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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 반응표면분석법(Response Surface Methodology)을 이용하여 감잎추출물의 품질을 최대로 높이고자 최적 추출조건을 조사하였다.
제안 방법
- 각 조건에서 얻어진 추출물의 가용성 성분 수율은 추출액 일정량을 취하여 105℃ 건조법으로 수분을 측정하여 고형분 함량을 계산하고 추출액 조제에 사용된 원료량(건물량)에 대한 백분율로서 고형분 수율을 나타내었다.
- 각 추출물의 전자공여작용은 Blois24)의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료 1ml에 2×10-4M α, α'-diphenyl-β-picryl-hydrazyl(DPPH) 1.
- 감잎 음료 제조를 위한 추출공정을 최적화하기 위하여 조건별 추출물의 가용성 고형분 함량, 추출물의 탁도, 수용성 탄닌의 함량, 전자공여작용, XOase 저해율 그리고 ACE 저해율에 대한 contour map을 superimposing하여 최적 추출조건 범위를 예측하였다. 추출에서 가장 영향이 작은 것으로 나타난 추출시간을 실험계획의 범위 즉, 2시간으로 고정하여 반응변수들의 추출특성을 반응표면 분석하였다.
- 추출조건의 실험변수로는 추출시간(X1), 추출온도(X2), 에탄올 농도(X3)이었으며, 1차 예비실험을 통한 각 조건들은 -1, 0, 1로서 3수준으로 부호화하여 실험값을 Table 1에 나타내었다. 또 혼합조건의 품질특성에 관련된 반응(종속) 변수(Ya)로써는 추출수율(Y1), 탁도(Y2) 수용성 탄닌함량(Y3), 전자공여능(Y4), xanthine oxidase(Y5) 및 angiotensin converting enzyme 저해율(Y6)이었으며, 이들은 3회 반복 측정하여 그 평균값을 회귀분석에 사용하였다. 이때 세 개의 독립변수와 종속변수에 대한 2차 회귀모형식은 식(1)과 같다.
- 반응표면을 겹쳐 그려서 얻은 최적 추출조건 범위에서 각각 나타난 여러반응변수 즉, 감잎 추출물의 품질인자들의 예측치를 실험치로써 확인하기 위하여 추출시간 2(m), 추출온도 80℃ 그리고 에탄올 농도 34%로 고정한 후 3번의 반복실험을 수행하여 예측치와 실제 실험치와의 추출특성을 확인하였으며, 그결과를 Table 4에 나타내었다. 최적 추출조건 범위내에서 추출물의 가용성 고형분 함량게 대한 실측치는 반응표면분석으로부터 얻어진 예측치의 범위보다 약간 높았다.
- program을 활용하였다. 본 computer program은 중심합성계획에 의해 설계된 실험 조건에 따라 모델 실험을 실시하고 여기에서 얻어지는 결과, 즉 추출물의 기능적 특성을 수치화하여 statistical analysis system(SAS) program에 대입함으로써 통계적으로 유의성이 있는 최적의 결과를 예측하였다. 추출조건의 실험변수로는 추출시간(X1), 추출온도(X2), 에탄올 농도(X3)이었으며, 1차 예비실험을 통한 각 조건들은 -1, 0, 1로서 3수준으로 부호화하여 실험값을 Table 1에 나타내었다.
- 수용성 탄닌의 정량은 AOAC에 준하여 정량하였다. 즉, 100배 희석한 시료용액 1ml에 Folin-Denis시약 5 ml가 하고 포화 Na2CO3 용액 10ml를 가하여 혼합한 후 증류수로 최종 volume을 100 ml로 맞춘 후 30분간 실온에서 방치하고 760 nm에서 흡광도를 측정한 것을 미리 작성한 표준곡선의 흡광도값과 비교하여 함량을 산출하였다.
- 즉, 반응구는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5)에 xanthine oxidase 2mM을 녹인 기질액 1 m2에 효소액 0.1 ml와 탄닌용액 0.1 ml를 가하고 대조구에는 탄닌 대신 증류수를 0.1 mZ 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시키고 20% trichloroacetic acid 1 mZ를 가하여 반응을 종료시키고 원심분리하여 단백질을 제거한 후 반응액 중에 생성된 uric acid를 흡광도 292nm에서 측정하여 다음 식으로 저해율(%)을 구하였다.
- 즉, 반응구는 0.3 M NaCl을 함유하는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 8.3) 에 기질 (Hippury-L-histidyl-L-leucine; HHL) 2.5 mM을 녹인 액 0.15 m/, ACE 0.1 mZ와 각 추출시료용액 0.1 mZ를 혼합하였으며, 대조구는 추출시료 대신 증류수 0.1 mZ를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시키고 1 N HC1 0.35 m/를 첨가하여 반응을 중지시킨 뒤 3 m/의 ethyl-acetate(EtOAc) 를 첨가하였다. EtOAc층으로부터 용매를 증류시킨 잔류물에 1mZ의 증류수를 첨가하여 추출된 hippuric acid를 흡광도 228 nm에서 측정한 후 다음 식에 따라 저해율을 구하였다.
- 추출 공정은 추출시간, 추출온도, 에탄올농도 등의 여러 변수에 따라 추출효율이 좌우될 수 있으므로, 본 실험에서는 추출물의 기능적 특성을 최대로 하는 최적조건을 설정하기 위해 반응 표면 분석 (RSM)23) program을 활용하였다. 본 computer program은 중심합성계획에 의해 설계된 실험 조건에 따라 모델 실험을 실시하고 여기에서 얻어지는 결과, 즉 추출물의 기능적 특성을 수치화하여 statistical analysis system(SAS) program에 대입함으로써 통계적으로 유의성이 있는 최적의 결과를 예측하였다.
- 추출에서 가장 영향이 작은 것으로 나타난 추출시간을 실험계획의 범위 즉, 2시간으로 고정하여 반응변수들의 추출특성을 반응표면 분석하였다. Fig.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 감잎은 경북 창녕군에서 재배하는 감나무로서 창녕부유 1품종을 6월 초순에 채집하여 이물질을 제거하고 세척한 후 음지에서 건조시켜 polyethylene Him에 넣어 냉동고에 보관하면서 본 실험에 사용하였다.
이론/모형
- XOase 저해활성 측정은 Stirpe와 Corte25)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 반응구는 0.
- 수용성 탄닌의 정량은 AOAC에 준하여 정량하였다. 즉, 100배 희석한 시료용액 1ml에 Folin-Denis시약 5 ml가 하고 포화 Na2CO3 용액 10ml를 가하여 혼합한 후 증류수로 최종 volume을 100 ml로 맞춘 후 30분간 실온에서 방치하고 760 nm에서 흡광도를 측정한 것을 미리 작성한 표준곡선의 흡광도값과 비교하여 함량을 산출하였다.
성능/효과
- ACE 저해율의 contour map과 반응표면 (Fig. 6)을 보면 ACE 저해율은 온도에는 거의 영향을 받지 않았고 에탄올의 농도에는 영향을 받았는데 용매농도 27%에서 최고치를 나타내었다.
- Contour map과 반응표면을 보면 에탄올의 '농도가 높을수록, 추출온도가 낮을수록 수용성 탄닌의 함량이 증가하는 경향이 나타났으며, 에탄올의 농도 30-35%, 추출온도 78~80℃ 범위에서 가장 높은 함량을 얻을 수 있을 것으로 예측되었다.
- 7의 빗금친 부분에서 나타난 바와 같이 모든 반응변수를 공통으로 만족하는 전체적인최적 추출조건 범위는 Thble 3에서와 같이 추출온도 78~81℃, 에탄올 농도 33~35%로 나타났다. 따라서 감잎 음료 제조시 최적 추출조건으로 추출시간 2시간, 추출온도 80℃, 에탄올 농도 34%로 감나무 잎을 추출하는 것으로 결정하였다.
- 0100으로서 1%이내의 유의수준에서 인정되었다. 이 때 예측된 정상점은 안장점이므로 능선분석을 실시하여 본 결과, 수용성 탄닌의 최대값은 5.31%로 예측이 되었다. 이때 추출조건은 에탄올의 농도 27.
- 0036으로서 1%이내의 유의수준에서 인정되었다(Table 2). 이때 예측된 정상점은 안장점이므로 능선분석을 실시하여 본 결과, 가용성 고형분의 최대값은 18.42%로 예측이 되었다. 이때 추출조건은 에탄올의 농도 32.
- 00이으로서 1%이내의 유의수준에서 인정되었다(Table 2). 이때 예측된 정상점은 안장점이므로 능선분석을 실시하여 본 결과, 투과도의 최대값은 19.37%로 예측이 되었다. 이때 추출조건은 에탄올의 농도 2.
- 전자공여작용에 대한 contour map과 반응표면을 보면 에탄올의 농도가 높을수록 증가하는 경향을 보였다. 이때 전자공여작용은 에탄올 농도가 25-40%, 추출온도 76~88℃에서 높게 나타났다.
- Table 4에 나타내었다. 최적 추출조건 범위내에서 추출물의 가용성 고형분 함량게 대한 실측치는 반응표면분석으로부터 얻어진 예측치의 범위보다 약간 높았다. 탁도 및 전자공여능에 대한 실측치는 예측치의 범위에 속하였으나, 수용성 탄닌함량, XOase 저해 및 ACE 저해율에 대한 실측치는 예측치 보다 다소 낮은 값을 나타내었다.
- 71%, 추출온도 838VC이었다. 추출조건별 탁도 변화에 대한 contour map 과 반응표면을 보면 에탄올의 농도가 증가할수록, 추출온도가 높을수록 XOase 저해율은 증가하는 경향이 나타났으며 , 에탄올 농도 20% 이상, 추출온도 80℃이상에서 높은 저해효과 2를 나타낸 것으로 나타났다.
- 111 이었다. 추출조건별 탁도 변화에 대한 contour map과 반응표면을 보면 에탄올의 농도가 감소할수록, 추출온도가 높을수록 투과도가 증가하는 경향이 나타났으며 , 에탄올 농도 20% 이하, 추출온도 80℃ 이상에서 높은 투과도를 나타낸 것으로 나타났다.
- 최적 추출조건 범위내에서 추출물의 가용성 고형분 함량게 대한 실측치는 반응표면분석으로부터 얻어진 예측치의 범위보다 약간 높았다. 탁도 및 전자공여능에 대한 실측치는 예측치의 범위에 속하였으나, 수용성 탄닌함량, XOase 저해 및 ACE 저해율에 대한 실측치는 예측치 보다 다소 낮은 값을 나타내었다.
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