[학위논문]동물세포주에서 NGS 기반 DNA 바이러스 검출 시험법 확립을 위한 시료 전처리 방법 개발 Development of Sample Pre-treatment Method for NGS-Based DNA Virus Detection from Animal Cells원문보기
바이러스 백신, 재조합 단백질 치료제, 항체 치료제와 같은 포유류 세포 배양(MCC)유래 바이오의약품 제조 과정은 바이러스 오염의 위험이 있다. 바이러스 오염은 오염된 cell 라인, 오염된 원료 또는 생산 및 정제 과정의 GMP 시설 오류, 고장으로부터 발생할 수 있다. 안전을 보장하기 위해, 정부 규제는 제조업체가 MCC유래 바이오 의약품은 외래 물질의 존재하지 않는다는 것을 입증하도록 요구한다. 이미 확립된 In vivo 및 In vitro 바이러스 검출시험, ...
바이러스 백신, 재조합 단백질 치료제, 항체 치료제와 같은 포유류 세포 배양(MCC)유래 바이오의약품 제조 과정은 바이러스 오염의 위험이 있다. 바이러스 오염은 오염된 cell 라인, 오염된 원료 또는 생산 및 정제 과정의 GMP 시설 오류, 고장으로부터 발생할 수 있다. 안전을 보장하기 위해, 정부 규제는 제조업체가 MCC유래 바이오 의약품은 외래 물질의 존재하지 않는다는 것을 입증하도록 요구한다. 이미 확립된 In vivo 및 In vitro 바이러스 검출시험, 레트로 바이러스 검출 시험, 전자 현미경 및 PCR 기반 시험법은 외래성 바이러스 같은 오염물질을 검출하기 위해 개발되었다. 그러나 이러한 방법은 검출 범위를 벗어난 바이러스뿐 아니라 매우 낮은 농도의 바이러스 오염을 감지하거나 오염물질의 종류를 식별하는 데 충분하지 않을 수 있다. NGS는 염기서열이 알려진 모든 바이러스를 검출 및 동정할 수 있는 방법이지만, 숙주 세포주의 유전체가 바이러스 유전체에 비해 훨씬 방대하기 때문에 적은 양으로 오염된 바이러스를 검출하기 위해 read의 개수를 가능한 많게 해야 하는 단점이 있다. 이를 극복하기 위해서는 숙주유래 유전체를 최소화하여 바이러스 유래 유전체를 농화하는 방법의 적용이 필요하다. 본 연구에서는 냉해동과 Bead beathing 방법을 이용한 세포주 파쇄와 DNaseⅠ 처리를 통한 숙주유래 DNA 저감 방법을 최적화하였다. 또한 Vero 세포주에 BHV를 농도가 다르게 spiking을 한 후 total DNA를 추출하고, NGS를 활용한 sequencing을 한 후 생물정보학 방법으로 바이러스를 분석하였다. 102에서 106 TCID50/ml로 spiking한 시료에서 바이러스 수의 증가에 따라 바이러스 reads 수의 증가가 일정하게 증가하는 것으로 판단되어 102 이상의 BHV 바이러스 존재 시 NGS 방법으로 검출 가능할 것으로 판단된다.
바이러스 백신, 재조합 단백질 치료제, 항체 치료제와 같은 포유류 세포 배양(MCC)유래 바이오의약품 제조 과정은 바이러스 오염의 위험이 있다. 바이러스 오염은 오염된 cell 라인, 오염된 원료 또는 생산 및 정제 과정의 GMP 시설 오류, 고장으로부터 발생할 수 있다. 안전을 보장하기 위해, 정부 규제는 제조업체가 MCC유래 바이오 의약품은 외래 물질의 존재하지 않는다는 것을 입증하도록 요구한다. 이미 확립된 In vivo 및 In vitro 바이러스 검출시험, 레트로 바이러스 검출 시험, 전자 현미경 및 PCR 기반 시험법은 외래성 바이러스 같은 오염물질을 검출하기 위해 개발되었다. 그러나 이러한 방법은 검출 범위를 벗어난 바이러스뿐 아니라 매우 낮은 농도의 바이러스 오염을 감지하거나 오염물질의 종류를 식별하는 데 충분하지 않을 수 있다. NGS는 염기서열이 알려진 모든 바이러스를 검출 및 동정할 수 있는 방법이지만, 숙주 세포주의 유전체가 바이러스 유전체에 비해 훨씬 방대하기 때문에 적은 양으로 오염된 바이러스를 검출하기 위해 read의 개수를 가능한 많게 해야 하는 단점이 있다. 이를 극복하기 위해서는 숙주유래 유전체를 최소화하여 바이러스 유래 유전체를 농화하는 방법의 적용이 필요하다. 본 연구에서는 냉해동과 Bead beathing 방법을 이용한 세포주 파쇄와 DNaseⅠ 처리를 통한 숙주유래 DNA 저감 방법을 최적화하였다. 또한 Vero 세포주에 BHV를 농도가 다르게 spiking을 한 후 total DNA를 추출하고, NGS를 활용한 sequencing을 한 후 생물정보학 방법으로 바이러스를 분석하였다. 102에서 106 TCID50/ml로 spiking한 시료에서 바이러스 수의 증가에 따라 바이러스 reads 수의 증가가 일정하게 증가하는 것으로 판단되어 102 이상의 BHV 바이러스 존재 시 NGS 방법으로 검출 가능할 것으로 판단된다.
Manufacturing processes for the mammalian cell cultures (MCC)-derived biopharmaceuticals such as virus vaccine, recombinant protein therapeutics, and antibody therapeutics have the risk of viral contamination. Viral contamination can originate from contaminated cell lines, contaminated raw materials...
Manufacturing processes for the mammalian cell cultures (MCC)-derived biopharmaceuticals such as virus vaccine, recombinant protein therapeutics, and antibody therapeutics have the risk of viral contamination. Viral contamination can originate from contaminated cell lines, contaminated raw materials, or from a GMP breakdown in the production and purification process. To ensure safety, government regulations require manufacturers to demonstrate that MCC-derived biopharmaceuticals are free of adventitious agents. Conventional virus testing methods such as In vivo and In vitro virus tests, retrovirus specific tests, electron microscopic evaluation, and PCR-based tests have been developed to detect contaminants of pre-established interest. However, these methods may not be sufficient to detect very low levels of viral contamination as well as viruses outside the scope of detection assays, or to identify the species of the contaminant. In this study, we developed NGS-based virus detection method for adventitious virus contamination testing. Sample pre-treatment methods were established to minimize mammalian cell-derived DNA from the test articles. After spiking BHV at different concentrations in Vero cell lines, total DNA was extracted, sequencing was performed using NGS, and the virus was analyzed by bioinformatics. In the samples spiked from 102 to 106 TCID50/ml, the number of virus reads increased consistently with the number of viruses. From this result, it may be concluded that BHV can be detected by the NGS method, if there are more than 102 BHV in test article.
Manufacturing processes for the mammalian cell cultures (MCC)-derived biopharmaceuticals such as virus vaccine, recombinant protein therapeutics, and antibody therapeutics have the risk of viral contamination. Viral contamination can originate from contaminated cell lines, contaminated raw materials, or from a GMP breakdown in the production and purification process. To ensure safety, government regulations require manufacturers to demonstrate that MCC-derived biopharmaceuticals are free of adventitious agents. Conventional virus testing methods such as In vivo and In vitro virus tests, retrovirus specific tests, electron microscopic evaluation, and PCR-based tests have been developed to detect contaminants of pre-established interest. However, these methods may not be sufficient to detect very low levels of viral contamination as well as viruses outside the scope of detection assays, or to identify the species of the contaminant. In this study, we developed NGS-based virus detection method for adventitious virus contamination testing. Sample pre-treatment methods were established to minimize mammalian cell-derived DNA from the test articles. After spiking BHV at different concentrations in Vero cell lines, total DNA was extracted, sequencing was performed using NGS, and the virus was analyzed by bioinformatics. In the samples spiked from 102 to 106 TCID50/ml, the number of virus reads increased consistently with the number of viruses. From this result, it may be concluded that BHV can be detected by the NGS method, if there are more than 102 BHV in test article.
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