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문제 정의
- 투여법은 생체내에서 효소등에 의한 대사로 인하여 대사체와 미변화 활성물질의 구분이 요구되며, ICAP방법8-9)은 아주 복잡하고 정교한 수술법을 필요로 하기 때문에, 흰쥐 정도의 크기를 가진 동물에서만 가능하며, 물질에 따라 흰쥐에 적용시킬 수 없는 경우와 흰쥐에서 생리활성을 나타내지 않는 물질에 대해서는 BBB 투과를 검토하는데 생쥐나 원숭이 등을 사용하여야한다. 따라서 본 연구에서는 ICAP법의 단점을 보완하여 생쥐에서의 실험과 소량의 신약을 평가하기 위한 scree-ning법을 개발하는데 적용하기 위하여 ICAP법을 변형시켜 그 투과법의 확립을 시도하고, 뇌질환 치료 약물로서의 가능성이 있는 taurine과 중성 아미노산 담체 수송계의 대표물질인 phenylalanine, 뇌혈관용적 표지체인 sucrose, 펩타이드성 물질인 oxytocin 등에 대한 생쥐에서의 BBB 투과성을 흰쥐에서 ICAP법으로 시행하여 얻어진 결과와 비교 검토하였다.
- 물론 생쥐에서도 확대경을 사용하고 3배이상의 시간과 노력을 투여하면 ICAP법을 사용하여 약물의 BBB투가성 평가가 가능함을 다른 실험 (mouse transferrin monoclonal antibody 실험-추후투고예정)에서 확인하였지만, 본 연구에서는 생쥐에서만 평가가 가능한 특이성 약물 또는 소량 합성된 신약 후보물질의 BBB투과성 평가에 대비하여 CCAP법의 적용이 가능한 지를 흰쥐에서의 ICAP법과 비교검토하여 보고 하고자 하였다.
제안 방법
- 동물 실험실 온도는 22-25℃, 습도는 50-60%, 조명 시간은 12시간 (07:00-19:00)으로 유지하였다.
- 약물의 pharmacokinetic piMle을 측정하기 위하여, 이미 보고된 논문의 방법10)과 마찬가지로 ketamine (100mg/kg)과 xylazine (2mg/kg)의 혼합액으로 근육마취시킨 후 마취시킨 25-30g의 웅성 생쥐의 총경동맥에 폴리에칠렌관 (PE-10, Natsume Co., 정도산업)을 삽입하였다. [3H]Taurine (3 μCi/생쥐)과 [14C]sucrose (1 μCi/생쥐)를 Ringer's-Hepes 완충액 (RHB, pH 7.
- , 정도산업)을 삽입하였다. [3H]Taurine (3 μCi/생쥐)과 [14C]sucrose (1 μCi/생쥐)를 Ringer's-Hepes 완충액 (RHB, pH 7.4)에 잘 혼합한 후, 경정맥을 통하여 순시 (1초이하)에 약액 50μl를 투여하였다. 그 후 총경동맥으로부터 경시적으로 0.
- 4)에 잘 혼합한 후, 경정맥을 통하여 순시 (1초이하)에 약액 50μl를 투여하였다. 그 후 총경동맥으로부터 경시적으로 0.25, 1, 2, 5, 15, 30 및 60분에 50μl의 혈액을 채취한 후sodium heparin (100 unit/ml)이 함유된 생리식염수 50μl로 체액을 보충하였다. 채취한 혈액을 원심분리하여 얻어진 혈장중의 약물의 방사활성을 가용화제와 방사성물질 측정액 (hionic-fluor)을 가한 후, 3H/14C double-isotope liquid scintillation counting법에 의하여 측정하였다.
- Plasma clearance (CL), steady-state에서의 apparent volu-me of distribution (Vdss), 혈장중 농도-시간 곡선하면적 (area under the plasma concentration-time curve, AUC)과 평균체류시간 (mean residence time, MRT)은 A1, A2, k1 k2로부터 구하였다.11)
- 마취시킨 200-300g의 웅성흰쥐의 목부위를 절개하여 이미 보고한 논문의 방법대로2) 혈관들을 분리하여 전기결찰하였다. 오른쪽 외경동맥에 PE-10관을 삽입하여 infusion pump에 연결하였다.
- Kreb's-Hen- seleit buffer에 [3H]phenylalanine (3 μlCi/ml)과 [14C]sucrose (1 μCi/ml)를 잘 혼합하여 4 ml/min으로 infusion함과 동시에 총경동맥을 수술실로 결찰하였다. Infusion 후 정확히 15초가 되었을 때 즉시 단두하여 뇌를 적출하고, 균질화하여 무게를 측정하였다. 뇌의 homogenate를 가용화제로 용해시킨후 [3H] 및 [14C]의 방사활성을 측정하였다.
- Infusion 후 정확히 15초가 되었을 때 즉시 단두하여 뇌를 적출하고, 균질화하여 무게를 측정하였다. 뇌의 homogenate를 가용화제로 용해시킨후 [3H] 및 [14C]의 방사활성을 측정하였다.
- Kreb's-Henseleit buffer에 [3H]taurine과 [14C]sucrose를 잘 혼합하여 ICAP법에서 사용하는 관류속도와 동물의 체중에 비례하여 생쥐에서는 2 ml/min으로, 흰쥐에서는 20ml/min으로 infusion하였다. Infusion한 후 정확히 10, 15, 30초가 되었을 때 즉시 단두하여 뇌를 적출하고, 균질화하여 무게를 측정하였다. [3H]taurine대신 [3H]phenylalanine 및 [3H]oxytocin도 같은 방법으로 실험하여 infusion한 후 15초에서 단두하였다.
- [3H]taurine대신 [3H]phenylalanine 및 [3H]oxytocin도 같은 방법으로 실험하여 infusion한 후 15초에서 단두하였다. 뇌의 homogenate를 용해시킨 후 [3H] 및 [14C]의 방사활성을 측정하였다.
- 뇌 관문 (BBB) 투과성 본 실험에서는 [3H]phenylalanine과 [14C]sucrose를 15초 동안 흰쥐의 brain에 4ml/min의 속도로 perfiision 했을 때의 brain distribution volume (VD)을 측정하였다. 분자량이 165이며 뇌모세혈관에 존재하는 담체 수송계인 large neutral amino acid (LNAA) system에 의해 수송되는 phenylalanine이 158±33 μl/g으로 가장 큰 값을 나타내었고 이것을 PS값으로 계산하면 608±129 μl/nim/g으로 이미 보고된 논문 값과 유사한 결과를 나타내었다.
- 3H]Taurine과 [14c]sucrose를 10초, 15초, 30초 동안 생쥐의 brainy CCAP 법으로 2ml/min의 속도로 perfhsion했을 때의 brain distribution volume (VD)을 측정하였다. [3H]Taurine과 [14C]sucrose를 CCAP method로 투여한 경우,perfusion time이 증가함에 따라 [14C]sucrose의 brain uptakes 증가하지 않고 거의 일정하나, [3H]taurine은 직선성을 나타내며 증가하였다(Figure 2).
- 수술하는 동안에는 thermal blanket을 이용하여 흰쥐의 체온을 37℃로 유지하였다. Kreb's-Hen- seleit buffer에 [3H]phenylalanine (3 μlCi/ml)과 [14C]sucrose (1 μCi/ml)를 잘 혼합하여 4 ml/min으로 infusion함과 동시에 총경동맥을 수술실로 결찰하였다. Infusion 후 정확히 15초가 되었을 때 즉시 단두하여 뇌를 적출하고, 균질화하여 무게를 측정하였다.
대상 데이터
- 3H]Taurine (specific acitivity; 24.1 Ci/mmol), [3H]phe-nylalanine (92.0 Ci/mmol), [3H]oxytocin (44.5 Ci/mmol), [14C]sucrose (44.5 Ci/mmol)는 DuPont NEN제품 (부경사, 서울)을 구입하여 사용하였다.
- Inc.을, 마취제로 사용한 염산 ketamine은 유한양행 제품을, 근이완제인 xylazine은 Loyd 실험실 제품 (종로약국, 서울)을 각각 구입하여 사용하였다. 조직 용해제인 soluene 350과 방사활성측정에 사용되는 hionic-fluor는 Packard제품 (새한산업, 서울)을 사용하였고, 기타 시약은 일급 이상의 제품을 덕산이화학 (주)에서 구입하여 사용하였다.
- 을, 마취제로 사용한 염산 ketamine은 유한양행 제품을, 근이완제인 xylazine은 Loyd 실험실 제품 (종로약국, 서울)을 각각 구입하여 사용하였다. 조직 용해제인 soluene 350과 방사활성측정에 사용되는 hionic-fluor는 Packard제품 (새한산업, 서울)을 사용하였고, 기타 시약은 일급 이상의 제품을 덕산이화학 (주)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 기기는 원심분리기 (한일 과학 산업 (주), Union 55R, Micro 17TR), infusion/withdrawl pump (KD Scientific, model 210), thermal blanket (temperature control unit, Letica, HB10 1/2), β-radioscintilating counter (Beckman, LS6500), bipolar coagulator (Union Medical Co.
- 조직 용해제인 soluene 350과 방사활성측정에 사용되는 hionic-fluor는 Packard제품 (새한산업, 서울)을 사용하였고, 기타 시약은 일급 이상의 제품을 덕산이화학 (주)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 기기는 원심분리기 (한일 과학 산업 (주), Union 55R, Micro 17TR), infusion/withdrawl pump (KD Scientific, model 210), thermal blanket (temperature control unit, Letica, HB10 1/2), β-radioscintilating counter (Beckman, LS6500), bipolar coagulator (Union Medical Co., Surgitor UM 880-A), hot plate/stirrer (Corning, PC320), 단두기 (대종기기), pH meter (Mettler, delta 340), balance (Sar-torius, AC2115), 수술 기구 등이다.
- ICR (Institute of Cancer Research)계 웅성 생쥐와 SD (Sprague-Dawley)계 웅성 흰쥐를 제일 상사와 삼육 상사에서 각각 구입하여 시판 배합 사료와 물을 자유로이 공급하면서 1-2 주 가량 동물 실험실 (숙대 약대 동물실)에서 적응시킨 후 약 30g의 생쥐와 200-300g의 흰쥐를 실험에 사용하였다. 동물 실험실 온도는 22-25℃, 습도는 50-60%, 조명 시간은 12시간 (07:00-19:00)으로 유지하였다.
이론/모형
- 25, 1, 2, 5, 15, 30 및 60분에 50μl의 혈액을 채취한 후sodium heparin (100 unit/ml)이 함유된 생리식염수 50μl로 체액을 보충하였다. 채취한 혈액을 원심분리하여 얻어진 혈장중의 약물의 방사활성을 가용화제와 방사성물질 측정액 (hionic-fluor)을 가한 후, 3H/14C double-isotope liquid scintillation counting법에 의하여 측정하였다. 약액 투여 1시간 후, 즉시 단두하여 뇌, 간, 신장, 심장 및 폐를 적출하여 균질화시킨 후 일정량을 취하여 칭량한 다음, 각 조직의 방사활성을 측정하였으며 pharmacokinetic para-metersfe- Gibaldi와 Perrier의 정의에 따라 구하였다.
- 채취한 혈액을 원심분리하여 얻어진 혈장중의 약물의 방사활성을 가용화제와 방사성물질 측정액 (hionic-fluor)을 가한 후, 3H/14C double-isotope liquid scintillation counting법에 의하여 측정하였다. 약액 투여 1시간 후, 즉시 단두하여 뇌, 간, 신장, 심장 및 폐를 적출하여 균질화시킨 후 일정량을 취하여 칭량한 다음, 각 조직의 방사활성을 측정하였으며 pharmacokinetic para-metersfe- Gibaldi와 Perrier의 정의에 따라 구하였다.11) Phar-macokinetic parameters- plasma radioactivity data를 UCLA Health Science Computing Facilities에서 개발한 derivative-free nonlinear regression analysis (PARBMDR Biomedical Compute P Series)를 이용하여 biexponential equation에 적용하여 계산하였다.
- 약액 투여 1시간 후, 즉시 단두하여 뇌, 간, 신장, 심장 및 폐를 적출하여 균질화시킨 후 일정량을 취하여 칭량한 다음, 각 조직의 방사활성을 측정하였으며 pharmacokinetic para-metersfe- Gibaldi와 Perrier의 정의에 따라 구하였다.11) Phar-macokinetic parameters- plasma radioactivity data를 UCLA Health Science Computing Facilities에서 개발한 derivative-free nonlinear regression analysis (PARBMDR Biomedical Compute P Series)를 이용하여 biexponential equation에 적용하여 계산하였다.
성능/효과
- %ID/ml로 표시하여 Figure 1에 나타내었다. 이 결과로부터 [3H]taurine과 [14c]sucrose는 모두 biexponential equa-tion에 따라 plasma compartment로부터 빠르게 소실하였으며, 사용한 동물의 종차에 따라 그 절대값의 차이는 있으나 [3H]taurine과 [14C]sucrose가 유사한 양상으로 혈장중에서 소실되고 있음을 알 수 있다. 흰쥐와 생쥐에서 [3H]taurine의 혈액-뇌 관문 (BBB) 고유 투과 상수인 PS 값은 각각 7.
- 2배 큰값을 나타내었다. 따라서 PS 값과 AUC의 곱에 의해 결정되어지는 [3H]taurine의 뇌투과량 (%ID/g)은 생쥐에서 약 9.0배가 큰 것으로 종의 차이를 나타내었다(Table Ⅰ). 생쥐에서의 taurine의 체내동태에 대해서는 [3H]taurine의 혈장중 전신 clearance (CL)가 39.
- 분자량이 165이며 뇌모세혈관에 존재하는 담체 수송계인 large neutral amino acid (LNAA) system에 의해 수송되는 phenylalanine이 158±33 μl/g으로 가장 큰 값을 나타내었고 이것을 PS값으로 계산하면 608±129 μl/nim/g으로 이미 보고된 논문 값과 유사한 결과를 나타내었다. 12) 또한 taurine에 있어서도 다른 논문에서 보고한 PS값13-14) (약 70-120 μl/mim/g)과 유사한 66 ± 8 μl/mim/g을 나타내었고 sucrose와 oxytocin의 BBB투과는 거의 나타나지 않았다 (Table Ⅲ).
- [14C]Sucrose의 뇌혈관 분포용적으로 보정한 [3H]tau-rine의 pemeability surface-area product (PS)값은 15초에서 최대를 나타내었고 그 이후에 급속히 감소하는 경향을 보이는데 이것은 이미 연구되어진 논문에서 보고된 사실과 일치하며,13) 뇌혈관의 세포질 부위에서 혈액 쪽으로 tawine이 빠르게 efflux되는 것으로 사료된다(Figure 3). 생쥐에서 CCAP법을 사용한 경우와 흰쥐에서 ICAP법을 사용한 경우의 결과는 10초, 15초, 30초 모두에서 거의 비슷한 taurine의 뇌분포용적을 나타내었다(Figure 4). 이것은 두가지 방법에 차이가 없음을 나타냄으로써 생쥐에서 CCAP법이 간편하게 사용할 수 있는 가능성을 시사하고 있다.
- 이와같은 결과는 본 연구에서도 동일하게 나타나 본 연구방법의 타당성이 입증되었다. 또 sucrose는 plasma volume marker로 뇌로 거의 들어가지 않으며, 따라서 다른 물질과의 투과 정도를 비교하기 위한 기준 물질로 사용하였으며, 분자량에 따른 뇌투과 효과를 검토하기 위하여 진통효과를 나타내는 고분자 물질인 oxytocin을 사용하여 같은 실험을 한 결과 다른 peptide성 약물과 마찬가지로 뇌로의 투과가 거의 나타나지 않음을 알 수 있었다.20-23)
- 한편, [3H]taurine은 생쥐에서 뇌로 관류한 후 15초에서 최대의 PS값을 보였으며, 그 이후에는 뇌에서 혈액 쪽으로의 빠른 efflux 인하여 급격히 감소되었다. 또한 다양한 분자량의 서로 다른 4가지 물질을 생쥐에서 in-ternal carotid artery perfusion (ICAP)법을 변형시킨 com-mon carotid artery perfusion (CCAP)법으로 적용시켜 각 물질의 뇌투과 클리어런스를 검토한 결과, 흰쥐에서 ICAP법을 사용하였을 때와 거의 같은 값을 나타내기 때문에 생쥐에는 CCAP법을 적용함으로써 빠르고 간편하게 소량으로 약물의 뇌투과성을 검토할 수 있다고 사료된다.
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