brown fat-specific markers, and brite cells are highly enriched in these two markers. Our data further demonstrated that curcumin increased mitochondrial biogenesis, as evidenced by transmission electronic microscopic detection as well as elevated expression of PGC-1α, a master regulator of mitochondrial biogenesis and function. Curcumin also increased protein levels of hormone-sensitive lipase and p-acyl-CoA carboxylase, suggesting its possible role in augmentation of lipolysis and suppression of lipogenesis. Increased expression of UCP1 and other brown adipocyte-specific markers was possibly mediated by curcumin-induced activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) based on the fact that inhibition of AMPK by dorsomorphin abolished expression of PRDM16 and UCP1 while the activator 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide elevated expression of these brown marker proteins. Our findings thus suggest that curcumin plays a dual modulatory role in inhibition of adipogenesis as well as induction of the brown fat-like phenotype and thus may have potential therapeutic implications for treatment of obesity. In search of another novel phytochemical and dietary agent having potential browning effect, we have found the limonene and tried to elucidate the molecular mechanism behind its mode of action. Limonene-induced browning in white adipocytes was investigated by determining expression levels of brown fat-specific genes and proteins by real-time RT-PCR, immunoblot analysis, and immunocytochemical staining. Limonene enhanced mitochondrial biogenesis, as evidenced by increased mitochondrial content and immunofluorescent intensity. Limonene also significantly elevated protein levels of HSL, PLIN, p-AMPK, p-ACC, ACO, COX4, CPT1, and CYT C, suggesting its possible role in enhancement of lipolysis and lipid catabolism. To determine the possible molecular mechanism behind limonene-induced browning and elucidate its mode of action, we treated 3T3-L1 adipocytes with a β3-AR antagonist, L-748,337 (10 μM). Limonene directly activated β3-AR and consequently increased expression of brown adipocyte specific markers, including PRDM16, PGC-1α, and UCP1. Elevated expression of key brown adipocyte-specific markers, PRDM16 and UCP1, was eliminated by treatment with β3-AR antagonist, L-748,337. Similarly, limonene activated ERK and up-regulation of key brown adipocyte specific markers, PGC-1α and UCP1, were eliminated by treatment with ERK antagonist, FR180204. However, other mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways such as JNK and p38 MAPK were not associated with limonene-induced browning effects. In addition, our study has established a dual modulatory role of honokiol in inducing browning and apoptosis of adipocytes. Targeting of adipocyte apoptosis by natural compounds is considered to be a novel strategy for obesity treatment. Intriguingly, our results demonstrate that honokiol exhibits its potential anti-obesity effects by both stimulation of apoptosis and augmentation of the brown adipocyte-like phenotype in 3T3-L1 adipocytes. We observed differential regulation of apoptosis by honokiol in promotion and inhibition of apoptosis in 3T3-L1 and HIB1B adipocytes, respectively. Our study profoundly demonstrates that honokiol up-regulates the expression of key brown fat markers, including PGC-1α, PRDM16, and UCP1, at both the mRNA and protein levels. Moreover, our results show activation of ERK upon honokiol treatment which was later abolished by the p-ERK antagonist (FR180204), followed by diminished expression of UCP1 and PGC-1α. Thus, these expression patterns validate our hypothesis and suggest induction of the brown adipocyte-like phenotype in 3T3-L1 adipocytes through ERK activation. The last part of our study was focused on sustained nobiletin-induced thermogenic program and its role in ameliorating adipogenic stress in white adipocytes. Nobiletin treatment rapidly elevated the expression levels of beige-specific genes such as Cd137, Cidea, Tbx1, and Tmem26. Further, nobiletin enhanced expression of the key transcription factors C/EBPβ, PPARδ, and PPARα, which are responsible for remodeling of white adipocytes. Nobiletin appears to promote lipid catabolism by stimulating expression of perilipin (PLIN) and Sirtuin 1(SIRT1). Overexpression of PLIN in white adipocytes prevents diet-induced obesity by inducing the brown fat-like phenotype. Moreover, we addressed the enhanced phosphorylation of lipolytic proteins such as p-HSL and p-ACC as well as the down-regulation of lipogenic proteins such as SREBP and FAS. Regulation of the robust thermogenic program by external stimuli is one of the hallmark features of beige adipocytes. However, under thermo-neutral conditions or upon withdrawal of external stimuli such as β3-AR agonists, beige adipocytes reverse the browning process, which is known as whitening of adipocytes. This reverse transition from “browning to whitening” is marked by autophagy-induced mitochondrial degradation through induction of ATG5/ATG12. Our results show decreased expression of ATG5/ATG12, suggesting that nobiletin may sustain the brown adipocyte-like phenotype via prevention of mitochondrial degradation. Apart from it we have found the reduced expression of JNK and c-JUN in nobiletin-treated 3T3-L1 adipocytes. Of note, excessive adipogenesis is linked to JNK-mediated insulin resistance. We further established the combined pharmacological inhibition of JNK using its inhibitor (SP), and nobiletin synergistically enhanced expression of the key mitochondrial protein PGC-1α. In conclusion, our results demonstrate that nobiletin regulates the function of adipocytes by inducing the brown adipocyte-like phenotype combined with amelioration of JNK-mediated adipogenic stress. This thesis is focused on a drug development (nutraceuticals) against obesity and its associated metabolic disorders. To this end, we identified novel dietary and pharmacological compounds for induction of brown adipocyte-like phenotype and elucidated their mode of action. Thus our study may offer a non-toxic therapeutic opportunity to combat obesity by driving the sustained thermogenic program.
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