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문제 정의
- 최근 건강과 대체의학에 대한 관심의 고조, 합성 약품에 대한 부작용 우려 , 한약재가공 기술의 발달 등으로 한약재의 수요는 꾸준히 증가되고 있으며 관련 연구도 활기를 띠고 있어 관련 논문 수는 80년대에 비해 90년대에는 평균 5배 이상 증가하였고 주로 항산화작용, 항암활성에 대한 연구가 주를 이루고 있다(11). 본 연구에서는 한약재 및 약용식물류 의 항산화 효과를 검색하여 한약재 혼합 조성물을 이용한 천연 항산화제 개발을 위한 기초 자료를 얻고자 하였다.
가설 설정
- 1)Means with different superscripts in the same column are significantly different at p<0.01.
제안 방법
- 16종의 한약재 및 약용식물류의 열수 추출물에 대한 흡광 도, 총페놀화합물 및 플라보노이드 함량과 이들의 항산화 효과를 분석하였다. 추출수율은 단삼이 36.
- 총 페놀 함량은 Folin-Denis법(12)에 따라 각 추출물 1 mL에 Folin-Ciocalteau 시약 및 10% NazCQ?용액을 각 1 mL씩 차례로 가한 다음 실온에서 1시간 정치한 후 700 nm 에서 흡광도를 측정하였다. Caffeic acid(Sigma Co., USA) 를 0〜 100 卩g/mL의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 산출하였다.
- 3 mL를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 정치한 다음 415 nm에서 흡광도를 측정 하였다. Quercetin(Sigma Co., USA)을 표준물질로 하여 0-100 Ug/mL 농도 범위에서 얻어진 표준 검량선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
- 여기에 10% TCA용액을 1 mL 가하여 13, 500Xg에서 15분간 원심 분리한 후 얻은 상징액 1 mL에 증류수 1 mL와 ferric chloride 1 mL를 가하여 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 대 조구로 BHT를 시료와 동일 농도로 제조하여 비교하였으며 환원력은 흡광도의 값으로 나타내었다.
- 4 mL를 차례로 가한 후 진탕 혼합하여 실온에서 15분간 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 Griess rea gent 대신 증류수를 가하여 측정 하였으며 , 아질산염 소거능은 100-[(시료 첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)X 100] 으로 나타내었다.
- 본실험에 사용한 시료는경남진주시내 한약방 및 한의원에서 건조된 형태로 시판되는 한약재를 동정 후 구입하였으며, 공시된 시료 및 이용 부분은 Table 1과 같다. 시료는 문헌 고찰을 통하여 약리적으로 심혈관계 질환의 개선 및 항산화 작용을 가지는 것을 선정하였다.
- 시료의 열수추출물을 완전 건고시킨 후 3차 증류수를 가하여 250 Ug/mL와 1, 000 Ug/mL의 농도로 조정한 시료액의 pH 및 흡광도를 측정하였다. pH는 pH meter(410, Thermo Orion, USA)로, 흡광도는 UV spectrophometer(Optizen 2120 UV, Mecasys Co.
- 전자공여 작용은 Blois(14)의 방법을 변형하여 1, 1-di- phenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)에 대한 전자공여 효과로 시료의 환원력을 측정하였다. 즉 일정농도의 시료 추출물에 DPPH 용액을 가하여 혼합한 다음 실온에서 20분간 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정 하였다.
- 추출된 시료는 여과 후 70°C에서 감압농축하여 완전 건고시킨 다음 건조물의 무게를 측정 하고 3차 증류수를 가해 1000 pg/mL 의 농도가 되도록 하여 -20°C에서 냉동보관하면서 실험에 사용하였다. 추출 수율은 추출 전 한약재 건조물에 대한 추출물의 완전건고 후 무게백분율로 계산하였다.
대상 데이터
- 본실험에 사용한 시료는경남진주시내 한약방 및 한의원에서 건조된 형태로 시판되는 한약재를 동정 후 구입하였으며, 공시된 시료 및 이용 부분은 Table 1과 같다. 시료는 문헌 고찰을 통하여 약리적으로 심혈관계 질환의 개선 및 항산화 작용을 가지는 것을 선정하였다.
- 한약재는 적당한 크기로 마쇄한 후 추출에 이용하였다. 마쇄 시료 100 g에 대해 10배의 증류수를 넣어 95°C 수욕상에서 3시간 동안 환류냉각하면서 2회 반복 추출하였다.
데이터처리
- 0을 사용하여 통계처리하였으며, 각각의 시료에 대해 평균土표준편차로 나타내었다. 각 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 p=0.05 수준에서 Duncan's mul tiple test에 따라 분석하였다.
- 각 실험은 5회 이상 반복실험을 통하여 결과를 얻어 SPSS 12.0을 사용하여 통계처리하였으며, 각각의 시료에 대해 평균土표준편차로 나타내었다. 각 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 p=0.
이론/모형
- Oyaizu(15)의 방법에 따라 측정 하였으며 시료 1 mW] 인산 완충액 (200 mM, pH 6.6) 및 1%의 potassium ferri cyanide 각 1 mL를 차례로 가한 다음 50°C의 수욕상에서 20분간 반응시켰다. 여기에 10% TCA용액을 1 mL 가하여 13, 500Xg에서 15분간 원심 분리한 후 얻은 상징액 1 mL에 증류수 1 mL와 ferric chloride 1 mL를 가하여 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정 하였다.
- 아질산염 소거작용 측정은 Kato 등(⑹과 Kim 등(17)의 방법에 따라 1 mM NaNO2 용액 1 mL에 각 시료 1 mL를 가하고 0.1 N HC1 과 0.2 M 구연산 완충액으로 pH 2.5로 보정 한 다음 완충액을 가하여 총 부피를 10 mL로 하였다. 이 용액을 37°C에서 1 시 간 반응시킨 후 각 반응액 1 mL를 취 하 여 2% 초산용액 3 mL와 30% 초산용액으로 용해한 Griess reagentd% sulfanilic acid : 1% naphthylamine=l : 1) 0.
- 총 플라보노이드는 Moreno 등(13)의 방법에 따라 추출물 0.5 mL에 10% aluminum nitrate 0.1 mL, 1 M potassium acetate 0.1 mL 및 ethanol 4.3 mL를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 정치한 다음 415 nm에서 흡광도를 측정 하였다. Quercetin(Sigma Co.
성능/효과
- 2)Means with different superscripts in the same column are significantly different at p<0.01.
- 280 nm에서의 흡광도 측정 결과는 항산화성 물질의 용출정도와 방향족화합물의'함량을 가늠할 수 있으며, 420 nm에서의 흡광도 측정 결과는 갈색화 반응생성 물의 농도를 나타내는 갈색도를 측정하는 것(22, 23)으로서 본 실험의 결과 높은 흡광도 값을 나타낸 꿀풀, 금물초 및 옥수수수염의 경우 항산화성 물질의 함량이 비교적 높은 것으로 추정하여 볼 수 있다. 280 nm에서 방향족 화합물을 측정한 결과 솔잎과 쑥이 각각 2.
- pH 2.5의 반응계에서 아질산염 소거능을 측정한 결과 (Table 7) 시료의 농도가 증가함에 따라 아질산염 소거능도 상승하였으나 500 Ug/mL의 농도에서 50% 이상의 소거효과 를 나타낸 시료는 꿀풀과 금물초 2종에 불과하였으며 1000 Ug/mL의 농도에서는 산조인, 산수유, 감국, 꿀풀, 금물초, 오가피, 단삼, 울금이 50% 이상의 소거효과를 나타내었다. 꿀풀의 경우 모든 실험 농도에서 다른 시료들에 비하여 유의적으로 높은 아질산염 소거효과를 나타내어 250 Ug/mL에서 는 59.
- 62%), 산조인, 금물초 순으로 20% 이상의 추출수율을 나타내었다. 감국, 꿀풀, 두충, 오가피는 추출 수율이 10% 미만이 었고 이중 오가피는 2.29%로 수율이 가장 낮았다. 다류원료 식물류 40여종의 물 추출물 수율을 조사한 Kim 등(18)의 결과에 따르면 생지황이 42.
- 271 %의 높은 효과를 나타내었다. 대표적인 합성 항산화제 인 BHT와비 교할 때 100 Ug/mL의 농도에서는 산수유, 금물초 및 단삼만이 유의적으로 높은 전자공여 효과를 나타내었 으나 1000 Rg/mL의 농도에서는 단삼을 포함한 총 8개 시료에 서 BHT보다 유의적으로 높은 전자공여 효과를 나타내었다.
- 시료의 농도별 환원력을 측정한 결과는 Table 6과 같다. 모든 시료에서 농도가 증가함에 따라 시료의 환원력도 증가하는 경향을 나타내었으나 BHT와 비교할 때 유의적으로 낮은 환원력을 나타내었다. 시료 중 가장 높은 환원력을 나타낸 꿀풀의 경우 100 Ue/mL에서는 0.
- 92의 범위로 산성 pH에 더 가까웠다. 방향족 화합물의 함량을 검색하고자 250 Ug/mL 농도의 시료로 280 nm에서 흡광도를 측정한 결과 꿀풀이 2.872로 가장 높았으며 엉겅퀴와 산사육, 산조인은 0.5이 하의 낮은 흡광도를 나타내었다. 갈색화 반응 생성물의 흡광도를 측정한 결과도 유사한 경향을 나타내어 꿀풀의 경우 1.
- 92의 범위로 산성 pH에 더 가까웠다. 산조인의 pH가 4.00으로 가장 낮았고, 단삼은 5.90, 옥수수수염 은 5.92으로 다른 시료에 비하여 pH 값이 더 높았다.
- 358%)와 비교할 때 산수유, 꿀풀, 금물초, 단삼이 더 높은 전자공여능을 나타내었다. 시료 농도가 250 Ug/mL에서는 이들 시료 외에 뽕나무 잎과 오가피가 약 65%의 전자공여능을 보여 총 6종의 시료가 BHT보 다 전자공여 효과가 더 뛰어났다. 대부분의 시료에서 농도가 증가함에 따라 전자공여 효과도 높아지는 경향을 보였는데 산조인, 산수유, 단삼은 1000lig/mL의 농도에서 90% 이상의 전자공여 효과를 나타내었다.
- 시료 주줄물을 3차 증류수를 이용하여 250 Ug/mL의 농도로 만들어 280 nm에 서 흡광도를 측정한 결 과(Table 3) 꿀풀이 2.872로 가장 높았으며 금물초가 2.189, 옥수수수염이 1.653으로 높은 흡광도 값을 나타내었다. 엉겅퀴와 산사육, 산조인은 0.
- 환원력도 전자공여능과 유사한 경향이 었으나 BHT와 비교할 때 유의적으로 낮은 환원력을 나타내었다. 아질산염 소거능은 500 Ug/mL의 농도에서 50% 이상의 소거 효과를 나타낸 시료는 꿀풀과 금물초 2종에 불과하였으며 1000 Ug/mL의 농도에서는 산조인, 산수유, 감국, 꿀풀, 금물초, 오가피, 단삼, 울금이 50% 이상의 소거효과를 나타내었다. 꿀풀의 경우 전 농도에서 다른 시료들에 비하여 유의적으로 높은 아질산염 소거효과를 나타내어 250 Ug/mL에서는 59.
- 8배 〜5배 증가한다고 보고되어 있다(32). 이는 본 실험의 결과 시료농도가 1001坂/ mL에서 lOOOlig/mL로 증가함에 따라 1.6배 〜9배 정 도■ 아질 산염 소거능이 증가한 것과 일치하는 경향이었다. 아질산염 소거능은 시료의 첨가량뿐만 아니 라 반응계의 pH와 추출용매에 따라서도 달라지는데, pH 의존도가 매우 커 산성 영역 에 가까울수록 소거능이 높으며 중성에 가까울수록 소거능이 낮아진다(32, 33).
- 725) 순이었다. 총 페놀 화합물의 함량은 꿀풀이 5.07 + 0.05 mg/100 g으로 다른 시료에 비하여 월등히 높은 함량이었고 플라보노이드의 함량은 단삼에서 4.82±1.16 mg/100 g으로 다른 시료에 비하여 약 2배 정도 높은 함량이었다. 대부분의 시료에서 농도가 증가함에 따라 전자공여 효과도 높아지는 경향을 보였는데 산조인, 산수유, 단삼은 1000 ng/ mL의 농도에서 90% 이상의 전자공여 효과를 나타내었다.
- 한약재 추출물의 수율 및 pH는 Table 2와 같다. 추출수율 은 단삼이 36.49%로 다른 시료에 비하여 월등히 높았으며 다음으로 산수유(29.62%), 산조인, 금물초 순으로 20% 이상의 추출수율을 나타내었다. 감국, 꿀풀, 두충, 오가피는 추출 수율이 10% 미만이 었고 이중 오가피는 2.
- 16종의 한약재 및 약용식물류의 열수 추출물에 대한 흡광 도, 총페놀화합물 및 플라보노이드 함량과 이들의 항산화 효과를 분석하였다. 추출수율은 단삼이 36.49%로 다른 시료 에 비하여 월등히 높았으며 pH는 4.00〜5.92의 범위로 산성 pH에 더 가까웠다. 방향족 화합물의 함량을 검색하고자 250 Ug/mL 농도의 시료로 280 nm에서 흡광도를 측정한 결과 꿀풀이 2.
- 플라보노이드의 함량은 단삼에서 4.82±1.16 mg/100 g으 로 다른 시료에 비하여 약 2배 정도 높은 함량이 었으며 산조인(2.68±0.03 mg/100 g), 금물초(2.06±0.02 mg/100 g) 및 꿀풀(2.01 ±0.03 mg/100 g)을 제외한 시료에서는 1.95〜 1.80 mg/100 g의 범위로 정량되었다.
- Kim 등(26)은 20여종의 약용식물 물추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과 대부분의 식물에서 폴리 페놀이 플라보노이드보다 함량이 높으며 , 폴리페놀의 함량이 플라보노이드 함량보다 월등히 높은 시료에서.항산화 활성이 높은 것으로 보아 플라보노이드 외의 다른 폴리페놀 화합물들이 식물에서의 항산화 활성에 기여하는 것으로 보 고하였다.
후속연구
- 11%로 월등히 높았고 당귀, 산조인, 울금 및 두충은 12〜13%의 범위인데, 탈지미 강 추출물의 추출수율(7〜10%)과 비교할 때 이들 생약재는 산업적 활용이 가능하다고 보고하였다. 이와 비교할 때 본 실험에 사용된 한약재의 경우 오가피를 제외한 모든 시료가 산업적 활용이 가능하리라 판단된다.
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