Candida antarctica lipase B의 but-3-yn-2-ol에 대한 입체선택성 향상과 반응성 전환에 관한 연구 Enhancing enantioselectivity toward but-3-yn-2-ol and altering the reaction specificity of Candida antarctica lipase B원문보기
환경친화적인 합성방법에 대한 관심이 높아지면서 효소를 이용한 화학 반응 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 효소는 일반적으로 온화한 조건에서 사용되며 반응 부산물이 거의 없는 등의 장점이 있다. 동시에 뛰어난 위치 및 입체 선택적 화학 반응을 촉진하는 유용한 생체 촉매이다. 이 중 Candida antarctica lipase B (CAL-B)는 열적 안정성과 내화학성이 우수한 효소로 알려져 있으며, 이러한 특징 때문에 효소 활용 화학 반응에서 연구자들이 널리 이용하는 효소이다. 본 연구에서는 이러한 CAL-B를 활용하여 작은 ...
환경친화적인 합성방법에 대한 관심이 높아지면서 효소를 이용한 화학 반응 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 효소는 일반적으로 온화한 조건에서 사용되며 반응 부산물이 거의 없는 등의 장점이 있다. 동시에 뛰어난 위치 및 입체 선택적 화학 반응을 촉진하는 유용한 생체 촉매이다. 이 중 Candida antarctica lipase B (CAL-B)는 열적 안정성과 내화학성이 우수한 효소로 알려져 있으며, 이러한 특징 때문에 효소 활용 화학 반응에서 연구자들이 널리 이용하는 효소이다. 본 연구에서는 이러한 CAL-B를 활용하여 작은 치환기를 갖는 이차 알콜에 대한 입체 선택성이 향상된 효소 변이체 생성을 수행하였고, 에폭시화 반응을 수행할 수 있는 효소 변이체 개발 연구를 수행하였다. 먼저, CAL-B의 입체 선택성 향상을 위해, 기존 연구에서 확인된 높은 입체 선택성을 지닌 CAL-B의 상동체 효소인 Pseudozyma brasiliensis GHG 001(PBL)과 CAL-B 사이의 서열 비교분석으로부터 기질 치환체의 중간크기 결합 자리(medium binding pocket)의 아미노산 서열의 차이를 확인하였다. 그리고 CAL-B의 중간크기 결합 자리(medium binding pocket) 서열 대신 PBL의 서열을 도입하거나 단일자리 혹은 이중자리 치환을 수행하여 변이체들을 생성하였다. 이를 통해 본 연구에서는 CAL-B의 S47N 변이체에서 but-3-yn-2-ol에 대한 CAL-B의 입체 선택성을 50배까지 높였다(E > 200). 이러한 반응성 변화는 효소의 비활성도(specific activity)를 측정함으로써 기질의 느린 거울상 이성질체에 대한 반응성이 감소하면서 나타난 것임을 확인하였다. 두 번째로, 본 연구에서는 기존 효소의 반응성을 변화시켜 새로운 반응성을 갖도록 시도하였다. 즉, 가수분해반응을 수행하는 CAL-B에 과산화수소수를 활용한 에폭시화 반응성을 도입하는 연구를 수행하였다. CAL-B는 물 대신 과산화수소수를 기질로 활용하여 과가수분해반응(perhydrolysis)을 수행할 수 있음이 알려져 있다. 그렇지만 CAL-B에 의한 과산화산(peracid) 생성 후에 이어지는 에폭시화 반응 등의 산화 반응은 효소 밖에서 진행되므로, 최종 산물의 입체 선택성은 기대할 수 없다. 따라서 만약 CAL-B에 의해 생성되는 과산화산을 효소 내부에 고정한다면, 연속적으로 일어나는 산화 반응의 입체 선택적 진행을 기대할 수 있을 것으로 고려된다. 이러한 가정하에 먼저 CAL-B 촉매 삼원소(catalytic triad) 주변에 cysteine을 도입한 변이체(T138C/A281T)를 생성하였으며, 여기에 인공보조인자 역할을 기대할 수 있는 maleimide류의 화합물을 도입하였다. 이를 통해 얻은 시스템은 효과적으로 α, β-불포화 케톤의 에폭시화 반응을 촉진할 수 있음이 확인되었다. 특히 3-penten-2-one를 기질로 한 반응에서 3-maleimidopropionic acid를 결합한 변이체는 바탕 반응에 대해 1.6배, 야생형 CAL-B에 대해 2배의 전환율을 나타냈다. 그러나 인공보조인자를 도입한 효소 변이체를 통한 입체 선택적 생성물은 발견하지 못해 이에 관한 추가 연구가 필요하다.
환경친화적인 합성방법에 대한 관심이 높아지면서 효소를 이용한 화학 반응 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 효소는 일반적으로 온화한 조건에서 사용되며 반응 부산물이 거의 없는 등의 장점이 있다. 동시에 뛰어난 위치 및 입체 선택적 화학 반응을 촉진하는 유용한 생체 촉매이다. 이 중 Candida antarctica lipase B (CAL-B)는 열적 안정성과 내화학성이 우수한 효소로 알려져 있으며, 이러한 특징 때문에 효소 활용 화학 반응에서 연구자들이 널리 이용하는 효소이다. 본 연구에서는 이러한 CAL-B를 활용하여 작은 치환기를 갖는 이차 알콜에 대한 입체 선택성이 향상된 효소 변이체 생성을 수행하였고, 에폭시화 반응을 수행할 수 있는 효소 변이체 개발 연구를 수행하였다. 먼저, CAL-B의 입체 선택성 향상을 위해, 기존 연구에서 확인된 높은 입체 선택성을 지닌 CAL-B의 상동체 효소인 Pseudozyma brasiliensis GHG 001(PBL)과 CAL-B 사이의 서열 비교분석으로부터 기질 치환체의 중간크기 결합 자리(medium binding pocket)의 아미노산 서열의 차이를 확인하였다. 그리고 CAL-B의 중간크기 결합 자리(medium binding pocket) 서열 대신 PBL의 서열을 도입하거나 단일자리 혹은 이중자리 치환을 수행하여 변이체들을 생성하였다. 이를 통해 본 연구에서는 CAL-B의 S47N 변이체에서 but-3-yn-2-ol에 대한 CAL-B의 입체 선택성을 50배까지 높였다(E > 200). 이러한 반응성 변화는 효소의 비활성도(specific activity)를 측정함으로써 기질의 느린 거울상 이성질체에 대한 반응성이 감소하면서 나타난 것임을 확인하였다. 두 번째로, 본 연구에서는 기존 효소의 반응성을 변화시켜 새로운 반응성을 갖도록 시도하였다. 즉, 가수분해반응을 수행하는 CAL-B에 과산화수소수를 활용한 에폭시화 반응성을 도입하는 연구를 수행하였다. CAL-B는 물 대신 과산화수소수를 기질로 활용하여 과가수분해반응(perhydrolysis)을 수행할 수 있음이 알려져 있다. 그렇지만 CAL-B에 의한 과산화산(peracid) 생성 후에 이어지는 에폭시화 반응 등의 산화 반응은 효소 밖에서 진행되므로, 최종 산물의 입체 선택성은 기대할 수 없다. 따라서 만약 CAL-B에 의해 생성되는 과산화산을 효소 내부에 고정한다면, 연속적으로 일어나는 산화 반응의 입체 선택적 진행을 기대할 수 있을 것으로 고려된다. 이러한 가정하에 먼저 CAL-B 촉매 삼원소(catalytic triad) 주변에 cysteine을 도입한 변이체(T138C/A281T)를 생성하였으며, 여기에 인공보조인자 역할을 기대할 수 있는 maleimide류의 화합물을 도입하였다. 이를 통해 얻은 시스템은 효과적으로 α, β-불포화 케톤의 에폭시화 반응을 촉진할 수 있음이 확인되었다. 특히 3-penten-2-one를 기질로 한 반응에서 3-maleimidopropionic acid를 결합한 변이체는 바탕 반응에 대해 1.6배, 야생형 CAL-B에 대해 2배의 전환율을 나타냈다. 그러나 인공보조인자를 도입한 효소 변이체를 통한 입체 선택적 생성물은 발견하지 못해 이에 관한 추가 연구가 필요하다.
With the increase of environmental concerns, enzyme-catalyzed chemical reactions has been continuously tried and developed because enzymes are generally used in relatively mild conditions, and do not produce byproducts. Moreover, enzymes exhibit excellent regio- and stereoselectivity. Candida antarc...
With the increase of environmental concerns, enzyme-catalyzed chemical reactions has been continuously tried and developed because enzymes are generally used in relatively mild conditions, and do not produce byproducts. Moreover, enzymes exhibit excellent regio- and stereoselectivity. Candida antarctica lipase B (CAL-B) is one of the most widely used enzymes because it possesses high thermo- and chemo-stability. In this study, protein engineering was employed to enhance the enantioselectivity of CAL-B towards chiral sec-alcohols bearing small substituents (i.e. butan-2-ol or but-3-yn-2-ol) and to introduce an epoxidase activity to CAL-B. First, the enantioselectivity of CAL-B was improved based on an information from homologous search. Wild-type CAL-B has been known to have low enantioselectivity towards sec-alcohols with smaller substituents than a propyl group. Previously, CAL-B homologous enzyme (Pseudozyma brasiliensis GHG 001, PBL) was found to possesses high enantioselectivity towards sec-alcohols bearing small substituents. Hence, it has been hypothesized that the enantioselectivity of CAL-B can be improved by substituting the amino acids with the corresponding amino acids of PBL in the medium binding pocket. The four variants of CAL-B were prepared introducing the sequence of PBL. Three mutant enzymes, which contain S47N, exhibited high enantioselectivity, especially toward but-3-yn-2-ol (E > 200). It was confirmed that the improvement of the enantioselectivity was caused by decreasing the reaction rate for the slow enantiomer rather than increase of the reaction rate for the fast one. Second, altering the activity of CAL-B was conducted. It has been known that CAL-B possesses perhydrolytic activity, which catalyzes to produce a peracid from carboxylic acid and hydrogen peroxide instead of water molecule. Then, the produced peracids can be used to oxidize olefins to epoxides. However, the epoxidation process occurs outside of CAL-B, and thus the product should be racemic. If one can keep the peracid inside of CAL-B, it would be expected to produce chiral epoxides because the reaction environment inside of an enzyme is asymmetric. To achieve this goal, a CAL-B mutant with cysteine (T138C/A281T) was generated, and the mutant enzyme was conjugated with a series of maleimides. It was confirmed that the conjugated system catalyzes the epoxidation of α, β-unsaturated ketones. The conversion exhibits up to twice higher than wild-type and 1.6 times higher than the background reaction when the mutant enzyme conjugated with 3-maleimidopropionic acid, and 3-penten-2-one was used as a substrate. However, the reaction was not proceeded in an asymmetric fashion.
With the increase of environmental concerns, enzyme-catalyzed chemical reactions has been continuously tried and developed because enzymes are generally used in relatively mild conditions, and do not produce byproducts. Moreover, enzymes exhibit excellent regio- and stereoselectivity. Candida antarctica lipase B (CAL-B) is one of the most widely used enzymes because it possesses high thermo- and chemo-stability. In this study, protein engineering was employed to enhance the enantioselectivity of CAL-B towards chiral sec-alcohols bearing small substituents (i.e. butan-2-ol or but-3-yn-2-ol) and to introduce an epoxidase activity to CAL-B. First, the enantioselectivity of CAL-B was improved based on an information from homologous search. Wild-type CAL-B has been known to have low enantioselectivity towards sec-alcohols with smaller substituents than a propyl group. Previously, CAL-B homologous enzyme (Pseudozyma brasiliensis GHG 001, PBL) was found to possesses high enantioselectivity towards sec-alcohols bearing small substituents. Hence, it has been hypothesized that the enantioselectivity of CAL-B can be improved by substituting the amino acids with the corresponding amino acids of PBL in the medium binding pocket. The four variants of CAL-B were prepared introducing the sequence of PBL. Three mutant enzymes, which contain S47N, exhibited high enantioselectivity, especially toward but-3-yn-2-ol (E > 200). It was confirmed that the improvement of the enantioselectivity was caused by decreasing the reaction rate for the slow enantiomer rather than increase of the reaction rate for the fast one. Second, altering the activity of CAL-B was conducted. It has been known that CAL-B possesses perhydrolytic activity, which catalyzes to produce a peracid from carboxylic acid and hydrogen peroxide instead of water molecule. Then, the produced peracids can be used to oxidize olefins to epoxides. However, the epoxidation process occurs outside of CAL-B, and thus the product should be racemic. If one can keep the peracid inside of CAL-B, it would be expected to produce chiral epoxides because the reaction environment inside of an enzyme is asymmetric. To achieve this goal, a CAL-B mutant with cysteine (T138C/A281T) was generated, and the mutant enzyme was conjugated with a series of maleimides. It was confirmed that the conjugated system catalyzes the epoxidation of α, β-unsaturated ketones. The conversion exhibits up to twice higher than wild-type and 1.6 times higher than the background reaction when the mutant enzyme conjugated with 3-maleimidopropionic acid, and 3-penten-2-one was used as a substrate. However, the reaction was not proceeded in an asymmetric fashion.
주제어
#biocatalyst Candida antarctica lipase B CAL-B protein engineering chiral sec-alcohol enantioselectivity catalytic epoxidation
학위논문 정보
저자
이성현
학위수여기관
성신여자대학교 일반대학원
학위구분
국내석사
학과
화학과
지도교수
박성순
발행연도
2020
총페이지
ix,61
키워드
biocatalyst Candida antarctica lipase B CAL-B protein engineering chiral sec-alcohol enantioselectivity catalytic epoxidation
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