초록 ▼

본 연구개발 사업의 목표는 효소 성능이 대폭 증진된 리파제 CalB (Candida antarctica lipase B)의 산업적 생산기술을 개발하는 것으로서 다양한 반응공정에 사용될 수 있도록 효소 생산 단가를 대폭 낮출 수 있는 대량생산 시스템을 확립하였다. 리파제 유전자는 비활성과 분비능이 대폭 증진된 variant CalB14를 사용하였고 재조합단백질 분비효율이 우수한 효모 유전자발현 시스템을 사용하였으며 Saccharomyces cervisiae 균주를 사용하여 다양한 프로모터의 선별 등 유전자 발현 카세트의 개량, 융합인

본 연구개발 사업의 목표는 효소 성능이 대폭 증진된 리파제 CalB (Candida antarctica lipase B)의 산업적 생산기술을 개발하는 것으로서 다양한 반응공정에 사용될 수 있도록 효소 생산 단가를 대폭 낮출 수 있는 대량생산 시스템을 확립하였다. 리파제 유전자는 비활성과 분비능이 대폭 증진된 variant CalB14를 사용하였고 재조합단백질 분비효율이 우수한 효모 유전자발현 시스템을 사용하였으며 Saccharomyces cervisiae 균주를 사용하여 다양한 프로모터의 선별 등 유전자 발현 카세트의 개량, 융합인자의 선별을 통한 분비율 향상, 값싼 탄소원을 사용하기 위한 효모 숙주세포의 대사재설계 등 발현시스템을 확립하였고 5리터 스케일에서의 발효 배양 최적화를 거쳐 300리터 및 2.5톤 스케일에서 fed-batch 배양의 안정적 조업과 높은 생산성 (1.5-2.0 g/L)을 달성할 수 있는 scale-up의 기반을 확립하였다. 또한 대량생산된 효소의 활용을 위해서 분리정제 공정 및 고정화효소를 개발하였으며 이를 이용하여 차세대 청정에너지인 바이오디젤 생물학적 생산공정을 개발하였다.

Abstract ▼

For industrial use of CalB, a lipase from Candida antarctica, a recombinant production system was developed. A CalB variant, CalB14, was selected for overproduction in Saccharomyces cerevisiae. It showed improved enzyme activity and secretion efficiency in S. cerevisiae. Fermentation of this clone,

For industrial use of CalB, a lipase from Candida antarctica, a recombinant production system was developed. A CalB variant, CalB14, was selected for overproduction in Saccharomyces cerevisiae. It showed improved enzyme activity and secretion efficiency in S. cerevisiae. Fermentation of this clone, however, required a low temperature fermentation at $20\∼23^{\circ}C$. To further increase the secretion and folding efficiency of CalB14, a collection of TFPs(Translational Fusion Partners) was fused to CalB14 gene and the secretion efficiency was scored. One of the tested TFPs, TFP3, showed about 5 times increase in secretion level and it was noted that the fused clone, TFP3-CalB14, stably produced the enzyme even at the normal fermentation temperature, $30^{\circ}C$. This effect was further confirmed at 300 liter pilot scale fermentation.
The host strain/promoter used for recombinant expression of these constructs was Y2805/Gal10 which requires galactose as inducer. Since wild type Y2805 strain continuously consumes galactose as carbon source, a mutant strain lacking gal80 gene, a part of GAL regulon, was developed to prevent the galactose consumption. The gal80 strain constitutively expressed Gal10 promoter even in the complete absence of galactose in the medium. Fermentation was optimized with this host strain. The production level of about 1.8 g/liter was achieved with fed batch fermentation at $30^{\circ}C$ upto 2.5 ton scale for TFP3-CalB14.
The enzyme obtained from fermentation was subjected to isolation and purification procedures. Crude enzyme was prepared by processes including continuous centrigugation, membrane filtration (0.45 micron) and ultrafiltration (10,000 MWCO), followed by buffer exchange and freeze-drying. Purified enzyme was prepared by hydrophobic interaction chromatography using Butyl-Sepharose in pilot scale purification facilities.
For use in reaction in organic solvent and for repeated use of the enzyme, the CalB14 produced was immobilized in a hydrophobic resin. Immobilized enzyme was tested for application in production of Bio-Diesel from soybean oil and methanol. In a packed bed reactor system, the immobilized CalB14 showed a better performance compared with the commercially available immobilized CalB, Novozyme435. It was also shown that repeated use of the immobiliuzed enzyme was possible for upto several months.

목차 Contents

• 제 1 세부과제 : 첨단화학/전자/의약소재 생산용 리파제(CaIB)의 대량생산 기술개발 ... 2
• 제출문 ... 3
• 보고서 초록 ... 4
• 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 11
• CONTENTS ... 12
• 목차 ... 13
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 14
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 17
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 23
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 127
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 128
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 131
• 제 7 장 참고문헌 ... 133
• 제 2 세부과제 : 대량생산 및 고정화를 통한 첨단소재 제조용 CalB 제품화에 관한 연구 ... 134
• 제출문 ... 135
• 보고서 초록 ... 136
• 목차 ... 137
• 제 1 장. 사업의 개요 ... 139
• 1. 해당 과제의 과학기술, 사회경제적 중요성 ... 139
• 2. 사업의 목표 및 내용 ... 139
• 3. 평가의 착안점 및 척도 ... 140
• 4. 사업의 추진체계 ... 141
• 제 2 장. 국내외 기술개발 현황 ... 142
• 1. 관련 연구 개발 동향 ... 142
• 2. 조사연구개발사례에 대한 평가 ... 150
• 3. 세부 기술사항의 검토 분석 ... 151
• 제 3 장. 사업수행 내용 및 결과 ... 153
• 제 1 절. $SecHancer^{(R}$를 활용한 고분비 발현 ... 153
• 1. $SecHancer^{(R}$기술이란 ... 153
• 2. $SecHancer^{(R}$기술을 활용한 CalB 분비 발현 ... 153
• 제 2 절. CalB 대량 발효 및 분리정제 ... 154
• 1. 효모를 이용한 CalB 분비 발현 ... 154
• 2. CalB 분리정제공정개발 ... 155
• 제 3 절. CalB 고정화 ... 156
• 1. 상업화 레진 탐색 ... 156
• 2. 고정화 공정 최적화 ... 157
• 제 4 절. CalB 고정화 담체 개발 (위탁연구: 한국화학연구원) ... 159
• 1. 다공성 고분자 담체 제조 ... 159
• 2. 최종 합성된 다공성 담체를 이용한 CalB 고정화 반응 ... 164
• 제 5 절. CalB Premade 라이브러리 제조 ... 166
• 1. CalB Premade 라이브러리 제조의 필요성 ... 166
• 2. 효소 디스플레이 기술을 활용한 CalB 돌연변이 라이브러리 제조 ... 166
• 3. 구조기반 CalB 돌연변이 라이브러리 제조 ... 168
• 제 6 절. 다양한 응용연구 ... 170
• 1. Diglyceride (DG) synthesis ... 170
• 2. Low-calorie structured lipid synthesis ... 171
• 3. Fatty acid ester synthesis ... 172
• 4. Lipase-catalyzed transesterification of acrylic polyol ... 174
• 5. 벌크중합반응 (Lactone 폴리머) ... 175
• 제 4 장. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 176
• 제 1 절. 사업 목표의 달성도 ... 176
• 1. 세부 연구 목표 대비 개발 달성치 ... 176
• 제 2 절. 관련 분야의 기술발전에의 기여도 ... 177
• 1. 기술적 측면 ... 177
• 2. 경제. 산업적 측면 ... 177
• 제 5 장. 사업수행 결과의 활용계획 ... 179
• 제 1 절. 타 분야에의 활용계획 ... 179
• 1. 제품화된 CalB의 활용 ... 179
• 2. 효모 발현기술의 활용 ... 179
• 3. 효소 고정화 기술의 활용 ... 179
• 제 2 절. 추가 연구의 필요성 ... 179
• 1. 고정화 CalB 효소 대량 생산 ... 179
• 2. CalB를 활용한 첨단 소재 개발 ... 179
• 제 3 절. 사업화 추진방향 ... 180
• 1. CalB 효소 제품화 ... 180
• 2. 국내 마케팅 ... 180
• 3. 해외 마케팅 ... 180
• 제 6 장. 사업수행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 181
• 1. Circular permutation을 통한 enatioselective 리파제 개발 ... 181
• 2. 효소 안정화를 위한 nanostructures ... 182
• 제 7 장. 참고문헌 ... 183
• 제 3 세부과제 : 첨단 화학 / 전자 / 의약소재 생산용 리파아제(CalB) 생산수율 향상 ... 185
• 제출문 ... 186
• 보고서 초록 ... 187
• 요약문 ... 188
• SUMMARY ... 189
• CONTENTS ... 189
• 목차 ... 190
• 제 1 장 사업의 개요 ... 191
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 197
• 제 3 장 사업수행 내용 및 결과 ... 200
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 209
• 제 5 장 사업수행 결과의 활용계획 ... 211
• 제 6 장 사업수행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 213
• 제 7 장 참고문헌 ... 214