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문제 정의
- 본 실험에서는 발효식품 속에 함유된 ethyl carbamate (urethane)의 대사 활성물질인 vinyl carbamate(VC)와 최 종 발암물질인 vinyl carbamate epoxide(VCO) (Fig. 1)로각각 유발한 마우스 피부종양 생성이 홍삼정분에 의해 억 제되는지 조사하였으며. 돌연변이성 및 DNA adduct 형성 에 대한 억제효과도 같이 조사하였다.
- 본 연구에서는 VC와 VCO로 Salmonella typhimurium TA1535 균주에 유발한 돌연변이에 대한 홍삼정분의 억제 효과를 조사하여 VC와 VCO의 돌연변이 활성이 홍삼정분 에 의해 용량 의존적으로 억제되는 것을 관찰하였다. S-9 으로 처리한 50 μg의 VC에 의한 돌연변이성이 500μg의 홍삼정분에 의해 완전히 억제된 반면.
- 본 연구는 1994년도 한국담배인삼공사에서 시행한 출연 연구사업의 연구결과로 이에 감사드린다.
제안 방법
- EG는 Oesch와 Docijei의 방법으로 guanine 과 cbloroacetaldehyde로부터 합성하였다(Oesch와 Doeijer, 1982). 합성한 화합물들은 원소분석, NMR, Mass spectro- scopy를 이용하여 순도를 확인한 후 실험에 사용하였다.
- High performance liquid chromatography(HPLC)는 U6K injector, solvent programmer, solvent delivery system (Waters, USA)과 fluorometric delector(Kralos, Schoeeffel Division, Westwood, NJ)가 달린 chromatography system 을 사용하였으며. Chromegabond reverse-phase strong cation exchange(RP-SCX) column(5 |im pai'ticle size, 4.
- glucose 6-phosphate dehydrogenase)과 에탄올 을 처리한 ICR 마우스 간장으로부터 분리된 postmito- chondrial fraction(S-9)> 첨가하였으며 VCO의 경우에는S-9을 첨가하지 않고. 홍삼정분을 가하거나 가하지 않은상태에서 생성되는 histidine positive revertants의 수를 세었다.
- 실험군당 ICR 마우스 30마리씩을 사용하여 아무것도 처리하지 않은 대조군, 홍삼정분 처리군, VC 처리군. VCO 처리군, VC와 홍삼정분 처리군, VCO와 홍삼정분 처리군고로 구분하여 실험하였다.
- 실험군당 ICR 마우스 30마리씩을 사용하여 아무것도 처리하지 않은 대조군, 홍삼정분 처리군, VC 처리군. VCO 처리군, VC와 홍삼정분 처리군, VCO와 홍삼정분 처리군고로 구분하여 실험하였다. 마우스 등의 털을 깎고 발암제를 바르기 하루 전에 0.
- 2 ml 녹여 마우스 등에 도포하였다. 발암제를 도포한 일주일 후부터 일주일에 두 번씩 TPA 용 액을 14주 동안 국소도포하였다. 홍삼 정분은 발암제 처치 하루 전과 10분 전에 생리식염수 1 ml에 5 mg의 홍삼정분 을 녹여 위장관 투여 (0.
- 발암제를 도포한 일주일 후부터 일주일에 두 번씩 TPA 용 액을 14주 동안 국소도포하였다. 홍삼 정분은 발암제 처치 하루 전과 10분 전에 생리식염수 1 ml에 5 mg의 홍삼정분 을 녹여 위장관 투여 (0.5m〃10g body weight) 하였으며. 이후에는 3mg/ml게 급수에 용해하여 매일 투여하였다.
- Salmonella typhimurium TA1535 균주를 사용하여 S-9으로 처리한 V(가 처리하지 않은 VCO로 각각 유발한 돌 연변이성에 대한 홍삼청분의 억제효과를 조사하였다. VC(50 μg/plate)로 유발한 돌연변이성 이 홍삼정분의 용량 에 의존적으로 억제되었으며 (Fig.
- DNA adduct를 형성하도록 시험관 내에서 VCO와 DNA를 반응시킨 후, 산E로 처리하여 가수분해하였다. 산 가수분해산물을 HPLC로 분리한 후, 형광분석으로 정량한 결과 guanine adduct인 OEG와 EG가 형성되었음을 확인 하였다.
- VO4 VCO를 ICR 마우스 피부에 국소도포하여 피부종 양을 유발하는 과정에서 홍삼정분을 투여하였을 때 , 홍삼 정분에 의해 종양형성 이 예방되거나 억제되는지를 조사하였다. 발암제를 국소도포하기 하루 전과 1(분 전에 위장관 투여를 하고, TPA를 국소도포하는 20주 동안 음용수로 홍 삼정분을 마우스에 공급하면서 종양발생율(tumor yield; 실험에 사용된 동물 중 종양이 발생된 동물의 %)와 종양생성율(tumor multiplicity; 실험동물당 생성된 종양 수의 평균값)를 측정하여 Fig.
- VCO를 ICR 마우스 피부에 국소도포하여 피부종 양을 유발하는 과정에서 홍삼정분을 투여하였을 때 , 홍삼 정분에 의해 종양형성 이 예방되거나 억제되는지를 조사하였다. 발암제를 국소도포하기 하루 전과 1(분 전에 위장관 투여를 하고, TPA를 국소도포하는 20주 동안 음용수로 홍 삼정분을 마우스에 공급하면서 종양발생율(tumor yield; 실험에 사용된 동물 중 종양이 발생된 동물의 %)와 종양생성율(tumor multiplicity; 실험동물당 생성된 종양 수의 평균값)를 측정하여 Fig. 6의 결과를 얻었다. 실험 20주에서 VCO를 국소도포한 실험군에서 실험동물당 평균 3.
대상 데이터
- 발암물질로부터 형성될 수 있는 DNA aclduct(Fig. 2)인 OEG와 EG를 합성하여 DNA adduct 정량시 표준물질로 사용하였다. OEG는 Park 등의 방법으로 합성궁}였다 (Park 등, 1993).
- 연세의료원 임상의 학연구센터 실험동물부에서 근교배 번식 사육한 6주령 자성 ICR 마우스를 사용하였다. 마우 스에는 표준 고형사료를 공급하였으며 급수는 자유롭게 하였고 실험 전기간 동안 항온, 항습으로 유지하였다.
- 8을 사^하여 flow rale는 0.5 으로 하였고 255 nm excitation wavelength오! 345 nm emmition cut-off filter를 사용하였다.
- 실험에 사용된 홍삼정분은 한국인삼연초연구소로부터 공급받아 사용하였다.
이론/모형
- 실험에 사용한 vinyl carbamate, vinyl carbamate epoxide, 7-(2'-oxoethyl)guanine(OEG), N2 3_ethenoguanine(EG}은다음과 같이 합성하여 사용하였다- VC는 Dahl 등의 방법(Dahl 등, 1980)으로 vinyl chloroformate와 100% ammonia gas를 이용하여 합성한 후 무수 ethyl ethei로 재결정 하였다.
- VCO 힙성에 필요한 dimethyldioxirane(DMDO) ^7 OXONE(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)과 아세 톤을 이용하여 Adam 등의 방법으로 합성한 다음(Adam 등, 1987), 0.1 M의 DMD0-아세톤 용액에 Molecular sieve 4A를 기하여 물을 제거하고 저온실에서 진탕하여 여과한 후 사용하볐다. vCg Pai-k 등의 방법으로 합성 하였다(Park 등.
- 1 M의 DMD0-아세톤 용액에 Molecular sieve 4A를 기하여 물을 제거하고 저온실에서 진탕하여 여과한 후 사용하볐다. vCg Pai-k 등의 방법으로 합성 하였다(Park 등. 1993J.
- Salmonella typhimurium TA1535 균주를 사용하여 VC와 VCO에 의한 돌연변이성에 대한 홍삼정분의 억제효과를 Ames 등의 방법으로 조사하였다(Ames 등. 1975). VC 의 경우에 NADPH generating system(NADP, glucose 6- phosphate.
- 0)에 녹이고 260 nm에서 UV 흡광도를 측정하여 정량한 후, 1/10 부피의 1 M HCJ 용액을 가하여 37。0에서 18시간 동안 산가수분 해하였다. HPLC를 사용하여 Fcdtke 등의 방법으로 가수 분해 산물의 OEG와 EG를 정량하였다(Fedtke 등, 1989). 이때 10% 아세토나이트릴이 함유된 ammonium fonuale 완충용액, pH 2.
성능/효과
- Salmonella typhimurium TA1535 균주를 사용하여 S-9으로 처리한 V(가 처리하지 않은 VCO로 각각 유발한 돌 연변이성에 대한 홍삼청분의 억제효과를 조사하였다. VC(50 μg/plate)로 유발한 돌연변이성 이 홍삼정분의 용량 에 의존적으로 억제되었으며 (Fig. 3A); 500|ig의 흥삼정분 으로 처리시 VC의 농도를 10~50 ug까지 변화시키면서 유 발한 돌연변이가 거의 완전히 억제되었다(Fig. 3B). VC의 최종대사산물인 VCO(5 μg/plate)에 의한 돌연변이성도 흥 삼정분에 의해 용량의존적으로 억제되었으며(Fig.
- 3B). VC의 최종대사산물인 VCO(5 μg/plate)에 의한 돌연변이성도 흥 삼정분에 의해 용량의존적으로 억제되었으며(Fig. 4A), VCO의 농도를 10~50nmo1(1.03~5.15, ug/plate)로 변화시 키면서 유발한 돌연변이가 500 μg 및 1000 μg의 흥삼정분 에 의해 현저히 억제되는 것을 관찰하였다(Fig. 4B).
- DNA adduct를 형성하도록 시험관 내에서 VCO와 DNA를 반응시킨 후, 산E로 처리하여 가수분해하였다. 산 가수분해산물을 HPLC로 분리한 후, 형광분석으로 정량한 결과 guanine adduct인 OEG와 EG가 형성되었음을 확인 하였다. 형성된 adduct의 대부분은 OEG였으며 EG는 5% 이하로 생성되었다.
- 6의 결과를 얻었다. 실험 20주에서 VCO를 국소도포한 실험군에서 실험동물당 평균 3.9개의 유두종양이 생성되었으며 실험동물의 97%에서 종양이 발생되었으나 홍삼정분을 투여한 실험군 에서는 실험동물 당 평균 LD개의 유두종양이 관찰되었고 실험동물의 53% 에서 유두종양이 관찰되었다- 또한 VCO의 전단계 물질인 VC를 국소도포한 실험군에서는 실험 20주에서 실험동물당 평균 16개의 유두종양과 실험군의 63%에서 유두종양이 관찰된 반면, 홍삼정분을 투여한 군에서는 평균 0.67개의 유두종양과 실험군의 47%에서 종양이 관찰되었다. 이들 결과로부터 홍삼정분이 VC 또는 VCO로 유발한 마우스 피부종양의 발생을 현저히 억제하는 것을 알 수 있었다.
- 67개의 유두종양과 실험군의 47%에서 종양이 관찰되었다. 이들 결과로부터 홍삼정분이 VC 또는 VCO로 유발한 마우스 피부종양의 발생을 현저히 억제하는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구에서 시험관내에서 DNA를 VCO로 처리한 결과 OEG가 주요 adduct로 생성되었으며 EG는 5% 이하로 생 성되었다. 홍삼정분으로 처리시 OEG 생성은 25.
- 본 연구에서 시험관내에서 DNA를 VCO로 처리한 결과 OEG가 주요 adduct로 생성되었으며 EG는 5% 이하로 생 성되었다. 홍삼정분으로 처리시 OEG 생성은 25.4% 억제 되었으며, EG의 생성은 28 5% 억제되었다. OEG는 돌연 변이를 일으킬 수 있는 부위를 glianine 보다 더 쉽게 만 들기는 하지만 DNA 전사시 miscoding하는 능력은 거의 없는 것으로 알려져 있다(Barbin과 Laib, 1985: Loeb, 1985).
- VC나 VCO를 마우스 피부에 국소도포하고 20주 동안 TPA로 처리하였을 때, VC를 처리한 군보다 VCO를 처리 한 군에서 종양발생율과 종양생성율이 훨씬 더 높게 나타났다. 그러나 발암물질을 처리하기 전과 TPA를 처리하는 동안 홍삼정분을 투여한 군에서는 종양발생율과 종양생성 율이 모두 현저히 억제되었다.
- 이상의 결과로부터, 홍삼정분은 VC가 최종 발암물질인 VCO로 활성화되는 것을 억제하고, VCO와 DNA의 adduct 형성을 억제함으로써 발암물질인 VC와 VCO에 대해서 뛰어난 암예방효과를 나타내는 것을 확인하였다. 그러나 홍삼의 암예방 기전이나 암예방효과를 나타내는 활 성 성분에 대해서는 명확히 알려져 있지 않는 만큼 이에 대한 많은 연구들이 진행되어야 할 것으로 생각된다.
후속연구
- 이상의 결과로부터, 홍삼정분은 VC가 최종 발암물질인 VCO로 활성화되는 것을 억제하고, VCO와 DNA의 adduct 형성을 억제함으로써 발암물질인 VC와 VCO에 대해서 뛰어난 암예방효과를 나타내는 것을 확인하였다. 그러나 홍삼의 암예방 기전이나 암예방효과를 나타내는 활 성 성분에 대해서는 명확히 알려져 있지 않는 만큼 이에 대한 많은 연구들이 진행되어야 할 것으로 생각된다.
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