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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 한국 전통 장류의 기능성 탐색 연구의 일환으로 Bacillus subtilus CH-1023을 이용한 청국장 발효과정 중 고혈압 유발인자인 angiotensin converting enzyme의 저해 peptide를 분리하고 저해효과를 검토함으로서 전통발효식품인 청국장이 가지는 새로운 기능성을 입증하고, 한국 전통장류의 우수성을 입증하기 위한 과학적 접근을 하고자 하였다.
제안 방법
- 35ml 첨가로 반응을 중지시킨 뒤 3mZ의 ethylacetate를 첨가하였다. Ethylacetate층만을 취한 다음 용매를 증류시킨 잔사에 2 m/의 증류수를 첨가하여 효소에 의해 기질로부터 분리되어 추출된 hippuric acid를 280nm에서 흡광도를 측정한 후 표준곡선에서 양을 환산하여 아래의 식에 의해 저해율을 계산하였다.
- 증자한 콩에 균주를 접종하고 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃의 각각의 배양온도에서 0~72시간동안 배양한 후 20mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)를 가해 6시간동안 진탕 추출하고 그 여액의 protease activity를 측정하였다.
- 증자한 콩에 균주 접종 후 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃의 각각의 배양온도에서 0~72시간동안 배양한 후 20mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)를 가해 6시간동안 진탕 주줄하고 그 여액의 ACE 저해효과를 측정하였다.
- 0)와 함께 파쇄하고 6시간 교반한 후 8000 rpm으로 10분간 원심분리 흐)였다. 상징액을 Whatman No. 2 여과지로 여과한 여액을 Diaflo membrane YM-3(Amicon Inc. USA)에 통과시키고 농축하였으며, 농축된 시료는 Sephadex G-10(Sigma Co. USA) column3X 60 cm)과 Sephadex G-25(Sigma Co. USA) column(3 X60cm)을 이용하여 20 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)로 gel nitration한 후 저해작용을 나타내는 분획만 모아서 동결건조 하였다.
- 유리관에 20 mg의 각각의 시료와 6 N HC1 을 넣고 질소 충진시킨 후 밀봉하고 105℃에서 24시간 동안 산 가수분해한 후 아미노산 자동분석기로 분석하였다.
- 농축된 활성분획 A와 B 각각을 소량의 20mM sodium phosphate buffer(pH 7.0) 에 녹인 후 Sephadex G-25 column (3X60 cm)에 주입하고 0.5mZ/min의 유속으로 5.5ml/tube씩 분획하였다. 그 결과 Fig.
- 증자하였다. 증자 후 냉각시키고, 된장에서 분리하여 상주대학교 식품공학과에서 보관중인 Bacillus subtilis CH-1023을 공시균으로 사용하여, 균주 1.16X104(CFU/mZ)을 접종하여 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃에서 0~72시간 동안 배양하면서 6시간 단위로 마쇄하여 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 대두는 한국산 중립의 태백종을 시중에서 구입하여 사용하였으며, 정선한 콩을 10℃에서 20시간 동안 침지 후 물빼기를 하고 40 g씩 삼각 flask에 넣어 121℃에서 60분간 증자하였다. 증자 후 냉각시키고, 된장에서 분리하여 상주대학교 식품공학과에서 보관중인 Bacillus subtilis CH-1023을 공시균으로 사용하여, 균주 1.
데이터처리
- 실험 측정결과는 평균점수로 나타내며 그 평균값 사이의 유의차는 ANOVA test를 이용하였고, Duncan's Multiple Range Test28)로 95% 수준으로 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 단백질 정량은 Lowry 등26의 방법에 따라 측정하였으며, bovine serum albumin(Sigma Co. USA)을 사용한 표준곡선에 의하여 환산하였다.
- 추출액의 protease 활성은 Anson-Hagihara의 방법27)으로 측정하였으며, 효소액 ImZ가 1분간에 1ug의 tyrosine을 생성하는 것을 1 unit로 정하였다. 이때 tgrosine을 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
성능/효과
- 증자한 콩에 Bacillus subtilis CH-1023 균주 접종 후 20℃, 30℃, 40℃, 5(rc, 60℃의 정온기에서 0~72시간 동안 배양하면서 6시간 간격으로 20 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)를 가해 6시간 동안 진탕 추출 후 6시간 간격으로 ACE저해효과를 측정한 결과는 Table 3과 같이 단백질 용출율과 protease activity가 높았던 40℃, 60시간의 배양조건에서 ACE 저해율이 가장 높은 45.95%의 저해를 나타내었다. 이는 protease activity가 가장 높은 조건에서 대두단백질의 분해에 의해 용출된 peptide량이 가장 많아 ACE 저해활성도 높은 것으로 판단되었다.
- 0)를 가하여 균질화 시켜준 뒤 4℃에서 24시간동안 교반하여 추출하고 여과한 후 8000rpm에서 20분간 원심 분리하여 상징액인 청국장 추출물을 얻었다. 추출물은 Diaflo YM-3 membrane ultrafiltration을 통하여 분자량 3000이하의 peptide를 얻은 후 각각의 용액에 대해 ACE저해활성을 측정한 결과는 Table 4와 같이 추출물의 ACE저해활성은 54.1%였고, 분자량 3,000 이하의 peptide 획분의 ACE저해활성은 61.1%로 높게 나타났다. 이는 Shin 등25)의 ultrafiltrate한 된장 peptide의 ACE 저해활성 41.
- 1-1 과 같이 A, B, C, 3개의 분획으로 나타났다. 용출된 분획별로 ACE저해활성을 측정한 결과는 Table 5와 같이 B에서 86.73%로 ACE저해활성이 높게 나타났고, A에서도 약 31%의 저해가 나타났다. 이는 peptide가 완전히 분리되지 않아서 A와 B 분획에 동시에 저해활성이 나타난 것으로 판단되었으며, ACE저해활성이 나타난 A, B 분획은 각각 동결건조 하여 농축하였다.
- 1-m과 같이 B-l, B-2로 2개의 분획으로 분리되었다. 용출된 분획의 ACE 저해활성을 측정한 결과는 Table 6과 같이 A-2, B-2에서 각각 84.16%, '84.30%로 ACE저해활성이 높게 나타났으며 A-1 과 B-1 분획에서는 ACE 저해활성이 나타나지 않았다. A-2와 B-2는 Sephadex G-25 gel filtration시 같은 fraction No.
- 에서 분획되는 것으로 보아 동일 peptide로 판단되었다. 청국장 추출물로부터 ACE 저해 peptide를 정제한 결과 250 g의 청국장으로부터 271 mg의 건조 peptide* 얻을 수 있었다. Bacillus subtilis CH-1023을 이용한 청국장의 정제 peptide의 농도에 의한 ACE 저해 결과는 Table 7과 같이 첨가 peptide 양이 0.
- 청국장 추출물로부터 ACE 저해 peptide를 정제한 결과 250 g의 청국장으로부터 271 mg의 건조 peptide* 얻을 수 있었다. Bacillus subtilis CH-1023을 이용한 청국장의 정제 peptide의 농도에 의한 ACE 저해 결과는 Table 7과 같이 첨가 peptide 양이 0.5 mg과 1.0 mg일 때 각각 94.27%와 96.84%의 저해를 나타내었고, peptide의 양이 많을수록 ACE 저해활성이 높아지는 것이 관찰되었다.
- 가수분해한 액을 여과한 후 rotary evaporator를 사용하여 염산을 완전히 증발시킨 다음 아미노산 자동분석기로 분석한 결과는 Table 8과 같이 alanine, phenylalanine, histidine이 35.50%, 28.64%, 1526%로 높은 함량을 나타났다. 이는 Suh 등24)이 된장에서 정제한 peptide의 아미노산 조성이 alanine, phenylalnanin이55.
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