본 연구에서는 주황색의 Kuroda type 당근(Daucus carota)을 이용하여 캘러스 형성 및 체세포배 유도에 적합한 배지 조성을 알아보고, Agrobacterium-매개 형질전환의 적정 공조배양 기간을 구명하였다. 또한 CRISPR/Cas9 system을 통한 당근 뿌리의 카로티노이드 생합성 과정에서 α, β-카로틴 합성에 관여하는 lycopene-β-cyclase(LCYB)와 lycopene-ε-cyclase(LCYE)의 유전자 교정을 통해 lycopene 함량이 증가된 홍색 당근을 개발하고자 하였다. 당근 inbred line 19-1254의 기내 발아시킨 종자에서 얻은 배축 절편체를 B5 비타민이 포함된 ...
본 연구에서는 주황색의 Kuroda type 당근(Daucus carota)을 이용하여 캘러스 형성 및 체세포배 유도에 적합한 배지 조성을 알아보고, Agrobacterium-매개 형질전환의 적정 공조배양 기간을 구명하였다. 또한 CRISPR/Cas9 system을 통한 당근 뿌리의 카로티노이드 생합성 과정에서 α, β-카로틴 합성에 관여하는 lycopene-β-cyclase(LCYB)와 lycopene-ε-cyclase(LCYE)의 유전자 교정을 통해 lycopene 함량이 증가된 홍색 당근을 개발하고자 하였다. 당근 inbred line 19-1254의 기내 발아시킨 종자에서 얻은 배축 절편체를 B5 비타민이 포함된 MS 배지에 2,4-D와 casein hydrolysate의 농도를 달리한 배지에 치상하여 배양하였을 때, 캘러스 유도에는 casein hydrolysate 유무에 따른 차이가 나타나지 않았으며, 체세포배 유도에는 casein hydrolysate 1 g/L 첨가 처리에서 87.5%의 높은 효율을 보여주었다. 이후 pCAMBIA2301 vector가 도입된 LBA4404 균주를 사용하여 Agrobacterium-매개 형질전환을 시행한 후 공조배양 기간을 달리하여 공조배양 하였을 때, 3일 공조배양 처리에서 절편체의 GUS 발현율이 배양 10일, 50일 후 각각 100%, 90%로 높게 나타났다. 이를 바탕으로 당근의 LCYB2, LCYE 유전자를 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 system을 도입하기 위해, SpCas9과 선발마커 nptII를 포함하고 있는 pKAtC에 DcLCYB2 sgRNA 또는 DcLCYE sgRNA를 삽입한 vecotr를 제작하여 Agrobacterium tumefaciens 균주 LBA4404에 도입한 후 형질전환을 실시하였다. 형질전환된 절편체를 kanamycin 50 mg/L가 포함된 선발 배지에서 8주간 배양하였을 때 절편체로부터 캘러스가 형성되었다. 절편체로부터 캘러스를 분리하여 4차 선발 배지까지 계대 배양하였을 때 유전자별로 DcLCYB2 sgRNA45, 46, 47에서 각각 2개, 5개, 1개의 kanamycin 저항성 캘러스를 얻을 수 있었다. 이후 sgRNA 45, 46에서 각각 2개, 3개의 캘러스로부터 체세포배를 얻을 수 있었으며, sgRNA45에서 2개의 체세포가 발아하여 소식물체를 얻을 수 있었다. 또한 DcLCYE sgRNA1, 2에서는 각각 3개, 2개의 kanamycin 저항성 캘러스가 얻어졌으며, sgRNA1에서 2개의 체세포배가 형성되었다. 이후 선발 배지를 통해 상태가 양호한 캘러스를 선정하여 Cas9 프라이머를 사용한 PCR 분석을 실시하였을 때 모든 sample에서 460 bp의 DNA 밴드가 나타났으며, 이를 통해 당근 inbred line 19-1254에 CRISPR/Cas9 system이 도입되었음을 알 수 있었다. 추후 이들을 대상으로 염기서열 분석을 통해 염기 첨가, 결실 등 변이 확인 및 근색 변경 여부에 대한 확인이 필요하다. 본 연구의 결과는 앞으로 홍색 당근 신품종 개발에 효율적으로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 주황색의 Kuroda type 당근(Daucus carota)을 이용하여 캘러스 형성 및 체세포배 유도에 적합한 배지 조성을 알아보고, Agrobacterium-매개 형질전환의 적정 공조배양 기간을 구명하였다. 또한 CRISPR/Cas9 system을 통한 당근 뿌리의 카로티노이드 생합성 과정에서 α, β-카로틴 합성에 관여하는 lycopene-β-cyclase(LCYB)와 lycopene-ε-cyclase(LCYE)의 유전자 교정을 통해 lycopene 함량이 증가된 홍색 당근을 개발하고자 하였다. 당근 inbred line 19-1254의 기내 발아시킨 종자에서 얻은 배축 절편체를 B5 비타민이 포함된 MS 배지에 2,4-D와 casein hydrolysate의 농도를 달리한 배지에 치상하여 배양하였을 때, 캘러스 유도에는 casein hydrolysate 유무에 따른 차이가 나타나지 않았으며, 체세포배 유도에는 casein hydrolysate 1 g/L 첨가 처리에서 87.5%의 높은 효율을 보여주었다. 이후 pCAMBIA2301 vector가 도입된 LBA4404 균주를 사용하여 Agrobacterium-매개 형질전환을 시행한 후 공조배양 기간을 달리하여 공조배양 하였을 때, 3일 공조배양 처리에서 절편체의 GUS 발현율이 배양 10일, 50일 후 각각 100%, 90%로 높게 나타났다. 이를 바탕으로 당근의 LCYB2, LCYE 유전자를 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 system을 도입하기 위해, SpCas9과 선발마커 nptII를 포함하고 있는 pKAtC에 DcLCYB2 sgRNA 또는 DcLCYE sgRNA를 삽입한 vecotr를 제작하여 Agrobacterium tumefaciens 균주 LBA4404에 도입한 후 형질전환을 실시하였다. 형질전환된 절편체를 kanamycin 50 mg/L가 포함된 선발 배지에서 8주간 배양하였을 때 절편체로부터 캘러스가 형성되었다. 절편체로부터 캘러스를 분리하여 4차 선발 배지까지 계대 배양하였을 때 유전자별로 DcLCYB2 sgRNA45, 46, 47에서 각각 2개, 5개, 1개의 kanamycin 저항성 캘러스를 얻을 수 있었다. 이후 sgRNA 45, 46에서 각각 2개, 3개의 캘러스로부터 체세포배를 얻을 수 있었으며, sgRNA45에서 2개의 체세포가 발아하여 소식물체를 얻을 수 있었다. 또한 DcLCYE sgRNA1, 2에서는 각각 3개, 2개의 kanamycin 저항성 캘러스가 얻어졌으며, sgRNA1에서 2개의 체세포배가 형성되었다. 이후 선발 배지를 통해 상태가 양호한 캘러스를 선정하여 Cas9 프라이머를 사용한 PCR 분석을 실시하였을 때 모든 sample에서 460 bp의 DNA 밴드가 나타났으며, 이를 통해 당근 inbred line 19-1254에 CRISPR/Cas9 system이 도입되었음을 알 수 있었다. 추후 이들을 대상으로 염기서열 분석을 통해 염기 첨가, 결실 등 변이 확인 및 근색 변경 여부에 대한 확인이 필요하다. 본 연구의 결과는 앞으로 홍색 당근 신품종 개발에 효율적으로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
This study was conducted to find out the effective composition of medium for callus formation and somatic embryogenesis from hyopcotyl explants and the appropriate condition for Agrobacterium-mediated transformation, and to develop a red root mutants with increased lycopene content through CRISPR/Ca...
This study was conducted to find out the effective composition of medium for callus formation and somatic embryogenesis from hyopcotyl explants and the appropriate condition for Agrobacterium-mediated transformation, and to develop a red root mutants with increased lycopene content through CRISPR/Cas9 genome editing of lycopene-β-cyclase (LCYB) and lycopene-ε-cyclase (LCYE) involved in α, β-carotene synthesis using Kuroda type carrot (Daucus carota) with tap root of orange color. When the hypocotyl explants obtained from in vivo germinated seeds of carrot inbred line 19-1254 was cultivated on MS medium containing B5 vitamins supplemented with different concentrations of 2,4-D and casein hydrolysate, the callus induction did not show any difference with or without casein hydrolysate, the somatic embryogenesis showed a high efficiency of 87.5% with addition to 1 g/L casein hydrolysate. Subsequently, compared with coculture periods of transformed explants in Agrobacterium-mediated transformation with LBA4404 containing pCAMBIA2301 vector, GUS expression was higher at 3 days of coculture, in which 100% and 90% after 10 days and 50 days of culture, respectively. Based on this, in order to introduce CRISPR/Cas9 system targeting LCYB2 and LCYE genes in carrots, Agrobacterium tumefaciens LBA4404 harboring pKAtC vector containing Cas9, DcLCYB2 sgRNA or DcLCYE sgRNA, and nptII as a selection marker was used for transformation. After the transformation, calli were formed from hypocotyl explants after 8 weeks of culture on selection medium containing 50 mg/L kanamycin. When the callus was separated from the explants and subcultured to the 4th selection medium, kanamycin resistant calli were obtained 2, 5 and 1 in DcLCYB2 sgRNA45, 46, 47, respectively. Somatic embryos could be obtained from 2 or 3 calli from sgRNA45 and 46, and the two embryos were developed into plantlets in sgRNA45. And kanamycin resistant calli obtained were 3 and 2 in DcLCYE sgRNA1 and 2, respectively. Somatic embryos could be obtained from two calli in sgRNA1. Then, putative transgenic calli were selected and analyzed via PCR using Cas9 primers. The 460 bp DNA band of Cas9 were produced at all samples, which means the normal introduction of CRISPR/Cas9 system into carrot inbred line 19-1254. In the future, it is necessary to confirm mutations such as insertion and deletion of bases through sequencing and to figure out the modification of root color. The results of this study are expected to be used efficiently for the development of new varieties of red root carrots.
This study was conducted to find out the effective composition of medium for callus formation and somatic embryogenesis from hyopcotyl explants and the appropriate condition for Agrobacterium-mediated transformation, and to develop a red root mutants with increased lycopene content through CRISPR/Cas9 genome editing of lycopene-β-cyclase (LCYB) and lycopene-ε-cyclase (LCYE) involved in α, β-carotene synthesis using Kuroda type carrot (Daucus carota) with tap root of orange color. When the hypocotyl explants obtained from in vivo germinated seeds of carrot inbred line 19-1254 was cultivated on MS medium containing B5 vitamins supplemented with different concentrations of 2,4-D and casein hydrolysate, the callus induction did not show any difference with or without casein hydrolysate, the somatic embryogenesis showed a high efficiency of 87.5% with addition to 1 g/L casein hydrolysate. Subsequently, compared with coculture periods of transformed explants in Agrobacterium-mediated transformation with LBA4404 containing pCAMBIA2301 vector, GUS expression was higher at 3 days of coculture, in which 100% and 90% after 10 days and 50 days of culture, respectively. Based on this, in order to introduce CRISPR/Cas9 system targeting LCYB2 and LCYE genes in carrots, Agrobacterium tumefaciens LBA4404 harboring pKAtC vector containing Cas9, DcLCYB2 sgRNA or DcLCYE sgRNA, and nptII as a selection marker was used for transformation. After the transformation, calli were formed from hypocotyl explants after 8 weeks of culture on selection medium containing 50 mg/L kanamycin. When the callus was separated from the explants and subcultured to the 4th selection medium, kanamycin resistant calli were obtained 2, 5 and 1 in DcLCYB2 sgRNA45, 46, 47, respectively. Somatic embryos could be obtained from 2 or 3 calli from sgRNA45 and 46, and the two embryos were developed into plantlets in sgRNA45. And kanamycin resistant calli obtained were 3 and 2 in DcLCYE sgRNA1 and 2, respectively. Somatic embryos could be obtained from two calli in sgRNA1. Then, putative transgenic calli were selected and analyzed via PCR using Cas9 primers. The 460 bp DNA band of Cas9 were produced at all samples, which means the normal introduction of CRISPR/Cas9 system into carrot inbred line 19-1254. In the future, it is necessary to confirm mutations such as insertion and deletion of bases through sequencing and to figure out the modification of root color. The results of this study are expected to be used efficiently for the development of new varieties of red root carrots.
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