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문제 정의
- 본 연구는 FISH 기법과 단세포전기영동법을 저선량 방사선 측정을 위한 생물학적 선량계로서의 활용가능성을 조사하기 위해 시행되었다. 단세포 전기영동법은 저선량 방사선에 의한 DNA손상을 민감하게 측정할 수 있는 방법으로 그 활용성이 증대되고 있으며, 각 염색체에 특이한 DNA probe를 이용하는 FISH 기법은 염색체의 구조적 변화를 측정하는 매우 효과적인 방법으로서 그 유용성이 증대되고 있는 추세이다.
- 본 연구에서는 FISH 기법과 단세포전기영동법을 저선량 방사선의 측정을 위한 생물학적 선량계로서의 활용가능성을 조사하고자 한다.
- , 1988)[6, 8], 전체의 comet 길이, head 직경과 tail 길이에 대한 비, tail moment, 그리고 Comet moment를 들 수 있는데 최근에는 현미경에서 관찰한 영상을 PC에 저장하여 특별히 제작된 program을 이용하여 분석하는 방법이 시도되고 있다. 본 연구에서는 head로부터 tail까지의 길이로서 DNA의 이동 정도를 파악하였다. 최근의 연구에서 상기 기술한 측정 방법 어느 것이나 이용될 수 있다고 보고되고 있으며, 오히려 일부 연구자들이 이용하는 comet moment를 측정 시에는 다른 측정법에 의한 자료도 병기하도록 권고하고 있다[12].
제안 방법
- 1, 2, 4 염색체가 동시에 Spectrum Orange로 표지된 DNA probe(WCP 1, 2, 4, Vysis)를 73±1 ℃에서 5분간 변성시킨 후, hybridization시키기 전까지 45-50℃의 slide warmer에 놓아두었다.
- 건강한 사람의 말초혈액을 선형 가속기(LINAC, Varian 6/100)로 에너지 6MV x선을 5 cGy, 10 cGy, 30 cGy, 50 cGy 조사(dose rate: 2.00 Gy/min)하였다.
- 방사선 조사된 말초혈액 1m를 PHA 및 1% 우태아 혈청이 포함된 RPMI배지 9ml에 넣고 5% CO2가 공급되는 배양기에서 48시간 배양한 후 염색체 표본을 작성하였다.
- 방사선이 조사된 림프구는 4℃에서 보관하면서 방사선 조사 즉시 ficoli을 이용하여 림프구를 분리 하였다.
- 본 실험에서는 Spectrum Orange가 표지된 1, 2, 4번 염색체의 WCP probe(Vysis)를 이용하여 직 접법에 의해 FISH를 수행하였다.
- 본 연구에서는 Singh 등(1994)의 개량한 방법에 의해 단세포전기영동법을 수행하였는데, 즉 전기영동 시 이용한 buffer에 8-hydroxyguanosine과 dinmethylsulphxide를 첨가하여 free radical에 의한 DNA 상해를 방지하여 기저 상해수준을 낮추고자 하였으며, 전기영동 후 중화과정을 거치고 ethanol을 1시간 처리함으로서 각 세포의 DNA를 슬라이드에 침착시킴으로서 형광현미경으로 관찰 시 편리하게 하였다[15].
- 본 연구에서는 Tucker 등(1995a)에 의해 제안된 명명법인 PAINT(Protocol Aberration Identification and Nomenclature Terminology) system에 근거하여 염색체 이상을 분류하였으며[13], 염색체 이상 빈도는 painting된 특정 염색체에서만 나타나기 때문에 이 염색체가 전체 genome 상에서 차지하는 비율을 계산하여[1, 14], 보정하여 전체 genome에서의 염색체 이상 빈도를 계산하였다[3-4]. 본 연구에서 사용한 염색체 1, 2, 4번의 경우 전체 genome 상에서 차지하는 DNA의 비율이 22.
- 형광현미경(NIKON, E600)을 이용하여 triple band filter인 D/F/TXRD(DAPI/FICT/Texase Red, Chroma Technology Corp. 61002)로는 Spectrum Orange 및 DAPI를 동시에 관찰하였으며, UV-2A filter(NIKON, DM400)로는 DAPI를 관찰하였다.
- )로 염색하였다. 형광현미경을 사용하여 이미지분석프로그램(Image Pro Plus 3.0)을 통해 60개의 세포를 선택하여 DNA 손상정도를 head를 포함한 tail의 길이로 분석하였다[8].
데이터처리
- 0 통계패키지를 이용하여. 상호전좌 및 이동원염색체 빈도의 선량-반응 곡선을 추정하였으며, DNA 손상정도를 살펴보기 위해 KruskaU-Wallis analysis를 실행하였다.
이론/모형
- 단세포전기영동법은 Singh 등(1994, 1995)의 방법에 준하여 시행하였다[15-16].
- 림프구에 5, 10, 30, 및 50 cGy의 저선량의 방사선을 조사한 경우 염색체 이상빈도는 표1, 그림 1 및 그림 2와 같다. 본 실험에서는 1, 2, 4번 염색체의 probe를 동시에 이용한 FISH기법을 활용하였다. 5 cGy에서 50 cGy의 저선량 방사선에 의한 이동원염색체 및 상호전좌 등의 염색체이상빈도는 선량에 따라 직선적으로 증가하였다.
성능/효과
- 5 cGy - 50 cGy의 저선량 조사 후 단세포전기영동을 통해 DNA 상해정도를 살펴본 결과 선량이 증가함에 따라 DNA 상해가 증가하는 결과를 얻었다(Y=39.764+72.9X, r2=0.1620, X: 선량(Gy), Y: tail length(μm))(표 2, 그림 3과 4).
- 본 실험에서는 1, 2, 4번 염색체의 probe를 동시에 이용한 FISH기법을 활용하였다. 5 cGy에서 50 cGy의 저선량 방사선에 의한 이동원염색체 및 상호전좌 등의 염색체이상빈도는 선량에 따라 직선적으로 증가하였다. 즉 관찰된 상호전좌의 빈도는 1, 2, 4번 염색체가 전체 genome상에서 차지하는 비율을 감안하여, 전체 세포수로 환산했을 때 cell equivalent당 0.
- 5, 10, 30, 및 50cGy의 저선량 방사선 조사에 의한 염색체이상빈도는 상호전좌의 경우 1, 2, 4번 염색체가 전체 genome 상에서 차지하는 비율을 감안하여, 전체 세포수로 환산했을 때 cell equivalent당 0.0375, 0.0407, 0.0727 및 0.0814로 나타났으며, 이동원염색체의 경우 0.0125, 0.0174, 0.02291, 및 0.0407로 나타나 선량 증가에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 5 ~ 50cGy의 저선량 방사선 조사 후 단세포전기영동법을 통해 DNA 상해 정도를 살펴본 결과 선량이 증가할수록 DNA 상해가 증가하는 결과를 얻었다.
- 0407로 나타나 선량 증가에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 5 ~ 50cGy의 저선량 방사선 조사 후 단세포전기영동법을 통해 DNA 상해 정도를 살펴본 결과 선량이 증가할수록 DNA 상해가 증가하는 결과를 얻었다. 따라서 FISH 기법은 저선량 방사선 피폭 시 염색체 이상을 보다 정확하고 쉽게 관찰할 수 있으며, 단세포전기영동법은 DNA 손상을 민감하게 감지할 수 있어 저선량 방사선 피폭 시 유용한 생물학적 선량계로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 933, X: 선량(Gy), Y: cell equivalait당 이동원염색체의 빈도)을 보여주었다. 또한 color junction의 빈도도 선량에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. 상호전좌 빈도와 이동원염색체 빈도의 비(t/dic)는 5cGy에서 3, 10cGy에서 2.
- 본 연구결과 50 cGy 이하의 저선량의 방사선조사에 의해 상호전좌 및 이동원염색체가 선량에 따라 직선적으로 증가되는 것을 확인하였다. 또한 상호전좌:이동원염색체의 비는 5cGy의 저선량에서는 1:3 이었으나 선량이 증가될수록 그 비가 1:2에 근접되는데 본 실험에서 PAINT 분류체계를 따랐기 때문에 상호전좌된 염색체를 지닌 세포를 쌍으로 하여 하나로 측정한다면 상호전좌와 이동원염색체는 거의 같은 빈도로 나타난다는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구결과 50 cGy 이하의 저선량의 방사선조사에 의해 상호전좌 및 이동원염색체가 선량에 따라 직선적으로 증가되는 것을 확인하였다. 또한 상호전좌:이동원염색체의 비는 5cGy의 저선량에서는 1:3 이었으나 선량이 증가될수록 그 비가 1:2에 근접되는데 본 실험에서 PAINT 분류체계를 따랐기 때문에 상호전좌된 염색체를 지닌 세포를 쌍으로 하여 하나로 측정한다면 상호전좌와 이동원염색체는 거의 같은 빈도로 나타난다는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구결과 알카리 조건하에서 단세포전기영동법에 의해 저선량 방사선에 의해 DNA 상해가 선량에 따라 증가되는 결과를 얻었다.
- 본 연구에서는 Tucker 등(1995a)에 의해 제안된 명명법인 PAINT(Protocol Aberration Identification and Nomenclature Terminology) system에 근거하여 염색체 이상을 분류하였으며[13], 염색체 이상 빈도는 painting된 특정 염색체에서만 나타나기 때문에 이 염색체가 전체 genome 상에서 차지하는 비율을 계산하여[1, 14], 보정하여 전체 genome에서의 염색체 이상 빈도를 계산하였다[3-4]. 본 연구에서 사용한 염색체 1, 2, 4번의 경우 전체 genome 상에서 차지하는 DNA의 비율이 22.4%, 전체교환형중 34.4%가 관찰되는 것으로 나타났다.
- 또한 color junction의 빈도도 선량에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. 상호전좌 빈도와 이동원염색체 빈도의 비(t/dic)는 5cGy에서 3, 10cGy에서 2.33, 30cGy에서 2.50, 그리고 50cGy에서는 2.00로서 상호전좌의 빈도가 이동원 염색체의 빈도보다 상대적으로 높게 나타났다. 즉 본 연구에서는 PAINT 분류체계를 따랐기 때문에 상호전좌가 나타난 각각의 염색체 이상을 측정한 것을 고려하더라도 상호전좌의 빈도가 이동원염색체의 빈도보다 높게 나타난 것을 알 수 있었다.
- 즉 각 선량별로 60개의 세포를 대상으로 tail의 길이를 측정한 결과 선량이 증가할수록 tail 길이 가 증가되어 DNA 상해를 보여주는 세포가 더 많이 존재함을 알 수 있다(표 2, 그림 3).
- 5 cGy에서 50 cGy의 저선량 방사선에 의한 이동원염색체 및 상호전좌 등의 염색체이상빈도는 선량에 따라 직선적으로 증가하였다. 즉 관찰된 상호전좌의 빈도는 1, 2, 4번 염색체가 전체 genome상에서 차지하는 비율을 감안하여, 전체 세포수로 환산했을 때 cell equivalent당 0.0375, 0.0407, 0.0727 및 0.0814로 나타나 직선적 관계(Y=0.0244+0.0013X, r2=0.885, X: 선량(Gy), Y: cell equivalent당 상호전좌의 빈도)를 보여주고 0.02291 및 0.0407로 나타나 같은 양상(Y=0.00613+ 0.000723X, r2=0.933, X: 선량(Gy), Y: cell equivalait당 이동원염색체의 빈도)을 보여주었다. 또한 color junction의 빈도도 선량에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다.
- 00로서 상호전좌의 빈도가 이동원 염색체의 빈도보다 상대적으로 높게 나타났다. 즉 본 연구에서는 PAINT 분류체계를 따랐기 때문에 상호전좌가 나타난 각각의 염색체 이상을 측정한 것을 고려하더라도 상호전좌의 빈도가 이동원염색체의 빈도보다 높게 나타난 것을 알 수 있었다. 또한 상호전좌와 이동원염색체중 t(Ab)와 t(Ba), dic(BA)와 dic(BB)가 주로 관찰되었으며, 삽입(ins), 무동원염색체(ace) 및 환상염색체(r)도 관찰되었다.
후속연구
- 또한 기저수준의 DNA 손상을 감소시키는 방법을 사용하였기 때문에 민감하게 측정할 수 있었다고 보고하고 있지만, 후속연구가 없어서, 그 타당성 여부를 단정적으로 판단하기에는 논란이 있다. 그러나 1cGy 이하 저선량의 영향을 측정하기 위한 생물학적 선량계가 현재까지는 개발되지 않았기 때문에 이 측정법에 대한 더 많은 연구가 필요하다.
- 또한 5 ~ 50cGy의 저선량 방사선 조사 후 단세포전기영동법을 통해 DNA 상해 정도를 살펴본 결과 선량이 증가할수록 DNA 상해가 증가하는 결과를 얻었다. 따라서 FISH 기법은 저선량 방사선 피폭 시 염색체 이상을 보다 정확하고 쉽게 관찰할 수 있으며, 단세포전기영동법은 DNA 손상을 민감하게 감지할 수 있어 저선량 방사선 피폭 시 유용한 생물학적 선량계로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 따라서 저선량 방사선에 생물학적 선량계로서 FISH기법 및 단세포전기영동법에 민감도 및 타당성 평가에 대한 연구가 더욱 필요하다고 판단된다.
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