[논문]청열약 추출물들의 아세틸콜린에스테라제 저해와 베타아밀로이드 펩티드 응집 억제 효능

권영이

Abstract ▼ AI-Helper

Inhibition of acetylcholinesterase and amyloid beta(1-42) peptide is good drug targets for Alzheimer's disease therapeutics. Among the twenty enthusiasm reducing herbals, the 70% methanol extracts (1 mg/ml) of Moutan Radicis Cortex and Forsythiae Fructus showed 91.5% and 85.3% about acethylcholinest...

Inhibition of acetylcholinesterase and amyloid beta(1-42) peptide is good drug targets for Alzheimer's disease therapeutics. Among the twenty enthusiasm reducing herbals, the 70% methanol extracts (1 mg/ml) of Moutan Radicis Cortex and Forsythiae Fructus showed 91.5% and 85.3% about acethylcholinesterase inhibition, respectively. The extracts (1 mg/ml) of Coptidis Rhizoma and Paeoniae Radix Rubra showed more than 85% inhibition rate against amyloid beta (1-42) peptide aggregation. The neuroprotective effect of the extracts (1 mg/ml) of Moutan Radicis Cortex, Forsythiae Fructus and Paeoniae Radix Rubra showed 90.0%, 87.4% and 85.1% to compare with amyloid beta (1-42) peptide treated cells (IMR-32), respectively. Three herbs, Moutan Radicis Cortex, Forsythiae Fructus and Paeoniae Radix Rubra are promising candidates from natural products for development of Alzheimer's disease therapeutics.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

5%의 순으로 활성을 나타내었으며, 하고초, 결명자, 생지황, 자근, 황금, 황백, 고삼, 노근은 거의 활성이 나타나지 않았다. 따라서, 비교적 생리활성을 나타낸 생약인 목단피, 치자, 적작약, 연교, 황련 추출물에 대한 신경세포 보호능을 시험하여, 치매치료에 효능을 가질 수 있는지에 대하여 검토하기로 하였다. 목단피의 주성분은 phenol류, monoterpene glycoside류, tanin류 및 stilbene류이며 알려진 약리작용으로는 항균, 항바이러스, 항염, 통경, 진정, 항산화 및 혈압강하작용이 있으며, 돌연변이 억제작용이 있는 것으로 알려져 있다.
이에 본 저자는 청열약의 양혈작용에 관심을 가지게 되었고, 치매와의 연관성을 검토하기 위하여 청열약 중 사용빈도수가 비교적 높은 생약 20종의 70% 메탄올 추출물 1 mg/ml 농도에서 치매치료에 효과적인 약물표적인 아세틸콜린에스테라제 저해작용과 Aβ1-42 펩티드 응집 저해 효능을 검색하였고, 그 시험결과를 Table I에 나타내었다.
이에 본 저자는 청열약이 치매치료에 효능을 나타내는지 검토하기 위하여 청열약 중 사용빈도수가 비교적 높은 생약인 목단피, 지모, 치자, 하고초, 금은화, 진피, 죽엽, 결명자, 적작약, 생지황, 연고, 포공영, 어성초, 자근, 황련, 황금, 황백, 모근, 고삼, 노근 등 20종 생약 추출물에 대하여 아세틸콜린에스테라제저해 효능과 베타아밀로이드 펩티드 응집억제효능을 시험하였고, 이들 생약 중 비교적 효능이 좋은 목단피, 치자, 적작약, 연교, 황련에 대한 신경세포보호능을 시험하여 약간의 지견을 얻었기에 이를 보고하고자 한다.

제안 방법

Aβ1-42응집억제 정도를 측정하기 위하여 0.01 M 인산소다완충용액 92.5 µl에 일정농도로 만든 생약 추출물 5 µl 씩 가하고, 5 µM Aβ1-42 2.5 µl를 가한 뒤, 37℃에서 26시간 배양하여 응집시키고, 5 µM thioflavinT 2,000 µl를 가하여 형광 분광 분석기로 측정하였다.
Acetylcholinesterase 저해 활성 측정은 Ellman법을 변형하여 행하였다. 효소는 일정량씩 분주하여, −80℃하에서 보관하였으며, 최종 농도는 0.
배양된 IMR-32 세포를 9×104 cells/cm2 농도로 96-well plate에 심고 2시간 동안 안정화 후 beta-amyloid 단독처리군, betaamyloid (최종 농도 20 uM/0.1% acetic acid) 와 천연물 추출물들을 각각 0.1 mg/ml 농도로 같이 처리한 군으로 나누어 48시간동안 37, 5% CO2 상태에서 세포를 배양하였다.
효소는 일정량씩 분주하여, −80℃하에서 보관하였으며, 최종 농도는 0.03 unit의 농도로 사용하였으며, 기질은 0.1 M의 sodium phosphate buffer (pH 8.0)에 녹인 1000 µM의 acetylcholine iodide를 사용하였으며, 발색 시약은 39.6 mg 의 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)와 15 mg의 sodium bicarbonate를 0.1 M의 sodium phosphate buffer (pH 7.0) 10 ml에 녹여 제조하였다.

대상 데이터

베타아밀로이드의 응집 정도를 측정하는데 사용한 베타아밀로이드 (Aβ1-42)는 미국의 아메리칸 펩티드사(American Peptide Co. USA)의 제품을, thioflavinT, phosphate buffered saline tablet, MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]는 미국의 시그마 화학 회사의 제품을 사용하였으며, 기타 시약은 특급의 시약을 사용하였다.
사람 신경세포인 IMR-32 cell은 ATCC에서 구입하였고, 10% heat-inactivated fetal calf serum (Gibco BRL, Gaithersburg, Md., USA), penicillin (100 units/ ml), and streptomycin (100 g/ml) 첨가된 EMEM (ATCC, USA) 배지에서 37, 5% CO₂ 상태로 대수 증식기까지 배양하였다. 배양된 IMR-32 세포를 9×10⁴ cells/cm² 농도로 96-well plate에 심고 2시간 동안 안정화 후 beta-amyloid 단독처리군, betaamyloid (최종 농도 20 uM/0.
실험에 사용한 청열약에 속하는 생약인 목단피, 지모, 치자, 하고초, 금은화, 진피, 죽엽, 결명자, 적작약, 생지황, 연고, 포공영, 어성초, 자근, 황련, 황금, 황백, 모근, 고삼, 노근 등 20종 생약은 경동시장에서 포장된 제품을 구입하였다. 각각의 생약은 70% 메탄올을 추출 용매로 사용하여 Soxhlet 장치로 약 2시간 가열하여 추출 후 용매를 수용액상에서 감압농축 후, 동결 건조하여 사용하였다.
Acethylcholinesterase의 활성 측정에 사용한 Acetylcholinesterase (Type V-S), acetylcholine iodide, 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid), neostigmine bromide는 Sigma Chemical Co.의 제품을 사용하였으며, 기기는 UVVIS Spectrophotometer (SmartSpec3000, BioRad)와 Fusion spectrophotometer (Packard BioScience Company)를 사용하였다. 베타아밀로이드의 응집 정도를 측정하는데 사용한 베타아밀로이드 (Aβ1-42)는 미국의 아메리칸 펩티드사(American Peptide Co.
합성된 화합물은 실험직전 99.5%의 DMSO에 녹여 완충용액으로 농도별로 희석하여 사용하였으며, 형광물질로 사용하는 5 µM의 thioflavinT는 0.01 M 인산소다완충용액에 녹여 제조하였다.
USA)의 제품을, thioflavinT, phosphate buffered saline tablet, MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]는 미국의 시그마 화학 회사의 제품을 사용하였으며, 기타 시약은 특급의 시약을 사용하였다. 형광분광분석기는 일본의 시마즈사 (RF-5300PC, Shimadzu Corp.)의 기기를 사용하였다.

이론/모형

The detection of acetylcholinesterase inhibition was tested by Ellman’s method and the calculation was performed the following formular.
베타아밀로이드의 응집 정도 측정은 형광 분석법 (ThioflavinT assay)을 이용하였다. 베타아밀로이드 (Aβ_1-42) 펩티드는 영하 80 ℃에서 보관하였으며, 측정 시 사용한 최종농도는 5 µM의 농도로 사용하였다.

성능/효과

Aβ1-42 응집 저해능은 황련 85.9%, 적작약 85.2%로 비슷한 경향을 보여주었고, 그 다음으로 치자 73.9 %, 모근 66.7%, 연교 56.5%의 순으로 활성을 나타내었으며, 하고초, 결명자, 생지황, 자근, 황금, 황백, 고삼, 노근은 거의 활성이 나타나지 않았다.
따라서, 시험대상 청열약 20종 중 치매 효능 약물표적인 아세틸콜린에스테라제 억제에 대하여 비교적 좋은 활성을 나타낸 생약은 목단피와 연교이며, Aβ1-42 펩티드 응집억제에 대하여 비교적 좋은 활성을 보여준 생약은 적작약과 황련으로 나타났으며, 뇌세포신경 보호효능을 나타낸 생약은 목단피, 연교, 적작약으로 나타났다.
목단피, 치자, 적작약, 연교 및 황련 추출물의 치매세포모델에 대한 신경세포 보호능 시험 결과는 Table II에 나타내었다. 목단피 추출물은 대조군의 세포생존율을 100%로 보았을 때 90%의 세포생존율을 나타내었고, 적작약 85.1%, 연교 87.4%, 황련 76.4%, 치자 68% 순으로 세포생존율을 보여주었다. 이 시험결과는 이들 생약 추출물이 Aβ_1-42 펩티드로 인하여 세포독성을 일으킨 신경세포에 대하여 세포보호효과를 나타낸 것으로 판단된다.
신경세포주인 IMR-32에 Aβ1-42 펩티드를 20 uM 농도로 처리하였을 때, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 세포생존율은 49.1%로 나타나 약 50%의 신경세포저해가 일어난 치매세포모델이 되었음을 확인하였다.
이에 본 저자는 청열약의 양혈작용에 관심을 가지게 되었고, 치매와의 연관성을 검토하기 위하여 청열약 중 사용빈도수가 비교적 높은 생약 20종의 70% 메탄올 추출물 1 mg/ml 농도에서 치매치료에 효과적인 약물표적인 아세틸콜린에스테라제 저해작용과 Aβ_1-42 펩티드 응집 저해 효능을 검색하였고, 그 시험결과를 Table I에 나타내었다. 아세틸콜린에스테라제에 대하여 가장 높은 저해율을 나타낸 생약은 목단피로 91.5% (1 mg/ml)을 나타내었고, 그 다음으로 동일 농도에서 연교 85.3%, 치자 67.8%, 적작약 65.2%의 저해능을 보여주었다. 지모, 하고초, 죽엽, 생지황, 어성초는 아세틸콜린에스테라제 저해능이 거의 없는 것으로 나타났다.
2%의 저해능을 보여주었다. 지모, 하고초, 죽엽, 생지황, 어성초는 아세틸콜린에스테라제 저해능이 거의 없는 것으로 나타났다. Aβ_1-42 응집 저해능은 황련 85.

후속연구

따라서, 시험대상 청열약 20종 중 치매 효능 약물표적인 아세틸콜린에스테라제 억제에 대하여 비교적 좋은 활성을 나타낸 생약은 목단피와 연교이며, Aβ_1-42 펩티드 응집억제에 대하여 비교적 좋은 활성을 보여준 생약은 적작약과 황련으로 나타났으며, 뇌세포신경 보호효능을 나타낸 생약은 목단피, 연교, 적작약으로 나타났다. 본 연구결과 이들 3종 생약은 치매에 효능을 나타낼 수 있는 후보 생약으로 간주될 수 있으며, 이들의 개개 성분에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	알츠하이머병 치료제로 승인받아 임상에서 사용되는 의약품에는 어떤 것이 있는가?	4-5) 중추신경계의 choline system 관련 신경전달물질들과 이들의 세포내 대사에 관여하는 효소 및 유전자들과 APP와 관련된 유전자 및 효소들의 대사는 상호 상관관계가 있을 것으로 예상되었고, 최근 문헌에 이들의 상호관계에 대한 연구결과가 보고되었다.6-10) 현재까지 미국 식품의약품안전청으로부터 알츠하이머병 치료제로 승인받아 임상에서 사용되는 의약품은 모두 아세틸콜린 억제제로 tacrine (CognexTM),11) donepezil (AriceptTM),12) rivastigmine (ExelonTM)13) 등과 천연물 추출 성분인 galanthamine (ReminylTM)14)이 있다.
	알츠하이머병의 주요 원인은 무엇으로 알려져 있는가?	1) 원인으로는 amyloid precursor protein (APP), presenillin 1 (PS1), presenillin 2 (PS2) 유전자등의 변이로 인한 뇌의 기질적인 병변으로 신경세포나 조직이 파괴되어 중추신경계의 이상을 불러일으키는 신경퇴행성 질환으로 알려져 있다.2-3) 알츠하이머병의 주요한 원인은 뇌신경전달 물질인 acetylcholine의 뇌중 농도의 감소와 베타아밀로이드 단백질의 응집으로 인한 뇌세포의 퇴행으로 알려져 있다.4-5) 중추신경계의 choline system 관련 신경전달물질들과 이들의 세포내 대사에 관여하는 효소 및 유전자들과 APP와 관련된 유전자 및 효소들의 대사는 상호 상관관계가 있을 것으로 예상되었고, 최근 문헌에 이들의 상호관계에 대한 연구결과가 보고되었다.
	유전자 변이에 의한 원인으로는 알츠하이머병을 어떻게 설명할 수 있는가?	알츠하이머병은 1910년 독일의 신경병리학자인 Alois Alzheimer에 의해 발견되었고, 원인은 아직 정확히 밝혀지지 않았으나 약 5%만이 유전적이며, 95%는 환경 및 복합적인 원인으로 발병하는 것으로 알려져 있다.1) 원인으로는 amyloid precursor protein (APP), presenillin 1 (PS1), presenillin 2 (PS2) 유전자등의 변이로 인한 뇌의 기질적인 병변으로 신경세포나 조직이 파괴되어 중추신경계의 이상을 불러일으키는 신경퇴행성 질환으로 알려져 있다.2-3) 알츠하이머병의 주요한 원인은 뇌신경전달 물질인 acetylcholine의 뇌중 농도의 감소와 베타아밀로이드 단백질의 응집으로 인한 뇌세포의 퇴행으로 알려져 있다.

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본초학 (2004) 영림사, 편집부, 777p
생약학 (2006) 동명사, 생약학교재편찬위원회, 523p, 420p

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청열약 추출물들의 아세틸콜린에스테라제 저해와 베타아밀로이드 펩티드 응집 억제 효능
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