E-screen assay 및 자궁비대반응시험 (Uterotrophic assay)을 이용한 di-(2-ethylhexyl) adipate의 에스트로겐성 작용에 관한 연구 Study on the Estrogenic Activity of Di-(2-Ethylhexyl) Adipate in E-Screen Assay and Uterotrophic Assay원문보기
랩 등 PVC 제품의 가소제인 DEHA의 에스트로겐 활성을 검색하기 위하여 내분비계 장애작용 중 에스트로겐성 작용을 검색하는 대표적인 방법인 in vitro E-screen assay와 OECD 및 미국 EPA EDSTAC에서 권고하고 있는 in vivo 난소절제 랫드를 이용한 자궁 비대반응시험(uterotrophic assay)을 실시하였다. 시험결과 $DEHA(5{\times}10^{-9}{\sim}5{\times}10^{-4}\;M)$는 MCF-7세포의 증식을 유발하지 않았고 난소절제 랫드에 200 mg/kg/day 용량까지 투여하여도 자궁 및 질 무게에 영향을 미치지 않았다. 따라서 본 실험결과 DEHA는 E-screen assay 및 자궁비대반응시험에서 에스트로겐성 작용이 없는 것으로 확인되었으나, 이들 물질의 에스트로겐성에 대한 결론을 내리기 위해서는 여러 종류의 in vitro 시험 data 및 in vivo 시험 data가 더 보충되어야 할 것으로 생각된다.
랩 등 PVC 제품의 가소제인 DEHA의 에스트로겐 활성을 검색하기 위하여 내분비계 장애작용 중 에스트로겐성 작용을 검색하는 대표적인 방법인 in vitro E-screen assay와 OECD 및 미국 EPA EDSTAC에서 권고하고 있는 in vivo 난소절제 랫드를 이용한 자궁 비대반응시험(uterotrophic assay)을 실시하였다. 시험결과 $DEHA(5{\times}10^{-9}{\sim}5{\times}10^{-4}\;M)$는 MCF-7세포의 증식을 유발하지 않았고 난소절제 랫드에 200 mg/kg/day 용량까지 투여하여도 자궁 및 질 무게에 영향을 미치지 않았다. 따라서 본 실험결과 DEHA는 E-screen assay 및 자궁비대반응시험에서 에스트로겐성 작용이 없는 것으로 확인되었으나, 이들 물질의 에스트로겐성에 대한 결론을 내리기 위해서는 여러 종류의 in vitro 시험 data 및 in vivo 시험 data가 더 보충되어야 할 것으로 생각된다.
Di-(2-ethylhexyl) adipate(DEHA) has been used extensively as a plasticizer in the manufacture of plastic products such as PVC films. Though, phthalate esters plasticizers have been known to induce endocrine system-mediated responses, few studies have been conducted for the screening of estrogenic ac...
Di-(2-ethylhexyl) adipate(DEHA) has been used extensively as a plasticizer in the manufacture of plastic products such as PVC films. Though, phthalate esters plasticizers have been known to induce endocrine system-mediated responses, few studies have been conducted for the screening of estrogenic activity of DEHA, an adipate plasticizer. This study was initiated to evaluate the estrogenic activity of DEHA by in vitro E-screen assay and in vivo uterotrophic assay. MCF-7 human breast cancer cells were treated with $DEHA(5{\times}10^{-9}{\sim}5{\times}10^{-4}\;M)$, for 144 hr, and cell proliferation was determined by sulforhodamine B(SRB) assay. DEHA dissolved in corn oil was administered subcutaneously to ovariectomized(OVX) female Sprague-Dawley rats at dosage levels of 0, 2, 20 and 200 mg/kg/day for three consecutive days. Rats were sacrificed 24 hr after final treatment and vagina and uterus(wet and blotted) weights were obtained. E-screen assayed DEHA did not generate cell proliferation at treated concentrations$(5{\times}10^{-9}{\sim}5{\times}10^{-4}\;M)$, whereas 17 ${\beta}-estradiol$(E2), the positive control, induced cell proliferation at low concentrations$(5{\times}10^{-14}{\sim}5{\times}10^{-9}\;M)$. In the uterotrophic assay, DEHA did not change vagina and uterus(wet and blotted) weights at dosage levels up to 200 mg/kg/day treatment. These results demonstrated that DEHA did not exhibit the estrogenic activity as determined by in vitro E-screen assay and in vivo uterotrophic assay.
Di-(2-ethylhexyl) adipate(DEHA) has been used extensively as a plasticizer in the manufacture of plastic products such as PVC films. Though, phthalate esters plasticizers have been known to induce endocrine system-mediated responses, few studies have been conducted for the screening of estrogenic activity of DEHA, an adipate plasticizer. This study was initiated to evaluate the estrogenic activity of DEHA by in vitro E-screen assay and in vivo uterotrophic assay. MCF-7 human breast cancer cells were treated with $DEHA(5{\times}10^{-9}{\sim}5{\times}10^{-4}\;M)$, for 144 hr, and cell proliferation was determined by sulforhodamine B(SRB) assay. DEHA dissolved in corn oil was administered subcutaneously to ovariectomized(OVX) female Sprague-Dawley rats at dosage levels of 0, 2, 20 and 200 mg/kg/day for three consecutive days. Rats were sacrificed 24 hr after final treatment and vagina and uterus(wet and blotted) weights were obtained. E-screen assayed DEHA did not generate cell proliferation at treated concentrations$(5{\times}10^{-9}{\sim}5{\times}10^{-4}\;M)$, whereas 17 ${\beta}-estradiol$(E2), the positive control, induced cell proliferation at low concentrations$(5{\times}10^{-14}{\sim}5{\times}10^{-9}\;M)$. In the uterotrophic assay, DEHA did not change vagina and uterus(wet and blotted) weights at dosage levels up to 200 mg/kg/day treatment. These results demonstrated that DEHA did not exhibit the estrogenic activity as determined by in vitro E-screen assay and in vivo uterotrophic assay.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
이중 BBP에 대한 결과는 Soto 등의 실험결과(17)와 일치하였으며 DEHP는 Blom 둥의 결과(22)와 유사하게 나타났다. 그리고 E-screen assay에서 DBP 및 DEP의 약한 에스트로겐 활성의 가능성을 본 연구실이 처음으로 보고하였다. 또한 이들 프탈레이트에 대하여 ER에 대한 E2와의 상경적 결합시험을 조사한 결과, BBP와 DEP는 E2보다 lO'-lO5배정도 높은 농도에서 에스트로겐 수용체에 대한 E2의 결합을 억제시켰지만 DEHP와 DBP는 ER과 거의 결합하지 않는 것을 알 수 있었다(21).
따라서 본시험에서는 DEHA가 내분비계 장애작용 중 에스트로겐성 효과를 갖고 있는 지의 여부를 E-screen assay 및 자궁비대반응시험법을 이용하여 검색하고자 하였다.
제안 방법
배지롤 15 mL 원심분리관(FALQON #352097)으로옮겨 원심분리시켜(1000rpm, 5분) 상징액을 흡인 제거한 다음, 세포가 남아 있는 원심분리관에 배지를 넣고 피펫팅하여 세포롤 단일화시켜 세포수를 측정하였다. 5X103 cells/well로 96well 배양판(Falcon #353072, Non-pyrogenic)에 분주한 후(well당 배지량 100 |JL) 배양판을 천천히 흔들어 세포가 균일하게 분산되도록 하고 5% CO2, 37P로 조절된 배양기에서 24시간 배양시킨 후, well에 들어 있는 배지를 흡인 . 제거하였다.
제거하였다. Charcoal-dextran을 처리하여 혈청에 함유된 세포증식인자를제거한 FBS(CDFBS) 5%를 함유한 DMEM 배지 90pL를 well에 넣고 시험 물질의 농도를 5nM부터 최고 50J1M까지 조제하여 각 농도별로 10μL씩 well에 가하였다. 이때, 용매로 사용한 DMSCO의 최종농도는 0.
Office 9가을 이용하여 one way analysis of variance(ANOVA)검정을 실시하여 유의성이 인정된 경우, Dunnett's test를 이용하여 대조군과 각 투여군간에 다중교를 실시하였다. JX0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
고정액을 제거하고 수세한 후 종이 타월로 물기를 완전히 흡수시켜 상온에서 건조시켰다. 건조된 배양판에 0.4% SRB(1% acetic acid에 용해를 well당 5O|1L씩 가하여 상온에서 30분정도 염색한 후, 100μL 1% acetic acid 로 4회 세척하고 상온에서 건조시켜 10 mM Tris-bufifer(pH J0.5)를 well당 100|1L씩 분주한 다음 550nM에서 흡광도를 측정하여 세포수를 측정하고 따로 세포 검량선을 작성하였다.
난소 절제 수술 : 체중이 180~200g 정도인 6주령의 Sprague Dawley(SD)계 암컷 랫드를 diethylether로 마취시킨 다음, 면도기로 등부분의 털을 깎아내고 에탄올 솜으로 잘 닦은 후, dorso-abdominal wall을 미세가위로 직경 1cm 정도 절개하였다. 지방으로 둘러싸인 난소 및 자궁을 핀셋으로 꺼내어 난소와 자궁의 경계를 봉합사로 잘 묶은 다음 난소를 완전히 잘라내고 봉합사로 내피를 봉합하고 autoclip2로 외피를 봉합한 다음 1주간 회복시킨 후 시험물질을 투여하였다.
랩 등 PVC 제품의 가소제인 DEHA의 에스트로겐활성을 검색하기 위하여 내분비계 장애작용 중 에스트로겐성 작용을 검색하는 대표적인 방법인 in vitro E-screen assay와 OECD 및 미국 EPA EDSTAC에서 권고하고 있는 in vivo 난소절제 랫드를 이용한 자궁비대반응시험(uterotrophic assay)을 실시하였다. 시험 결과 DEHA(5X lO'Mx 10^ M)fe- MCF-7세포의 중식을 유발하지 않았고 난소절제 랫드에 200mg/kg/day 용량까지 투여하여도 자궁 및 질 무게에 영향을 미치지 않았다.
0, 2, 20, 200 mg/kg/day의 용량으로 3일간 연속 피하주사하였다. 매일 체중을 측정하여 투여량을 산출하였으며 투약은 3일간 동일한 시간대에 시행하였다. 음성 대조군에는 com oil을 투여하였고, 양성 대조군에는 E2를 com oil에 녹여 투약직전에 조제하여 1.
25% 트립신 용액을 플라스크당 500 nL 첨가하여 MCF-7 세포가 플라스크 바닥에서 분리되면(1-2분 정도) 배지 5 ml* 넣어서 피펫팅하였다. 배지롤 15 mL 원심분리관(FALQON #352097)으로옮겨 원심분리시켜(1000rpm, 5분) 상징액을 흡인 제거한 다음, 세포가 남아 있는 원심분리관에 배지를 넣고 피펫팅하여 세포롤 단일화시켜 세포수를 측정하였다. 5X103 cells/well로 96well 배양판(Falcon #353072, Non-pyrogenic)에 분주한 후(well당 배지량 100 |JL) 배양판을 천천히 흔들어 세포가 균일하게 분산되도록 하고 5% CO2, 37P로 조절된 배양기에서 24시간 배양시킨 후, well에 들어 있는 배지를 흡인 .
사육된 4주령의 특정 병원체 부재(Specific Pathogen Free, SPF) Sprague-Dawley계 암컷 랫드를 2주간 순화시킨 후 사용하였다. 사육실은 온도 23± 1℃, 습도 55±5%, 명암주기 12시간으로 유지하였고, 순화기간 및 실험기간동안 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 동물의 식별은 꼬리에 표시를 하여 구분하였다.
5%가 되도록 조절하였다. 시료가 첨가된 96 weH platef- 5% CO2, 3TC로 조절된 배양기에서 6일간(144시간) 배양한 후, sulfortiodamine-B (SRB) assay로 세포 수를 측정하였다.
시험물질 제조 및 루여 : DEHA를 com oil로 희석하여 0, 2, 20, 200 mg/kg/day의 용량으로 3일간 연속 피하주사하였다. 매일 체중을 측정하여 투여량을 산출하였으며 투약은 3일간 동일한 시간대에 시행하였다.
시험방법 : 시험 하루 전 시험에 사용될 세포의 배지를 교환하고, 시험 당일에 세포가 들어 있는 25cm2 플라스크의 배지를 흅인 제거한 다음, PBS 완충액으로 1회 세정하였다. 0.
매일 체중을 측정하여 투여량을 산출하였으며 투약은 3일간 동일한 시간대에 시행하였다. 음성 대조군에는 com oil을 투여하였고, 양성 대조군에는 E2를 com oil에 녹여 투약직전에 조제하여 1.0Rg/kg/ day씩 피하로 투여하였다. 군당 동물수는 6수씩으로 하였다.
자궁 및 질의 무게 측정 : 마지막 시험 물질 투약 24시간 후인 4일째 되는 날 암컷 랫드를 경추 탈골 시키고 체중을 측정한 후 자궁과 질을 적출하여 자궁을 둘러싸고 있는 지방을 제거하였다. 지방 제거시 자궁 상피를 건드려 자궁내의 분비액이 유실되지 않도록 조심하였고, 자궁과 질의 경계부분을 절단하여 각각의 무게를 측정하였다.
있는 지방을 제거하였다. 지방 제거시 자궁 상피를 건드려 자궁내의 분비액이 유실되지 않도록 조심하였고, 자궁과 질의 경계부분을 절단하여 각각의 무게를 측정하였다. 자궁은 다시 4등분 정도 절단하여 자궁 내 분비액을 여지 (Whatman No.
직경 1cm 정도 절개하였다. 지방으로 둘러싸인 난소 및 자궁을 핀셋으로 꺼내어 난소와 자궁의 경계를 봉합사로 잘 묶은 다음 난소를 완전히 잘라내고 봉합사로 내피를 봉합하고 autoclip2로 외피를 봉합한 다음 1주간 회복시킨 후 시험물질을 투여하였다. 동물은 각 군당 6수씩을 사용하였다.
대상 데이터
지방으로 둘러싸인 난소 및 자궁을 핀셋으로 꺼내어 난소와 자궁의 경계를 봉합사로 잘 묶은 다음 난소를 완전히 잘라내고 봉합사로 내피를 봉합하고 autoclip2로 외피를 봉합한 다음 1주간 회복시킨 후 시험물질을 투여하였다. 동물은 각 군당 6수씩을 사용하였다.
barrier 시설 내에서 생산 . 사육된 4주령의 특정 병원체 부재(Specific Pathogen Free, SPF) Sprague-Dawley계 암컷 랫드를 2주간 순화시킨 후 사용하였다. 사육실은 온도 23± 1℃, 습도 55±5%, 명암주기 12시간으로 유지하였고, 순화기간 및 실험기간동안 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 동물의 식별은 꼬리에 표시를 하여 구분하였다.
세포 및 배지 : MCF-7 세포(BUS cell)는 E-screen assay를 확립 개발한 Soto 연구실에서 직접 분양받아 5% fetal bovine serum(FBS) 이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다.
시약
시험물질인 di-(2-ethylhexyl) adipate(DEHA)는 Wako Chemical Industries]Japan)에서, com oil, 17β-estradiol(E2), sodium bicarbonate, hydroxyapatite, Tris-HCl,DMSO 둥은 Sigma Chemical Company(MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
실험동물 : 실험동물은 식품의약품안전청 국립독성 연구소 barrier 시설 내에서 생산 . 사육된 4주령의 특정 병원체 부재(Specific Pathogen Free, SPF) Sprague-Dawley계 암컷 랫드를 2주간 순화시킨 후 사용하였다.
데이터처리
모든 실험결과는 MS-Excel(Vfer. Office 9가을 이용하여 one way analysis of variance(ANOVA)검정을 실시하여 유의성이 인정된 경우, Dunnett's test를 이용하여 대조군과 각 투여군간에 다중교를 실시하였다. JX0.
이론/모형
Sulforhodamine-B (SRB) assay: MCF-7 세포의 중식 정도를 측정하기 위하여 세포 단백질의 음이온과 SRB의 양이온이 결합하여 발색하는 원리를 이용한 SRB assay롤 사용하였다'찌. 6일간 배양후 96well 배양판의 배지를 흡인 .
성능/효과
3에 나타내었다. DEHA를 난소를 절제한 성숙 암컷에 0, 2, 20, 200 mg/kg/day의 용량으로 3일간 피하 투여할 때 자궁 및 질의 중량에 거의 영향을 미치지 못했는데 , 반면 양성대조물질인 E2(1.0 ㎍/kg/day) 투여군에서는 대조군과 비교할 때 습자궁(wet uterus), blotted 자궁 및 질의 중량이 각각 대조군의 5.2배, 2.8배 및 1.8 배씩 유의성있게 중가함을 볼 수 있었다.
2에 나타내었다. 내인성 여성 호르몬 물질로 잘 알려진 E2를 양성대조물질로 하여 에스트로겐 활성을 비교한 결과, DEHA는 시험농도(5X10-9~5X10-5M)에서 거의 에스트로겐 활성을 나타내지 않았으나, E2는 5X 10-14-5× 10, M 농도에서 MCF-7 세포의 증식을 일으켰으며 5×10-10 M에서 가장 큰 활성을 나타내었다.
In vitro에 결여되어 있는 대사계가 in vivo에는 존재하므로 화학물질이 대사되면서 그 작용에 차이를 가져올 수도 있으며 시험방법마다 민감성의 차이도 있을 수 있다. 따라서 내분비계 장애작용의 검색을 위해서는 여러 종류의 in vitro 및 in vivo 시험계를 사용한 시험을 실시하여 그 결과를 종합적으로 분석함으로써 내분비계 장애작용 여부를 결론지어야할 것으로 생각되나, 본 시험결과 DEHA는 in vitro E-screen assay 및 in vivo 자궁비대반응시험에서는 에스트로겐 활성이 없음을 확인할 수 있었다.
본 실험결과 adipate화합물인 DEHA는 에스트로겐성을 나타내지 않았으나, 본 연구실에서 실시한 E-screen assay 결과에서 7종의 프탈레이트류 화합물(DEHR BBP, DBP, DPP, DPrP, DCHP 및 DEP) 중 BBP, DEHP,DBP 및 DEP가 5μM에서 약한 에스트로겐 활성을 나타내었다(21).이중 BBP에 대한 결과는 Soto 등의 실험결과(17)와 일치하였으며 DEHP는 Blom 둥의 결과(22)와 유사하게 나타났다.
시험 결과 DEHA(5X lO'Mx 10^ M)fe- MCF-7세포의 중식을 유발하지 않았고 난소절제 랫드에 200mg/kg/day 용량까지 투여하여도 자궁 및 질 무게에 영향을 미치지 않았다. 따라서 본 실험결과 DEHA는 E-screen assay 및 자궁비대반응시험에서 에스트로겐성 작용이 없는 것으로 확인되었으나, 이들 물질의 에스트로겐성에 대한 결론을 내리기 위해서는 여러 종류의 in vitro 시험 data 및 in vivo 시험 data가 더 보충되어야 할 것으로 생각된다.
후속연구
시험 결과 DEHA(5X lO'Mx 10^ M)fe- MCF-7세포의 중식을 유발하지 않았고 난소절제 랫드에 200mg/kg/day 용량까지 투여하여도 자궁 및 질 무게에 영향을 미치지 않았다. 따라서 본 실험결과 DEHA는 E-screen assay 및 자궁비대반응시험에서 에스트로겐성 작용이 없는 것으로 확인되었으나, 이들 물질의 에스트로겐성에 대한 결론을 내리기 위해서는 여러 종류의 in vitro 시험 data 및 in vivo 시험 data가 더 보충되어야 할 것으로 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.