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문제 정의
- 더욱 민감한 자궁비대반응시험법을 찾기 위해 난소절제한 성숙랫드가 아닌 미성숙 랫드를 이용한 방법이 Jordan 등®, 에 의해 소개된 이후, raloxifene, 酒 nonylphenol2l) 등 다양한 물질에 대한 내분비장애 효과가 보고되고 있으며 이 검색법이 성숙 랫드를 이용하는 것보다 더 민감하다고 알려져 있다.0 본 실험에서는 미성숙 랫드를 이용한 자궁비대반응시험를 이용하여 DEHA의 내분비계장애물질로써의 작용유무 확인을 통해 DEHA의 안전성을 평가하고자 하였다.
제안 방법
- 실험동물의 자궁 및 간장에서의 BrdU 양성세포의 수를 영상분석장치를 통해 측정하였다. BrdU 표지세포 수는 1000개의 정상세포 당 면역양성세포의 개수를 대비하여 계산하였다.
- DEHA 투여에 따른 자궁내막 및 자궁근육의 증식을 측정하고자 H-E 염색을 실시한 자궁조직에서 자궁내막 높이와 자궁근육두께 및 자궁샘 개수를 영상분석 장치를 이용하여 측정하였다. 자궁비대반응시험을 시험한 암컷 랫드의 자궁에서 자궁내막의 높이는 양성대조군에서 음성대조군 및 시험물질 투여군에 대하여 유의성 있는 증가를 관찰하였으나 DEHA를 투여한 각 군에서 농도에 따른 군간의 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다.
- DEHA가 세포증식에 미치는 영향을 파악하기 위하여 BrdU(5-bromodeoxyuridine)에 대한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 실험동물의 자궁 및 간장에서의 BrdU 양성세포의 수를 영상분석장치를 통해 측정하였다.
- 525197)사에서 구매하여 사용하였다. DEHA는 com oil(Sigma, USA)에 용해한 후 40, 200, 1000mg/kg/day의 농도로 투여하였으며, 양성대조군은 estradiol-3-benzoate(EB, Sigma, USA)를 1 pg/kg/day 농도로 com oil에 용해한 후 투여하였다.
- DEHA의 각 농도별 장기의 조직학적 변화를관찰하기 위하여 전체 군에 대해 일반조직학적 방법으로 절편을 제작하여 hematoxylin-eosin 염색을 실시하여 병리조직학적으로 진단하였으며, 각 군의 병변 발생률을 분석 . 비교하였다.
- DEHA의 에스트로겐 효과를 관찰하기 위하여 민감도가 비교적 높은 것으로 알려진 immatured type-21 자궁비대반응시험끄을 수행하였다(Fig. 1). 생후 17일령의 암컷 SD 랫드를 체중의 편차를 가능한 줄이기 위해 2차선별하여 각 6마리씩 5군으로 임의로 설정하였으며, 군분리 후 시험물질을 피하로 투여하였다.
- DEHA의 체내잔류정도를 평가를 위하여 혈중 hormone level을 측정하였다. 실험동물의 follicle stimulating hormone(FSH) 와 luteinizing hormone(LH) level을 RAT FSH ELISA kit(BioCode, USA)를 이용하여 측정 .
- DEHA의 투여에 따른 세포증식능을 판단하기 위하여, 부검 1시간 전 BrdU를 100mg/kg 용량으로 복강에 투여하였으며, 면역조직화학적 검사를 실시한 결과는 Table 3과 Fig. 5, 6에 제시하였다. BrdU는 구조적으로 티민과 비슷하여 새로 합성되는 DNA에 삽입될 수 있다.
- 최종 투여 24시간 후 체중측정 후 투여 순서대로 안락사 시켰으며, 자궁, 질, 난소 등의 장기를 적출하고, 지방을 제거한 뒤 정확한 무게를 측정하였다. 그 외 간장, 갑상샘, 뇌하수체, 부신 등의 내분비계 관련장기를 적출하여 병리학적 평가를 위하여 10% 중성포르말린에 고정하였다.
- 부검시 절취한 장기를 10% 중성포르말린에 고정시킨후 ethyl alcohol에 단계적으로 탈수 및 투명화 처리를거쳐 파라핀에 포매한 뒤 3~4|im의 연속 절편을 제작하였다. DEHA의 각 농도별 장기의 조직학적 변화를관찰하기 위하여 전체 군에 대해 일반조직학적 방법으로 절편을 제작하여 hematoxylin-eosin 염색을 실시하여 병리조직학적으로 진단하였으며, 각 군의 병변 발생률을 분석 .
- 1). 생후 17일령의 암컷 SD 랫드를 체중의 편차를 가능한 줄이기 위해 2차선별하여 각 6마리씩 5군으로 임의로 설정하였으며, 군분리 후 시험물질을 피하로 투여하였다. 음성대조군과 양성대조군을 설정하고 양성대조군은 EB를 1 gg/kg/day 농도로 투여하였으며, 시험물질 투여군은 DEHA를 40, 200, lOOOmg/kg/day 농도로 투여하였다.
- 식품포장용 랩의 주성분으로 사용되었던 DEHA의 내분비장애작용을 평가하고자, 통상 사용되는 난소적출성체를 이용하는 자궁비대반응시험보다 더 민감도가 높은 것으로 보고되어진 미성숙 암컷 랫드를 이용한 자궁비대반응시험을 실시하였다. Estrogen 성 작용을 평가하기 위한 본 실험에서 생식기계의 무게증가나 조직병리학적 평가 및 자궁내막 및 지궁근육의 두께, 자궁샘의 수에서도 특이적인 변화는 관찰되지 않았다.
- 생후 18일령의 SD 암컷 랫드를 식품의약품안전 청 국립독성과학원 실험동물자원실로부터 분양받아 실험에 사용하였으며, 각 실험동물은 정확한 체중을 측정하여 체중차가 5 g 내외의 동물을 1차 선별한후 2일 후 체중 재측정을 통해 체중차 5 g 내외 동물을 2차로 선별하여 최종 30마리를 실험에 사용하였다. 실험동물은 임의로 각 6마리씩 5군으로 나누어 사육하였고 실험기간동안 사육환경은 23土21, 상대습도 55 土 10%를 유지하였다. 인공조명(12시간 점등, 12시간 소등) 하에서 사육하였_으며, 사료는 soy-bean oil을 함유하지 않은 AIN-76A (Dyets.
- level을 측정하였다. 실험동물의 follicle stimulating hormone(FSH) 와 luteinizing hormone(LH) level을 RAT FSH ELISA kit(BioCode, USA)를 이용하여 측정 . 분석하였다.
- 실시하였다. 실험동물의 자궁 및 간장에서의 BrdU 양성세포의 수를 영상분석장치를 통해 측정하였다. BrdU 표지세포 수는 1000개의 정상세포 당 면역양성세포의 개수를 대비하여 계산하였다.
- 생후 17일령의 암컷 SD 랫드를 체중의 편차를 가능한 줄이기 위해 2차선별하여 각 6마리씩 5군으로 임의로 설정하였으며, 군분리 후 시험물질을 피하로 투여하였다. 음성대조군과 양성대조군을 설정하고 양성대조군은 EB를 1 gg/kg/day 농도로 투여하였으며, 시험물질 투여군은 DEHA를 40, 200, lOOOmg/kg/day 농도로 투여하였다. 투약 기간은 생후 20, 21, 22일령간 3일 동안 동일시간 대에 하루 한 번 투여하였다.
- 실험동물은 임의로 각 6마리씩 5군으로 나누어 사육하였고 실험기간동안 사육환경은 23土21, 상대습도 55 土 10%를 유지하였다. 인공조명(12시간 점등, 12시간 소등) 하에서 사육하였_으며, 사료는 soy-bean oil을 함유하지 않은 AIN-76A (Dyets. USA)사료를 팰릿 형태로제작하여 자유급이 하였고, 정제수를 자유 급수시켰다.
- 투약 기간은 생후 20, 21, 22일령간 3일 동안 동일시간 대에 하루 한 번 투여하였다. 최종 투여 24시간 후 체중측정 후 투여 순서대로 안락사 시켰으며, 자궁, 질, 난소 등의 장기를 적출하고, 지방을 제거한 뒤 정확한 무게를 측정하였다. 그 외 간장, 갑상샘, 뇌하수체, 부신 등의 내분비계 관련장기를 적출하여 병리학적 평가를 위하여 10% 중성포르말린에 고정하였다.
- 음성대조군과 양성대조군을 설정하고 양성대조군은 EB를 1 gg/kg/day 농도로 투여하였으며, 시험물질 투여군은 DEHA를 40, 200, lOOOmg/kg/day 농도로 투여하였다. 투약 기간은 생후 20, 21, 22일령간 3일 동안 동일시간 대에 하루 한 번 투여하였다. 최종 투여 24시간 후 체중측정 후 투여 순서대로 안락사 시켰으며, 자궁, 질, 난소 등의 장기를 적출하고, 지방을 제거한 뒤 정확한 무게를 측정하였다.
대상 데이터
- DEHA(bis(2-ethylhexyl) adipate, Cas No. 103-23-1, purity 99%)는 Aldrich(Cat No. 525197)사에서 구매하여 사용하였다. DEHA는 com oil(Sigma, USA)에 용해한 후 40, 200, 1000mg/kg/day의 농도로 투여하였으며, 양성대조군은 estradiol-3-benzoate(EB, Sigma, USA)를 1 pg/kg/day 농도로 com oil에 용해한 후 투여하였다.
- 진행되었다. 생후 18일령의 SD 암컷 랫드를 식품의약품안전 청 국립독성과학원 실험동물자원실로부터 분양받아 실험에 사용하였으며, 각 실험동물은 정확한 체중을 측정하여 체중차가 5 g 내외의 동물을 1차 선별한후 2일 후 체중 재측정을 통해 체중차 5 g 내외 동물을 2차로 선별하여 최종 30마리를 실험에 사용하였다. 실험동물은 임의로 각 6마리씩 5군으로 나누어 사육하였고 실험기간동안 사육환경은 23土21, 상대습도 55 土 10%를 유지하였다.
데이터처리
- Expression of homone levels in female rats administrated with DEHA. Hormone levels were measured by ELISA and statistic method was assessed by Dunnett's t-test. (A) serum LH levels, (B) serum FSH levels.
- 시험기간 중 측정한 체중변화, 주요장기 무게, 호르몬 농도분석 결과 및 면역조직학적 결과는 SAS JMP 통계프로그램을 이용한 Dunmet's t-test를 실시하였으며, 조직 학적 병변에 대한 결과는 동 프로그램의 Chi- Square test를 이용하여 통계적 유의성을 검증하였다.
성능/효과
- DEHA 투여에 따른 독성평가 및 내분비관련 장기의변화를 판단하기 위하여 조직병리학적 평가를 실시한결과, DEHA 투여농도가 높아질수록 간장의 염증소견이 증가하는 경향을 보였으나, 간장을 포함하는 모든장기에서 통계학적 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다. 특히 음성 및 양성대조군을 포함하는 모든 군의 간장에서 fatty change가 관찰되었는데 이는 com oil을용매로 사용했기 때문으로 생각된다.
- 실시하였다. Estrogen 성 작용을 평가하기 위한 본 실험에서 생식기계의 무게증가나 조직병리학적 평가 및 자궁내막 및 지궁근육의 두께, 자궁샘의 수에서도 특이적인 변화는 관찰되지 않았다. 세포증식능을 평가하기 위한 BrdU 양^반응세포 수도 큰변화가 관찰되지 않아, DEHA는 미성숙 암컷 랫드에대하여 내분비장애작용을 가지지 않는 것으로 생각된다.
- 2). 또한 혈청내 FSH 수치 역시 DEHA 40 mg 및 200 mg 투여군에서다소 증가하는 경향은 나타내었으나 DEHA 투여농도에 따른 유의성 있는 변화는 관찰되지 않아 DEHA 투여에 의한 암컷 미성숙 랫드 자궁비대반응시험 실시에서 혈중 호르몬의 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 2). 이는 이전 성숙 암컷 랫드에 대해 수행된 자궁 비대 반응시험의 내분비계 장애물질 검색시험법 결과와, 분만 전후 DEHA 노출이 암수 신생랫드의 혈청내 FSH 및 LH에 영향을 미치지 않았다께는 보고와 일치하였다.
- DEHA의 투여농도에 따른 간장 상대장기무게 변화는 관찰되지 않았으나 DEHA 고농도투여군에서 신장 상대장기무게의 유의성 있는 증가가 관찰되었다. 암컷 생식기 장기인 난소, 질, 자궁의 무게를 측정한 결과양성대조군의 자궁 상대장기무게가 증가하였으며, 특히 DEHA 고농도군인 1000 mg/kg 투여군에서 난소 무게의 유의성 있는 증가가 관찰되었으나, 그 외 다른 생식기계통의 상대장기무게의 변화가 관찰되지 않았다(Table 1). 생식기계통 중 난소만의 무게변화를 바탕으로 에스트로겐 작용 여부를 평가하기는 어려울 것으로 판단되며, 이전의 DEHA에 대한 랫드 발암성시험과, 암컷 성체를 이용한 자궁비대반응시험에서는 생식기 계통에서의 무게변화가 나타나지 않은 것으로 보고되어 있어23) DEHA 투여에 따른 생식기계통 장기무게의 변화로 인하여 내분비계통 장기에 독성을 나타냈다고 보기 어렵다.
- 자궁에서는 자궁내막상피세포와 자궁샘근처 등에서 하나 또는 두세 개의 표지세포가 흩어져 관찰되었으며, DEHA를 투여한 각 군에서는 차이가 발견되지 않았다. 이상에서 자궁비대반응시험 결과, 간과 자궁을 비롯한 주요 생식기 장기에서 시험물질 투여에 따른 BrdU 양성세포 수의 유의적 변화가 관찰되지 않아, DEHA 투여로 인한 실험동물의 생식세포 및 간장에서의 세포증식능에 대한 영향은 없는 것으로 평가된다.
- 또한 질에서는 DEHA 200mg/kg 투여군에서 focal inflammation0] 1건 관찰되었으나, 통계적 유의성은 없었다. 이상의 결과로 볼 때 DEHA의 미성숙 랫드에서의 자궁비대반응시험 수행결과, 시험물질에 의한조직병리학적 변화는 관찰되지 않았다(Table 2).
- 자궁비대반응시험에서 암컷 랫드 혈청을 분리하여 혈액 내 존재하는 호르몬 발현을 ELISA로 측정한 결과, 혈청 내 LH 수치는 DEHA 40 mg 투여군에서 다소증가하는 경향은 관찰되었으나 대조군에 비하여 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 2). 또한 혈청내 FSH 수치 역시 DEHA 40 mg 및 200 mg 투여군에서다소 증가하는 경향은 나타내었으나 DEHA 투여농도에 따른 유의성 있는 변화는 관찰되지 않아 DEHA 투여에 의한 암컷 미성숙 랫드 자궁비대반응시험 실시에서 혈중 호르몬의 변화는 관찰되지 않았다(Fig.
- 이용하여 측정하였다. 자궁비대반응시험을 시험한 암컷 랫드의 자궁에서 자궁내막의 높이는 양성대조군에서 음성대조군 및 시험물질 투여군에 대하여 유의성 있는 증가를 관찰하였으나 DEHA를 투여한 각 군에서 농도에 따른 군간의 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다. 또한 자궁근육의 두께와 자궁점막 내의 샘 개수에 대한 분석결과, 역시 물질투여에 따른 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다(Fig.
후속연구
- 세포증식능을 평가하기 위한 BrdU 양^반응세포 수도 큰변화가 관찰되지 않아, DEHA는 미성숙 암컷 랫드에대하여 내분비장애작용을 가지지 않는 것으로 생각된다. 그러나, 최근 OECD에서는 내분비장애물질을 평가하기 위한 좀더 강화된 가이드라인들을 제시하고 있으며, 기존의 3~10일간의 시험물질투여기간을 28일로 늘려 시험물질의 노출시간 연장 및 자궁비대반응시험의짧은 시험기간에 따른 생식주기 측정의 어려움 등의 단점을 보완하고 있으므로产꾜)향후 DEHA를 포함한 이들 물질에 대한 내분비장애작용을 정확히 평가하기 위해서는 in vivo 및 in vitro 시험 등의 주가 시험이 필요할 것으로 생각된다.
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