유전체 편집 기술, 특히 CRISPR/Cas9 이 개발되어 주요 작물의 유전자 개량에 널리 적용되고 있으나 오이에서는 여전히 제한적으로 적용되고 있다. 따라서 본 연구에서는 오이에서 CRISPR/Cas9 을 정확한 돌연변이 생성에 적용한 완전한 절차를 개발하였다. 먼저, CRISPR/Cas9 형질전환 벡터의 구조 및 활성을 확인하기 위한 리조비움(Rhizobium rhizogenes) 매개 털뿌리 유도 과정을 최적화하였다. OD650 값이 0.4 일 때의 감염 및 5 일 동안의 공동배양을 포함한 최적화된 조건에서 Choka 품종 오이의 털뿌리 형성이 100%까지 도달하였다. 털뿌리 형성 및 CRISPR/Cas9 시스템의 효율을 리포터 유전자(gus)와 벌노랑이(...
유전체 편집 기술, 특히 CRISPR/Cas9 이 개발되어 주요 작물의 유전자 개량에 널리 적용되고 있으나 오이에서는 여전히 제한적으로 적용되고 있다. 따라서 본 연구에서는 오이에서 CRISPR/Cas9 을 정확한 돌연변이 생성에 적용한 완전한 절차를 개발하였다. 먼저, CRISPR/Cas9 형질전환 벡터의 구조 및 활성을 확인하기 위한 리조비움(Rhizobium rhizogenes) 매개 털뿌리 유도 과정을 최적화하였다. OD650 값이 0.4 일 때의 감염 및 5 일 동안의 공동배양을 포함한 최적화된 조건에서 Choka 품종 오이의 털뿌리 형성이 100%까지 도달하였다. 털뿌리 형성 및 CRISPR/Cas9 시스템의 효율을 리포터 유전자(gus)와 벌노랑이(Lotus japonicus)의 상동체 유전자인 CsbHLH66 및 CsbHLH82 의 돌연변이 유도를 이용하여 검증하였다. 78%의 형질전환 털뿌리에서 뿌리털이 적거나 없는 표현형이 관찰되었으며 두 유전자의 단일 돌연변이 또는 두 유전자 모두의 돌연변이가 확인되었다. 다음으로, 줄기 정단분열조직, 꽃기관 수, 열매 크기 및 형태 조절에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 CsCLV3 를 표적으로 하는 이중 gRNA 의 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 9 개의 형질전환 오이 중 8 개 라인에서 정확한 돌연변이를 유도하였다. 이 중에서 7 개 라인이 기능 소실 돌연변이로 확인되었다. 난쟁이, 비정상적인 줄기, 더 많은 꽃기관 등의 표현형이 T0 형질전환체에서 관찰되었으며 특히, 대조군에 비해 심피의 수가 2.3~4 배 더 많았다. 본 결과는 유전체 편집 CRISPR/Cas9 기술이 오이에서 원하는 형질을 개선하기에 효과적이라는 것을 보여준다. 아울러 오이뿐만 아니라 다른 오이속(Cucumis) 식물의 유전체 편집과 교배를 위한 후속 연구에도 유용한 정보와 방법을 제공한다.
유전체 편집 기술, 특히 CRISPR/Cas9 이 개발되어 주요 작물의 유전자 개량에 널리 적용되고 있으나 오이에서는 여전히 제한적으로 적용되고 있다. 따라서 본 연구에서는 오이에서 CRISPR/Cas9 을 정확한 돌연변이 생성에 적용한 완전한 절차를 개발하였다. 먼저, CRISPR/Cas9 형질전환 벡터의 구조 및 활성을 확인하기 위한 리조비움(Rhizobium rhizogenes) 매개 털뿌리 유도 과정을 최적화하였다. OD650 값이 0.4 일 때의 감염 및 5 일 동안의 공동배양을 포함한 최적화된 조건에서 Choka 품종 오이의 털뿌리 형성이 100%까지 도달하였다. 털뿌리 형성 및 CRISPR/Cas9 시스템의 효율을 리포터 유전자(gus)와 벌노랑이(Lotus japonicus)의 상동체 유전자인 CsbHLH66 및 CsbHLH82 의 돌연변이 유도를 이용하여 검증하였다. 78%의 형질전환 털뿌리에서 뿌리털이 적거나 없는 표현형이 관찰되었으며 두 유전자의 단일 돌연변이 또는 두 유전자 모두의 돌연변이가 확인되었다. 다음으로, 줄기 정단분열조직, 꽃기관 수, 열매 크기 및 형태 조절에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 CsCLV3 를 표적으로 하는 이중 gRNA 의 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 9 개의 형질전환 오이 중 8 개 라인에서 정확한 돌연변이를 유도하였다. 이 중에서 7 개 라인이 기능 소실 돌연변이로 확인되었다. 난쟁이, 비정상적인 줄기, 더 많은 꽃기관 등의 표현형이 T0 형질전환체에서 관찰되었으며 특히, 대조군에 비해 심피의 수가 2.3~4 배 더 많았다. 본 결과는 유전체 편집 CRISPR/Cas9 기술이 오이에서 원하는 형질을 개선하기에 효과적이라는 것을 보여준다. 아울러 오이뿐만 아니라 다른 오이속(Cucumis) 식물의 유전체 편집과 교배를 위한 후속 연구에도 유용한 정보와 방법을 제공한다.
Genome editing technology, especially CRISPR/Cas9, has been developed and widely applied for genetic improvement of important crops. However, its application in cucumber is still limited. Therefore, in this study, a complete procedure for CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis of cucumber was developed. F...
Genome editing technology, especially CRISPR/Cas9, has been developed and widely applied for genetic improvement of important crops. However, its application in cucumber is still limited. Therefore, in this study, a complete procedure for CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis of cucumber was developed. First, a Rhizobium rhizogenes-mediated hairy root induction procedure was optimized to validate the transformation vector and activities of the CRISPR/Cas9 construct. The hairy root formation from cucumber variety Choka reached up to 100% on the optimal conditions including OD650 at 0.4 for infection and 5 days of co-cultivation. The efficiency of hair root transformation and CRISPR/Cas9 system was evaluated based on the reporter gene (gus) and induced mutations in two Lotus japonicus ROOTHAIRLESS1 homolog genes CsbHLH66 and CsbHLH82. Mutant phenotypes including sparse root hair and root hair-less were observed in 78% of transgenic hairy roots and targeted mutations were detected in individual or both genes. Second, the CRISPR/Cas9 system with dual gRNAs targeting CsCLV3, which is the important gene in the regulation of shoot apical meristem, number of flower organs, fruit size and shape, had induced precise mutations in 8 out of 9 of transgenic local cucumber plants. Among these, 7 lines were detected with loss-of-function mutations in the CsCLV3. Mutant phenotypes such as dwarf, fascinated stem, and more flower organs were observed in T0 transgenic plants. Especially, carpel numbers of mutant lines were 2.3–4 times as high as control. My results have demonstrated the efficacy of CRISPR/Cas9 technology in genome editing for improving desired traits in local cucumbers. This study also provided useful information and methods for further research in breeding by genome editing of cucumber as well as other Cucumis plants.
Genome editing technology, especially CRISPR/Cas9, has been developed and widely applied for genetic improvement of important crops. However, its application in cucumber is still limited. Therefore, in this study, a complete procedure for CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis of cucumber was developed. First, a Rhizobium rhizogenes-mediated hairy root induction procedure was optimized to validate the transformation vector and activities of the CRISPR/Cas9 construct. The hairy root formation from cucumber variety Choka reached up to 100% on the optimal conditions including OD650 at 0.4 for infection and 5 days of co-cultivation. The efficiency of hair root transformation and CRISPR/Cas9 system was evaluated based on the reporter gene (gus) and induced mutations in two Lotus japonicus ROOTHAIRLESS1 homolog genes CsbHLH66 and CsbHLH82. Mutant phenotypes including sparse root hair and root hair-less were observed in 78% of transgenic hairy roots and targeted mutations were detected in individual or both genes. Second, the CRISPR/Cas9 system with dual gRNAs targeting CsCLV3, which is the important gene in the regulation of shoot apical meristem, number of flower organs, fruit size and shape, had induced precise mutations in 8 out of 9 of transgenic local cucumber plants. Among these, 7 lines were detected with loss-of-function mutations in the CsCLV3. Mutant phenotypes such as dwarf, fascinated stem, and more flower organs were observed in T0 transgenic plants. Especially, carpel numbers of mutant lines were 2.3–4 times as high as control. My results have demonstrated the efficacy of CRISPR/Cas9 technology in genome editing for improving desired traits in local cucumbers. This study also provided useful information and methods for further research in breeding by genome editing of cucumber as well as other Cucumis plants.
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