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문제 정의
- 20) 그러나 전반적으로 방향성 제라늄의 조직배양에 관한 연구 뿐만 분자수준에서의 종합적인 연구가 매우 미미한 실정이며 정유합성에 관련된 몇 효소를 제외하면 제라늄의 분화와 발달 및 성장에 관련된 효소 수준에서의 연구가 거의 진행되어 있지 않다. 본 연구에서는 방향성 제라늄 graveoSse)으로부터 캘러스를 유도한 후 호르몬 변화에 의한 POD isozyme의 발현변화를 조사하였다. 또한 캘러스를 재분화시킨후 재생식물과 캘러스사이의 POD 활성변화를 서로 비교하였다.
제안 방법
- 2.0 mg/l NAA와 0.5 mg/l BAP 처리군에서 유도된 1차 캘러스로부터 신초(shoot)를 유도하기 위하여 NAA와 BAP의 농도를 다양하게 변화시켰다. 그 결과 방향성 제라늄의 옆병으로부터 유도한 캘러스를 0.
- 제라늄 조직배양의 문제점으로 지적되고 있는 낮은 재분화빈도를 높이기 위하여 adenine sulfate와 isopentenyl adenine을 배지에 첨가하였을 때 신초유도와 신초 증식이 증가하였다고 보고되어 있으며,25) Robichon 등은 제라늄 하배축을 thidiazuron를 첨가한 MS배지에서 배양했을 때 부정아 유도가 활발하게 진행되어 95% 이상의 재분화가 일어났다고 보고한 바 있다.26) 그러나 본 연구에서는 NAA와 BAP의 호르몬 비율변화를 통하여 방향성 제라늄 캘러스를 유도 시켰고 이로부터 효율적인 재분화를 가능하게 하였다(Fig. 1).
- NAA와 BAP 처리군과 2,4-D와 BAP 처리군에서 유도된 캘러스의 POD 활성과 POD isozyme 패턴을 조사하여 호르몬 조성에 따른 isozyme 발현변화를 비교하였다. NAA와 BAP 처리 및 2,4-D와 BAP 처리된 캘러스의 POD 비활성(unit/mg protein)을 조사한 결과 총 배양기간동안 NAA와 BAP처리군이 2,4-D와 BAP처리군보다 높은 POD 비활성을 나타내었다.
- POD의 여러가지 isozymee 외부환경과 생장조건 및 조직별로 조직특이적 발현양상을 보이므로, 재분화된 방향성 제라늄의 POD 활성을 캘러스와 성숙한 제라늄의 POD 활성과 비교하였다. 효소액의 추출을 위하여 제라늄 잎 혹은 줄기 및 캘러스에 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6) 3 ml를 가한 후 파쇄하여 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 효소원으로 사용하였다.
- POD의 활성은 guaiacol을 기질로 사용하여 470nm에서의 흡광도의 변화를 측정하였다. 효소 반응액은 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.
- 본 연구에서는 방향성 제라늄 graveoSse)으로부터 캘러스를 유도한 후 호르몬 변화에 의한 POD isozyme의 발현변화를 조사하였다. 또한 캘러스를 재분화시킨후 재생식물과 캘러스사이의 POD 활성변화를 서로 비교하였다.
- 멸균된 정아와 측아 및 옆병을 각각 다양한 농도(0.5 mg/l-2mg/l)의 naphthalene acetic acid(NAA) 와 6-Benzyl-aminopurine(BAP)가 포함된 MS(Murashige and Skoog)배지 및 2.4- dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D) 와 BAP가 포함된 MS 배지에 옮긴 후 70% 습도와 25℃ 생장상에서 캘러스유도를 시도하였다. 유도된 캘러스 중 배아세포 부분을 선택하여 0.
- 본 연구에서는 성숙한 방향성 제라늄의 정아, 측아 및 옆병을 취하여 여러가지 농도의 식물생장조절제가 포함된 MS배지에서 캘러스를 유도하였다(Table 1). 그 결과 NAA/BAP의 비율이 2mg/0.
- 4- dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D) 와 BAP가 포함된 MS 배지에 옮긴 후 70% 습도와 25℃ 생장상에서 캘러스유도를 시도하였다. 유도된 캘러스 중 배아세포 부분을 선택하여 0.8% agar가 첨가된 MS배지에 1주 간격으로 접종하였다. 이를 새로운 MS배지로 옮겨서 약 3-4주간 배양하였다.
- 재생 제라늄과 캘러스의 POD활성을 성숙한 제라늄식물체의 POD활성과 서로 비교하였다(Table 3). 성숙한 제라늄 식물체의 잎에는 POD 활성이 거의 존재하지 않았으나 줄기의 POD 비활성은 0.
- 5mg/l BAP가 포함된 MS배지로 옮긴후 3-5주간 배양하여 신초(shoot)를 유도하였다. 캘러스에서 형성된 신초부분을 선택하여 발근유도배지인 호르몬이 포함되지 않은 MS배지로 옮긴 후 식물체 재분화를 유도하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서는 앙재동 꽃시장에서 방향성 제라늄(Pelargonium graveolens)을 구입하여 미분화세포를 유도하고 이를 재분화시켜서 사용하였다.
-
방향성 제라늄 캘러스의 유도 및 배양
양재 꽃시장에서 구입한 방향성 제라늄의 정아와 측아 및 옆병을 취해 무균상태에서 70%의 ethanol에서 1분, 50%의 lox 에서 20분 동안 진탕소독한 후 멸균된 증류수로 3~4회 씻어 주었다. 멸균된 정아와 측아 및 옆병을 각각 다양한 농도(0.
이론/모형
- POD 1 unit은 1분 동안 흡광도를 1 변하게 하는 효소의 양으로 정의하였다. 효소액의 단백질량은 Lowry 방법21)으로 측정하였으며 표준단백질은 bovine serum albumin을 사용하였다.
성능/효과
- 5mg인 경우 캘러스 유도 비율이 30% 미만으로 감소하였다. 2, 4-D, NAA 혹은 BAP 단독 처리에서는 캘러스가 전혀 유도되지 않았다. 따라서 방향성 제라늄 캘러스유도에 가장 적당한 호르몬 조성은 2.
- 1-3) 이러한 기능상의 다양성과 함께 POD는 세포의 성장과 분화를 조절하는 효소로서4) isozyme pattern이 세포의 성장과 노화, 환경조건 등에 따라서 변화하기 때문에 어느 특수조건에서의 POD isozyme의 pattern변화를 생리생화학적인 기능과 연결시키고자 하는 노력이 많이 시도되었다.5) 최근 특정시기 식물세포의 분화와 POD 생성을 연결시켜 보려는 노력이 있었을 뿐만 아니라, 특정 POD isozyme의 활성변화가 식물의 성장과 분화과정에 따라 다르게 나타나므로 식물의 분화와 발달단계에서 개별 POD isozyme이 서로 다르게 조절되고 생합성될 가능성이 제시되었다.6) Horseradish,7) Korean radish,8-12) Japanese radish,13) 담배14)와 고구마15,16)등 다양한 식물에서 POD가 정제되어 효소학적 특성이 규명되어 왔고, 유전자구조와 기능이 밝혀지고 있다.
- 이에 비해 cathode로 이동하는 cathodic POD isozyme의 발현양상은 서로 차이를 보였다. NAA와 BAP 배지에서는 다른 cathodic POD isozyme에 비해 far migrating POD isozyme C3가 과량 발현되었고, 2,4-D와 BAP 배지에서는 POD isozyme C2와 C3에 비해 low migrating anodic POD isozyme C1이 뚜렷이 발현되었다. 호르몬 조성에 따른 POD isozyme의 발현변화에 관한 연구를 살펴보면 담배 캘러스의 경우 신초형성시 10-8 M kinetin배지에서 형성된 신초에서는 cathodic POD isozyme의 양이 증가한 반면 10-5 M kinetin 배지에서 형성된 신초에서는 anodic POD isozyme의 양이 증가하였다.
- 따른 isozyme 발현변화를 비교하였다. NAA와 BAP 처리 및 2,4-D와 BAP 처리된 캘러스의 POD 비활성(unit/mg protein)을 조사한 결과 총 배양기간동안 NAA와 BAP처리군이 2,4-D와 BAP처리군보다 높은 POD 비활성을 나타내었다. 배양기간에 따른 비활성도의 변화를 살펴보면, NAA와 BAP 처리군의 경우 배양 1주에서 4주 동안 POD의 비활성도가 거의 비슷하였으나, 2,4-D와 BAP 처리군에서는 배양기간이 1주에서 4 주로 증가함에 따라 POD 비활성이 현저하게 감소하였다(Fig.
- 5 mg/l BAP이었다. 각 호르몬처리군의 캘러스유도에 걸리는 시간을 서로 비교해보면 NAA 와 BAP 처리군과 2,4-D와 BAP 처리군의 경우 옆병과 정아로부터 약 4주 후 캘러스가 유도되었다. 이에 비해 2,4-D와 BAP 처리군의 경우 측아로부터 약 5주 후 캘러스가 유도되었으나 NAA와 BAP 처리된 측아로부터는 캘러스가 유도되지 않았다 (결과 미제시).
- 캘러스를 유도하였다(Table 1). 그 결과 NAA/BAP의 비율이 2mg/0.5mg인 경우 옆병으로부터 최대 70% 이상의 캘러스가 유도되었고, 24D/BAP의 비율이 2mg/0.5mg인 경우에도 캘러스가 70% 이상 유도되었다. NAA/BAP의 비율이 1 mg/0.
- 5 mg/l BAP 처리군에서 유도된 1차 캘러스로부터 신초(shoot)를 유도하기 위하여 NAA와 BAP의 농도를 다양하게 변화시켰다. 그 결과 방향성 제라늄의 옆병으로부터 유도한 캘러스를 0.05 mg/l NAA와 0.5 mg/l BAP가 처리된 MS배지로 옮겼을 때 약 5주 후 캘러스당 최대 14개의 신초가 유도되었다(Table 2). 그러나 정아와 측아에서 유도된 캘러스로부터는 신초가 유도되지 않았다.
- 2, 4-D, NAA 혹은 BAP 단독 처리에서는 캘러스가 전혀 유도되지 않았다. 따라서 방향성 제라늄 캘러스유도에 가장 적당한 호르몬 조성은 2.0 mg/l NAA와 0.5 mg/l BAP 혹은 2.0 mg/l 2, 4-D와 0.5 mg/l BAP이었다. 각 호르몬처리군의 캘러스유도에 걸리는 시간을 서로 비교해보면 NAA 와 BAP 처리군과 2,4-D와 BAP 처리군의 경우 옆병과 정아로부터 약 4주 후 캘러스가 유도되었다.
- NAA와 BAP 처리 및 2,4-D와 BAP 처리된 캘러스의 POD 비활성(unit/mg protein)을 조사한 결과 총 배양기간동안 NAA와 BAP처리군이 2,4-D와 BAP처리군보다 높은 POD 비활성을 나타내었다. 배양기간에 따른 비활성도의 변화를 살펴보면, NAA와 BAP 처리군의 경우 배양 1주에서 4주 동안 POD의 비활성도가 거의 비슷하였으나, 2,4-D와 BAP 처리군에서는 배양기간이 1주에서 4 주로 증가함에 따라 POD 비활성이 현저하게 감소하였다(Fig. 2).
- 호르몬 조성에 따른 POD isozyme의 발현변화에 관한 연구를 살펴보면 담배 캘러스의 경우 신초형성시 10-8 M kinetin배지에서 형성된 신초에서는 cathodic POD isozyme의 양이 증가한 반면 10-5 M kinetin 배지에서 형성된 신초에서는 anodic POD isozyme의 양이 증가하였다. 뿐만 아니라 10-5 M kinetin 배지에서 특히 과량 유도되는 anodic POD isozyme A3가 poly(A)+RNA 뿐만 아니라 poly(A)-RNA에서도 합성된다는 사실을 확인하였다.27) 한국산 무의 유묘에서도 POD isozyme의 발현은 배양기간 뿐만 아니라 조직특이적으로 발현양상의 차이를 보였으며 이러한 변화가 무 POD mRNA의 adenylation 상태에 따라 변화된다고 보고되었다.
- 3이었다. 이에 비해 배양 3주된 NAA와 BAP처리 캘러스의 POD 비활성은 0.8로서 식물체에 비하여 현저하게 높은 효소 활성을 나타냈다. 성숙한 제라늄 잎에 POD 활성이 거의 나타나지 않은 결과를 통하여 방향성 제라늄잎에는 POD보다는 주로 방향성 물질의 대사와 분비에 필요한 효소가 주로 분포할 것으로 추측할 수 있다.
- 23이었다. 재생 후 2주간 키운 제라늄 잎의 POD 비활성은 0.06이었고, 재생 줄기의 POD 비활성은 0.3이었다. 이에 비해 배양 3주된 NAA와 BAP처리 캘러스의 POD 비활성은 0.
- 제라늄 캘러스 효소원을 pH 7.0에서 starch gel electrophoresis를 수행한 결과 cathode로 이동하는 약 3개의 cathodic POD isozyme(C1, C2와 C3)와 anode로 이동하는 약 3개의 anodic POD isozyme(Al, A2와 A3)를 확인할 수 있었다(Fig. 3). 호르몬 조성에 따른 POD isozyme의 발현양상을 비교해보면 anode로 이동하는 anodic POD isozyme Al, A2, A3는 NAA와 BAP배지와 2,4-D와 BAP 배지에서 비슷한 발현양상을 보였다.
- 3). 호르몬 조성에 따른 POD isozyme의 발현양상을 비교해보면 anode로 이동하는 anodic POD isozyme Al, A2, A3는 NAA와 BAP배지와 2,4-D와 BAP 배지에서 비슷한 발현양상을 보였다. 이에 비해 cathode로 이동하는 cathodic POD isozyme의 발현양상은 서로 차이를 보였다.
후속연구
- 그러나 상처, 저온, 오존 등을 처리하면 식물체에서 대부분 강하게 발현되었다고 보고되었다.15,16)따라서 식물체와 캘러스간의 POD 활성비교는 특정 POD isozyme의 생리적 기능을 규명하는데 이용될 수 있을 것이다.
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