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문제 정의
- 5B). 따라서 DNA strand scission에 대한 억제활성을 가진 한약재들이 화학적 돌연변이원인 mitomycin C로 유발시킨 DNA의 손상도 억제할 수 있는지 여부를 조사하였다.10) 그 결과, Fig.
- 이를 위해서는 한약재가 가지는 변이원성, 항변이원성, 그리고 세포독성에 대한 체계적인 검정이 필요하므로 前報7)에 이들에 대한 검토를 시도하였으며, 본 실험에서는 한약재 열수추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해서 DPPH 자유라디칼에 대한 전자공여능 및 Fenton반응에 의해서 생성되는 ·OH소거능을 측정하였다. 또한 이들 항산화성과 前報에서 검토했던 한약재가 가지는 변이원성, 항변이원성 및 세포증식에 미치는 효과와의 관계를 고찰함으로써 한약재를 이용한 건강 기능성 신소재의 개발을 위한 자료를 확보하여 기능성 식품 개발에 활용할 수 있는 지표를 마련하고자 한다.
제안 방법
- 0.1 mM DPPH, 40% 에탄올, 0.04 mM sodium acetate(pH 5.5)를 포함한 혼합용액 2.5 ml에 열수추출농축 시료 5μl를 넣어서 실온에서 30분간 반응시킨 후, 잔존하는 DPPH 라디칼을 517 nm 에서의 흡광도를 UV/VIS Spectrophotometer(V-550 JASCO, Japan)로 측정하여 계산하였다. 전자공여능(%)은 (1-As/Ac)×l00으로 산출하였는데, 여기서 As와 Ac는 각각 실험구와 대조구에서의 흡광도를 나타낸다.
- 1 M NaH2PO4 완충용액 2ml에 5μl의 시료를 첨가하고, 다시 여기에 10mM의 H2O2를 넣어서 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 2.8%의 trichloroacetic acid(TCA)와 1%의 thiobarbituric acid(TBA)를 반응혼합액에 가하여 10분간 끓인 다음, 반응혼합액이 완전히 식으면 53 nm에서의 흡광도를 측정하여 시료의 ·OH 소거능(%)을 [l-(As-Ao)/(Ac-Ao)]×l00의 식에 의거, 구하였다. 여기서 As와 Ac는 각각 시료를 첨가한 실험구와 대조구에서의 흡광도를 나타내며, Ao는 37℃에서의 반응이 생략된 시약 혼합액의 흡광도를 나타낸다.
- 5) 완충용액에 시료 2μl를 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응종료 후, stop buffer (50% glycerol, 0.1 M EDTA, 0.1% bromophenol blue)를 1/10 용량 첨가하여 1×TAE buffer로 완충된 1% agarose gel에서 전기영동을 수행하였으며, 시료가 전기영동을 방해할 경우에는 이온교환수지를 이용하여 DNA를 정제한 다음, 전기영동을 수행하였다. 시료자체가 보유하는 DNA strand scission 유도활성 측정에는, 기술한 반웅시약 중, mitomycin C 와 sodium borohydride를 제외하고 동일한 방법으로 반응을 수행하였다.
- 이중에서 황련의 항산화활성(특히 전자공여능)이 극히 낮은 것을 제외하고 나머지 10종의 한약재는 유의할만한 수준의 항산화활성과 항변이원성을 모두 보유함을 알 수 있었다. 본 실험에 사용한 시료내에는 다양한 성분의 물질들이 존재할 것으로 추정되지만, 한약재를 약용이나 기호식품으로 섭취하는 경우 대부분 열탕추출물의 상태로 복용함을 생각할 때, 이들 한약재가 가지는 유전독성을 조사할 필요가 있기 때문에, 한약재가 DNA의 손상에 미치는효과를 in vitro에서 조사하였다. Fig.
- 시료자체가 보유하는 DNA strand scission 유도활성 측정에는, 기술한 반웅시약 중, mitomycin C 와 sodium borohydride를 제외하고 동일한 방법으로 반응을 수행하였다. 시료에 의하여 변환된 물리적으로 서로 다른 형태의 DNA함량을 상대적으로 측정하기 위하여, UV illuminator에 의하여 나타난 super coiled DNA(RF Ⅰ), open circled DNA(RF Ⅱ), linear double strand DNA(RF Ⅲ) band의 intensity를 Image analyzer(Bioimage 50S Series, BI. System Corp., USA)로 측정하여 supercoil형 DNA에서 다른 형태로의 전환율을 계산하였다.
- 1% bromophenol blue)를 1/10 용량 첨가하여 1×TAE buffer로 완충된 1% agarose gel에서 전기영동을 수행하였으며, 시료가 전기영동을 방해할 경우에는 이온교환수지를 이용하여 DNA를 정제한 다음, 전기영동을 수행하였다. 시료자체가 보유하는 DNA strand scission 유도활성 측정에는, 기술한 반웅시약 중, mitomycin C 와 sodium borohydride를 제외하고 동일한 방법으로 반응을 수행하였다. 시료에 의하여 변환된 물리적으로 서로 다른 형태의 DNA함량을 상대적으로 측정하기 위하여, UV illuminator에 의하여 나타난 super coiled DNA(RF Ⅰ), open circled DNA(RF Ⅱ), linear double strand DNA(RF Ⅲ) band의 intensity를 Image analyzer(Bioimage 50S Series, BI.
- 4-6) 우리나라에서는 한약재를 일상생활에 다양한 방법으로 섭취해 온 민간요법 등이 있기 때문에 한약재를 이용하여 항산화기능을 가진 기능성식품, 또는 항산화성 식품첨가제의 개발 및 상품화가 용이할 것으로 본다. 이를 위해서는 한약재가 가지는 변이원성, 항변이원성, 그리고 세포독성에 대한 체계적인 검정이 필요하므로 前報7)에 이들에 대한 검토를 시도하였으며, 본 실험에서는 한약재 열수추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해서 DPPH 자유라디칼에 대한 전자공여능 및 Fenton반응에 의해서 생성되는 ·OH소거능을 측정하였다. 또한 이들 항산화성과 前報에서 검토했던 한약재가 가지는 변이원성, 항변이원성 및 세포증식에 미치는 효과와의 관계를 고찰함으로써 한약재를 이용한 건강 기능성 신소재의 개발을 위한 자료를 확보하여 기능성 식품 개발에 활용할 수 있는 지표를 마련하고자 한다.
- 라디칼 소거능력을 비교하였다. 즉, 화학반응에 의하여 실험적으로 생성된 DPPH 자유라디칼에 대한 전자공여능 및 Fenton반응에 의해서 생성되는 ·OH 소거능을 각각 측정하였다. Table 1에 정리한 바와 같이 대다수의 한약재들은 DPPH 자유라디칼에 대한 전자공여 및 Fenton반응에 의해서 생성되는 ·OH 소거 효과는 가지고 있었다.
- 특히 세포막 지질과산화 반응이 자유라디칼에 의하여 촉발될 뿐 아니라, 생체 DNA의 초기손상까지 일으킨다는 사실을 감안하여14)Table 1에 나타낸 유해라디칼 소거활성으로 대표되는 항산화활성과 세포 유전물질인 DNA가 손상되는 것을 억제하는 활성인 항변이원성에 대한 각 측정치들을 도표화하여 그 연관성을 정리하였다. 한약재들의 전자공여능과 항변이원성효과와의 관계를 그래프의 좌표에 표시해 보면(Fig.
- 항산화 효과 측정을 위해서 열수추출물 시료 10 mg이 가지는 라디칼 소거능력을 비교하였다. 즉, 화학반응에 의하여 실험적으로 생성된 DPPH 자유라디칼에 대한 전자공여능 및 Fenton반응에 의해서 생성되는 ·OH 소거능을 각각 측정하였다.
대상 데이터
- 130종의 한약재는 시중의 한의원에서 구입하였으며, 구입한건조생약 12g에 탈이온수를 120ml씩 첨가하여 3시간동안 가압조건에서 가열 추출하였다. 얻어진 열수 추출액을 여과한 다음, 여액이 8g이 되도록 감압 농축한 것을 시료로 사용하였다.
- 얻어진 열수 추출액을 여과한 다음, 여액이 8g이 되도록 감압 농축한 것을 시료로 사용하였다. 실험에 사용한 시약 중 l,l-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH), 2-thio barbituric acid(TBA), 2-deoxy-D-ribose 및 기타 화학시약은 모두 Sigma사(St. Louis, USA)의 제품을 사용하였다.
이론/모형
- 시료에 의한 DNA strand scission의 유도, 또는 억제활성은 Ueda 등이 개발한 방법에 따라 시료의 첨가로 유도되는 ΦX 174 RF I DNA(BRL, Gaithersberg, USA)의 물리적 형태의 변환 정도로 측정하였다.10)DNA strand scission의 억제활성을 측정하기 위하여 0.
성능/효과
- ). (B) Agarose gel electrophoretogram of DNA incubated with following samples; 1, sample-free control; 2, mitomycin C and sodium borohydride-incubated control; 3 and 4, Ohyak (Lindera strychifolia Sieb. et Zucc. Villar); 5 and 6, Sansa (Crataegus pinnafida Bunge); 7 and 8, Mokgwah ((Jhaenomeles sinensis Koehne); 9 and 10, Paelgain (Nitraria sibirica Pall); 11 and 12, Yeojeongsil (Ligustrum lucidum Ait.); 13 and 14, Hwanggeum (Scutellaria baicalensis Georgi). (+) and (-)indicate the reaction condition with or without CuCl2, respectively.
- 따라서 DNA strand scission에 대한 억제활성을 가진 한약재들이 화학적 돌연변이원인 mitomycin C로 유발시킨 DNA의 손상도 억제할 수 있는지 여부를 조사하였다.10) 그 결과, Fig. 5에서 측정된 DNA 손상억제 활성과 마찬가지로 오약은 화학적 돌연변이원으로 유발된 DNA 손상을 억제할 수 없는 반면, 택사(lane 5)와 백자인(lane 11)은 사용된 시료가 조추출물임에도 불구하고 DNA의 손상을 뚜렷하게 억제하였으며, 특히 택사의 억제활성이 백자인보다 높은 경향을 보였다(Fig. 6).
- Table 1에 정리한 바와 같이 대다수의 한약재들은 DPPH 자유라디칼에 대한 전자공여 및 Fenton반응에 의해서 생성되는 ·OH 소거 효과는 가지고 있었다. DPPH 자유라디칼에 대한 전자공여능이 가장 큰 한약재는 필발(Piper longum L.)이었으며 목과, 창출, 지모, 조작자, 시호, 오약, 황금, 목통, 초두구, 대복피, 육계, 백자, 토복령, 백모 소자, 삼릉, 산사, 빈랑, 백두구, 화피, 오가피, 합환피, 당귀, 청피, 금은화의 25종의 한약재들은 대조군에 비해서 80% 이상의 DPPH 자유라디칼에 대한 전자공여능을 가지고 있었다. 한편 Fenton반응에 의해서 생성되는 ·OH 소거능이 가장 큰 한약재는 석곡(Dendrobhm moniliforme L.
- )이었으며 고본, 합환피, 지모, 황백, 백지, 등 삼, 죽여, 천궁, 치자, 창출, 파고지고, 봉출, 원지, 감초, 택사, 만형자, 필발, 목향, 백모, 길경 등 20종의 한약재들은 비교군에 비해서 60% 이상의 ·OH 소거능을 가지고 있었다. 이상 열거한 한약재 열수 추출물의 경우, 전자공여능과 라디칼 소거능 효과간에는 일부 일치하는 경우를 발견할 수 있었다(지모, 합환피, 창출, 백모). 한편, 백부근, 백모, 산두근, 선복화, 길경 , 초웅담, 목향, 황백, 치자, 지모, 죽여, 우슬, 감초, 진피, 창출, 원지, 정향피, 합환피, 백자, 당귀, 택사, 필발, 죽엽, 백출, 왕불유행 등 25종의 한약재는 전자공여능 및 ·OH 소거 효과 모두가 대조군에 비해서 50%이상을 나타내고 있어, 장차 이들을 시료로 다양한 in vivo, ex vivo 및 in vitro에서의 항산화 효과에 대한 실험을 수행함으로써 , 적극적으로 이들을 항산화 기능성 식품이나 첨가제로 사용하기 위한 검토가 필요하리라 생각한다.
- 항산화활성을 가진다고 본 실험에서 분류된 한약재 가운데 항변이원성이 뚜렷하게 검출된(16% 억제 이상) 한악재는 박하, 산사, 오약, 황금, 여정실, 백자인, 택란, 목과, 황련, 산사초흑, 택사의 11종으로 나타났다. 이중에서 황련의 항산화활성(특히 전자공여능)이 극히 낮은 것을 제외하고 나머지 10종의 한약재는 유의할만한 수준의 항산화활성과 항변이원성을 모두 보유함을 알 수 있었다. 본 실험에 사용한 시료내에는 다양한 성분의 물질들이 존재할 것으로 추정되지만, 한약재를 약용이나 기호식품으로 섭취하는 경우 대부분 열탕추출물의 상태로 복용함을 생각할 때, 이들 한약재가 가지는 유전독성을 조사할 필요가 있기 때문에, 한약재가 DNA의 손상에 미치는효과를 in vitro에서 조사하였다.
- 5에서 보는 것처럼 택사와 백자인을 제외한 나머지 시료들이 Cu2+ 존재하에서 DNA의 손상을 일으킨다는 것을 반응기질로 사용한 supercoil형 ΦX174 RF Ⅰ DNA가 strand scission에 의하여 open circle형 RF Ⅱ DCu2+, Fe2+ Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+의 5종의 이온을 사용하여 조사한 결과, Cu2+와 Fe2+만이 DNA의 손상을 유도하였다. 특히 Cu2+가 DNA의 손상을 강력하게 유도하였으나, 이 활성은 EDIA(0.1 mM)에 의하여 완전히 억제되었다(미발표 결과). 이 결과는 Cu2+의 존재하에서 시료에 함유된 아미노당이나 플라보노이드, 페놀화합물 등에 의하여 DNA의 strand scission이 일어났을 가능성을 시사한다.
- 특히 세포막 지질과산화 반응이 자유라디칼에 의하여 촉발될 뿐 아니라, 생체 DNA의 초기손상까지 일으킨다는 사실을 감안하여14)Table 1에 나타낸 유해라디칼 소거활성으로 대표되는 항산화활성과 세포 유전물질인 DNA가 손상되는 것을 억제하는 활성인 항변이원성에 대한 각 측정치들을 도표화하여 그 연관성을 정리하였다. 한약재들의 전자공여능과 항변이원성효과와의 관계를 그래프의 좌표에 표시해 보면(Fig. 1), 전자공여능이 있으면서 항변이원성 효과가 있는 한약재들은 그래프의 우측상단에 표시된 점들로서 박하, 산사, 오약, 황금, 여정실, 백자인, 택란, 목과, 산사초흑, 연자육 택사, 대황의 12종임을 알 수 있었다. 또한 ·OH 소거능이 있으면서 항변이원성 효과가 있는 한약재들은 Fig.
- )이었으며 목과, 창출, 지모, 조작자, 시호, 오약, 황금, 목통, 초두구, 대복피, 육계, 백자, 토복령, 백모 소자, 삼릉, 산사, 빈랑, 백두구, 화피, 오가피, 합환피, 당귀, 청피, 금은화의 25종의 한약재들은 대조군에 비해서 80% 이상의 DPPH 자유라디칼에 대한 전자공여능을 가지고 있었다. 한편 Fenton반응에 의해서 생성되는 ·OH 소거능이 가장 큰 한약재는 석곡(Dendrobhm moniliforme L.)이었으며 고본, 합환피, 지모, 황백, 백지, 등 삼, 죽여, 천궁, 치자, 창출, 파고지고, 봉출, 원지, 감초, 택사, 만형자, 필발, 목향, 백모, 길경 등 20종의 한약재들은 비교군에 비해서 60% 이상의 ·OH 소거능을 가지고 있었다. 이상 열거한 한약재 열수 추출물의 경우, 전자공여능과 라디칼 소거능 효과간에는 일부 일치하는 경우를 발견할 수 있었다(지모, 합환피, 창출, 백모).
- 3과 4에서 알 수 있듯이 상당히 많은 종류의 한약재가항산화활성을 가지면서 동시에 세포증식활성도 가지고 있음을 알 수 있다. 항산화활성을 가진다고 본 실험에서 분류된 한약재 가운데 항변이원성이 뚜렷하게 검출된(16% 억제 이상) 한악재는 박하, 산사, 오약, 황금, 여정실, 백자인, 택란, 목과, 황련, 산사초흑, 택사의 11종으로 나타났다. 이중에서 황련의 항산화활성(특히 전자공여능)이 극히 낮은 것을 제외하고 나머지 10종의 한약재는 유의할만한 수준의 항산화활성과 항변이원성을 모두 보유함을 알 수 있었다.
후속연구
- 본 실험에 사용한 시료에는 다양한 생리활성 물질들이 혼재되어 있을 것으로 생각되기 때문에, 각 활성물질의 분리, 정제 및 생물학적 활성의 검정은 반드시 필요하다고 본다. 항변이원 활성, 항산화활성 및 세포증식 촉진활성을 동시에 나타내는 한약재는 향후 식품분야 등 다양한 산업적 활용이 기대되기 때문에, 특히 이들 한약재에 주목하여 특이한 생리활성 물질의 분리, 정제를 추진 중에 있다.
- 것들이라 할 수 있다. 이러한 점에서 한약재 자체를 기능성 식품의 소재로 가공·이용하는 방법이나, 함유된 생리활성물질을 추출하여 목적지향적 기능성식품용 첨가제로 이용하는 방법에 대한 연구가 수행될 필요가 있다. 산업화로 인해 발생되는 다양한 공해물질에 대한 지속적인 접촉을 피할 수 없는 현대인의 환경조건에서는 각종 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 이 체내에 축적될 기회가 많을 뿐 아니라, 생체 내 산소 라디칼반응은 생체조직의 노화나 악성종양을 비롯한 성인병 발병의 원인이 되고 있다.
- 이상 열거한 한약재 열수 추출물의 경우, 전자공여능과 라디칼 소거능 효과간에는 일부 일치하는 경우를 발견할 수 있었다(지모, 합환피, 창출, 백모). 한편, 백부근, 백모, 산두근, 선복화, 길경 , 초웅담, 목향, 황백, 치자, 지모, 죽여, 우슬, 감초, 진피, 창출, 원지, 정향피, 합환피, 백자, 당귀, 택사, 필발, 죽엽, 백출, 왕불유행 등 25종의 한약재는 전자공여능 및 ·OH 소거 효과 모두가 대조군에 비해서 50%이상을 나타내고 있어, 장차 이들을 시료로 다양한 in vivo, ex vivo 및 in vitro에서의 항산화 효과에 대한 실험을 수행함으로써 , 적극적으로 이들을 항산화 기능성 식품이나 첨가제로 사용하기 위한 검토가 필요하리라 생각한다.
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