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문제 정의
- 본 연구는 국내에서 자생하고 있는 활엽수종들 중 약리 효과가 우수한 것으로 알려져 있는 물푸레나무 및 느릅나무의 추출 성분을 대상으로 중요한 화학 조성분을 분리하고 그들의 구조를 구명함으로써 금후 이 성분들을 기능적으로 이용할 수 있는 기초자료를 작성하고자 시도되었다.
제안 방법
- 22g)과 화합물 3((+)-catechin-7-O-/3-D-xylo-pyranoside. 109mg) 그리고 (+)-catechin 이량 체인 화합물 8((+)-catechin(4a, —8)-(+)-catechin, 59mg)을단리하였다.
- acetonerL를 사용하였다. 1H-NMR과 13C-NMR 스펙트럼을 분석하여 단리화합물의 구조를 결정하였다. 단리된 화합물의 정확한 분자량을 측정하기 위하여 강원대학교 공동실험실습관의 Micromass사 Autospec M363 질량분석기기를 사용하였고 EI-MS와 FAB-MS 분석을 실시하였다.
- 77g이었다. FBE-3에 대하여 연속적인 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 coumarin 파생물인 결정성의 화합물 4(aesculetin. 3.3g)와 화합물 5(aesculin. 41mg)를 단리하였다. 또한 FBE-1에 대하여 계속적 으로 칼럼크로마토그래 피를 수행하여 에스테 르화합물인 화합물 6(ligstroside.
- 6g을 얻었다. FBW-3에 대하여 재 크로마토그래피를 수행하여 화합물 5(aesculin, 70mg)를 단리하였다.
- 박층 크로마토그래피에 사용된 박판은 Merck 사의 DC-Plastikfolien Cellulose F였으며 , 전개 용매로는 t-butanol(t-BuOH)-acetic acid(AcOH)-H2O(3:1:1, v/v, TBA(solvent A))와 6% AcOH(sol-vent B)를 사용하였고 TBA는 주로 에틸아세테이트용성 화합물에 그리고 6% AcOH는 주로 수용성 화합물에 대하여 적용하였다. TLC 상에 전개된 화합물은 UV 램프(254와 365nm)로 관찰하였고. 발색제로 vanillin-HCl-ethanol(60:0.
- 32g 이었다. UBE-2 분 획을 계속적으로 재 크로마토그래피를 수행하여 flavan-3-ol 및 그 파생물인 화합물 1((+)- catechin, 418mg), 화합물 2((+)-cat-echin-7-O-0-D-apiofuranoside, 3.22g)과 화합물 3((+)-catechin-7-O-/3-D-xylo-pyranoside. 109mg) 그리고 (+)-catechin 이량 체인 화합물 8((+)-catechin(4a, —8)-(+)-catechin, 59mg)을단리하였다.
- 각 분획 혼합물을 분리하기 위하여 Sephadex LH-20 칼럼크로마토그래피를 수행하였고 단리 여부를 확인하기 위하여 셀룰로오스 박층 크로마토그래피를 수행 하였으며 전개용매 로는 t-BuOH-AcOH-H2O(3:1:1, v/v, TBA(solvent A))와 6% AcOH(solvent B)를 사용하였으며 UV 램프 및 vanillin-HCl-EtOH 발색제에 반응하여 나타나는 색을 관찰하였다.
- 각 시료 추출물로부터 단리된 화합물의 구조를 결정하기 위하여 핵자기 공명 분광분석 스펙트럼을 분석하였고 정확한 분자량을 확인하기 위하여 질량분석을 실시하였다.
- 각 시료로부터 조제된 추출물의 클로로 포름 및 에틸아세테이트용 성과 수용 성 분획을 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 순수한 단일화합물을 분리하였다. 사용된 칼럼은 내경 4.
- 분리하였다. 각 추출물 분획은 동결건조기를 이용하여 분말로 조제하였다.
- 공시목들은 즉시 박피하여 수피와 목질부로 구분하여 실험실에서 약 2주간 건조한 후 lOmesh 정도의 크기로 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
- 기건된 물푸레나 무 수피 1kg과 느릅나무 수피 2kg 을 각각 107의 유리용기에 넣고 아세톤-물 (7:3, v/v)의 혼합용 매로 약 3일간 추출하였고 이 과정을 3회 반복하였으며 추출액은 진공회전 농축기로 농축하였다.
- 느릅나무 수피에틸아세테이트용성 분 획 주출물 10g을 유리 칼럼에 주입하고 메탄올-물(2: L v/v) 로 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 3개의 분획으로 분리하였으며 각 분획은 UBE로 명명하였고 UBE-1은 1.05g, UBE-2는 7.20g 및 UBE-3은 1.32g 이었다. UBE-2 분 획을 계속적으로 재 크로마토그래피를 수행하여 flavan-3-ol 및 그 파생물인 화합물 1((+)- catechin, 418mg), 화합물 2((+)-cat-echin-7-O-0-D-apiofuranoside, 3.
- 느릅나무 수피에틸아세테이트용성 분획으로부터 (+)-catechin(418mg), (+)-catechin-7-0-B-D-apiofuranoside(3.22g), (+)-catechin-7-O-0-D-xylopyranoside (109mg) -4 procyanidin B-3 인 (+) fcatechin(4aT8) i(+)-catechin(59mg)올단리하였다.
- 1H-NMR과 13C-NMR 스펙트럼을 분석하여 단리화합물의 구조를 결정하였다. 단리된 화합물의 정확한 분자량을 측정하기 위하여 강원대학교 공동실험실습관의 Micromass사 Autospec M363 질량분석기기를 사용하였고 EI-MS와 FAB-MS 분석을 실시하였다.
- 또한 단리화합물의 순도를 확인하기 위하여 solvent A와 solvent B를 직각으로 교차하여 전개하는 2차원 박층크로마토그래피(2D-TLC)를 실시하였다.
- 물푸레나 무 수피부를 아세톤-물(7:3)의 용매로 추출하여 농축하는 과정에서 침전물이 형성되어 재결정법으로 정제한 후 화합물 4(aesculetin, 10g) 를 분리하였다.
- 물푸레나 무 수피의 에틸 아세테 이트용성 분획 으로부터 다량의 쿠마린 파 생물인 aesculetin(13.3g) 과 aesculin(41mg) 및 에스테르형 화합물인 ligstroside(46mg)와 oleuropein(980mg)을 단리 하였고 수용 성 분획에서는 aesculin(70mg)을단리 하였다.
- TLC 상에 전개된 화합물은 UV 램프(254와 365nm)로 관찰하였고. 발색제로 vanillin-HCl-ethanol(60:0.15:6) 용액을 분무 후가열건조하여 나타나는 색을 관찰하였다.
- 시험관에 일정량으로 모아진 화합물의 순도를 확인하기 위하여 박충 크로마토그래피(TLC)를 실시하였다. 박층 크로마토그래피에 사용된 박판은 Merck 사의 DC-Plastikfolien Cellulose F였으며 , 전개 용매로는 t-butanol(t-BuOH)-acetic acid(AcOH)-H2O(3:1:1, v/v, TBA(solvent A))와 6% AcOH(sol-vent B)를 사용하였고 TBA는 주로 에틸아세테이트용성 화합물에 그리고 6% AcOH는 주로 수용성 화합물에 대하여 적용하였다.
- 에틸아세테이트용 성 분 획 추출물 16.4g을 95% 에탄올 용액으로 칼럼크로마토그래피를 실시하였으며 각 분획은 FBE로 명명하였고 FBE-1 은 1.68g, FBE-2는 3.49g, FBE-3-& 6.25g, FBE-4는 1.8g 그리고 FBE-5는 1.77g이었다. FBE-3에 대하여 연속적인 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 coumarin 파생물인 결정성의 화합물 4(aesculetin.
- 우리나라에 많이 자생하며 예로부터 민간에서 약용으로 이용되어 온 물푸레나무와 느릅나무를 대상으로 수피를 아세톤-물(7:3)용액으로 추출한 후 추출액 을 헥산용성 , 클로로 포름용성 , 에틸아세테 이트용성 및 수용성으로 분획하여 동결건조하였다. 각 분획 혼합물을 분리하기 위하여 Sephadex LH-20 칼럼크로마토그래피를 수행하였고 단리 여부를 확인하기 위하여 셀룰로오스 박층 크로마토그래피를 수행 하였으며 전개용매 로는 t-BuOH-AcOH-H2O(3:1:1, v/v, TBA(solvent A))와 6% AcOH(solvent B)를 사용하였으며 UV 램프 및 vanillin-HCl-EtOH 발색제에 반응하여 나타나는 색을 관찰하였다.
- 추출액 또는 용출액으로부터 분리된 결정이나 침전물은 혼합물이 많이 섞여 있으므로 순수한 단일화합물을 얻기 위하여 이들이용해될 수 있는 미량의 아세톤 또는 아세톤-물 혼합액을 넣어 모두 완전하게 용해시킨 후 증류수를 첨가하고 침전이 형성되도록 냉장실에 1~2일간 방치하였다. 이러한 조작을 3~4회 반복적으로 수행하여 순수한 결정성의 화합물을 얻었다.
- 추출액을 농축하거나 칼럼크로마토그래 피를 수행하는 과정 중 결정 또는 침전물이 생기는 경우에는 순수한 결정성화합물을 얻기 위하여 재결정법을 실시하였다.
대상 데이터
- NMR 분석을 위해 사용된 기기는 강원대학교 공동실험 실습관의 Bruker DTX 400MHz NMR 기기를 이용하였으며 분석용매로는 methanol-d4 및 acetonerL를 사용하였다. 1H-NMR과 13C-NMR 스펙트럼을 분석하여 단리화합물의 구조를 결정하였다.
- 강원도에서 자생하는 물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla)느릅나무(U/mus davidiana var. japonica) 한 그루씩을 벌채하여 공시재료로 사용하였고 물푸레나무는 1998년 4월 강원도 춘천시 동산면 강원대학교 봉명연습림에서 수령 30년생 수목을 벌채하였고 느릅나무는 1998년 8월 강원대학교 봉명연습림에서 수령 27년생수목을 벌채하여 공시 시료로 사용하였다.
- 박층 크로마토그래피에 사용된 박판은 Merck 사의 DC-Plastikfolien Cellulose F였으며 , 전개 용매로는 t-butanol(t-BuOH)-acetic acid(AcOH)-H2O(3:1:1, v/v, TBA(solvent A))와 6% AcOH(sol-vent B)를 사용하였고 TBA는 주로 에틸아세테이트용성 화합물에 그리고 6% AcOH는 주로 수용성 화합물에 대하여 적용하였다. TLC 상에 전개된 화합물은 UV 램프(254와 365nm)로 관찰하였고.
- 사용된 칼럼은 내경 4.5, 3, 1.5 및 1cm, 길이 60과 100cm의 것을 사용하였으며 충진물질로는 Sigma사의 Lipophilic Sephadex LH-200] 사용되었고 용리용매는 메탄올:물(4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 등, v/v) 혼합액과 에탄올:헥산(4:1. 3:1, 2:1 등, v/v) 혼합액을 사용하였다. 칼럼을 통하여 떨어지는 용액은 Gilson사의 FC204 Fraction Collector를 사용하여 순차적 으로 25ml의 시험관에 모았으며 유리 칼럼이 무색이 될 때까지 용리용매로분리하고 무색에 가까워지면 아세톤:물(1:1, v/v) 을 사용하여 칼럼을 세척하였다.
성능/효과
- 41mg)를 단리하였다. 또한 FBE-1에 대하여 계속적 으로 칼럼크로마토그래 피를 수행하여 에스테 르화합물인 화합물 6(ligstroside. 46mg)과 화합물 7(oleuropein, 980mg)을 단리할 수 있었다.
- 49(01')의 피크는 전형적인 O-glucopy-ranose의 형태를 보여주고 있다. 또한 eH-NMR 스펙트럼에서 H-8과 H-5는 6.79와 7.42에서 singlet으로 나타났고 13C-NMR 스펙트럼에서 C-8과 C-5는 각각 104.81과 116.86의 흡수 피크를 나타냈으며 aesculetin보다 각각 1.4ppm과 4.3ppm씩 down되었다. C-7은 144.
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