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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 에틸카바메이트의 분석 효율을 높이기 위해 내부표준물질 별 회수율을 비교하여 분석법을 개발하고, 상업적으로 제조된 매실주와 가정에서 직접 제조된 매실주의 에틸카바메이트 함량을 분석하여 비교하였다.
제안 방법
- 검출한계(limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하여 3.3×σ/S (σ, 반응의 표준편차; S, 검량선의 기울기)와 10×σ/S로 계산하였다.
- 농축액을 v-vial로 옮기고 37℃로 설정된 질소농축기(MG-2200, EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 1 mL로 정확하게 농축하였다. 기체크로마토그래프/질량분석기로 에틸카바메이트를 정성 및 정량 분석하였다. 모든 시료는 3회 반복실험한 후 평균과 상대표준편차를 산출하였다.
- 내부표준용액에 디클로로메탄을 가해 내부표준물질 농도는 100 ng/mL로 하고, 표준물질은 8가지 농도(50, 100, 200, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 3,000 ng/mL)로 검량선을 작성하였다. 내부표준물질과 표준물질의 농도비를 X축으로 하고, 면적비를 Y축으로 작성된 검량곡선을 이용하여 에틸카바메이트를 정량하였다.
- 내부표준용액에 디클로로메탄을 가해 내부표준물질 농도는 100 ng/mL로 하고, 표준물질은 8가지 농도(50, 100, 200, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 3,000 ng/mL)로 검량선을 작성하였다. 내부표준물질과 표준물질의 농도비를 X축으로 하고, 면적비를 Y축으로 작성된 검량곡선을 이용하여 에틸카바메이트를 정량하였다.
- 소주 10 g에 표준물질 50, 500, 3,000 ng을 첨가하여 시료 전처리와 동일한 방법으로 에틸카바메이트를 분석하였다. 동일한 날에 3가지 농도를 각각 5반복하거나(intra-day), 서로 다른 날짜에 5일 동안 매일 1회씩 반복하여(inter-day) 회수율과 상대표준편차를 %로 산출하였다. 검출한계(limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하여 3.
- SPE 컬럼의 충전물이 primary-secondary amine 또는 florisil인 경우에는 유기산과 같은 저분자 화합물이 잔존한다는 제한이 있다. 따라서 본 연구에서는 유기산 함량이 높은 매실주의 특성을 고려하여 흡착제(sorbent)가 규조토(diatomite)인 Chem Elut으로 저분자 화합물을 제거하였다.
- 분석법의 정확성을 높이기 위해 2가지 내부표준물질을 사용하여 시료를 전처리하였다. 식품의약품안전처(KFDA 2008)에서 에틸카바메이트 시험법에 사용된 부틸카바메이트(butyl carbamate)와 에틸카바메이트의 에틸기 수소 5개가 중수소(deuterium)로 치환된 d5-에틸카바메이트(d5-ethyl carba mate)가 내부표준물질로 각각 이용되었다(Table 1).
- 선택 이온질량은 SIM(selected ion monitoring) 방법으로 m/z 62, 74, 89는 에틸카바메이트와 부틸카바메이트의 정량에, m/z 64, 76, 94는 d5-에틸카바메이트의 정량에 사용되었다. 선택성과 감도가 높은 토막이온(fragments)인 m/z 62와 m/z 74의 비율을 이용하여 에틸카바메이트를 정성 분석하였다.
- 소주 10 g에 표준물질 50, 500, 3,000 ng을 첨가하여 시료 전처리와 동일한 방법으로 에틸카바메이트를 분석하였다. 동일한 날에 3가지 농도를 각각 5반복하거나(intra-day), 서로 다른 날짜에 5일 동안 매일 1회씩 반복하여(inter-day) 회수율과 상대표준편차를 %로 산출하였다.
- AOAC 방법(AOAC 2000)에서 사용된 프로필카바메이트(propyl carbamate)는 생산이 중단되었기 때문에 제외되었다. 식품의약품안전청의 고시(KFDA 2008)에서 사용된 부틸카바메이트(butyl carbamate)와 에틸카바메이트의 에틸기 수소 5개가 중수소(deuterium)로 치환된 d5-에틸카바메이트로 전처리하여 회수율을 비교하였다. 소주 시료에서 에틸카바메이트 18.
- 에틸카바메이트 분석법의 정확성을 높이기 위해 2가지 내부표준물질(Table 1)을 사용하여 회수율을 비교하였다. 에틸카바메이트의 내부표준물질로 프로필카바메이트, 부틸카바메이트, d5-에틸카바메이트가 사용되어 왔다(Kim et al 2010; Lim et al 2011; Huang et al 2013).
- 식품의약품안전처(KFDA 2008)에서 에틸카바메이트 시험법에 사용된 부틸카바메이트(butyl carbamate)와 에틸카바메이트의 에틸기 수소 5개가 중수소(deuterium)로 치환된 d5-에틸카바메이트(d5-ethyl carba mate)가 내부표준물질로 각각 이용되었다(Table 1). 회수율(recovery)을 측정하기 위해 매실주의 주 원료인 소주를 사용하였으며, 소주의 에틸카바메이트의 함량을 측정해 그 양을 제외한 후 회수율이 계산되었다. 소주에 첨가한 부틸카바메이트와 에틸카바메이트의 양은 각각 500 ng이었으며, 각 실험은 3회 반복하여 평균과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 산출하였다.
대상 데이터
- 염화나트륨은 SAMCHUN CHEMICAL(Pyoungtaek, Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였으며, 정제컬럼(Chem Elut, 50 mL)은 Agilent Technologies(Milwaukee, WI, USA)에서 구입하였다. 각 가정에서 담근 매실주는 경기도, 경상도, 전라도, 충정도 지역에서 총 10개 시료가 수집되었다. 시중에서 판매되고 있는 상업용 매실주 5개는 마트에서 구입되었다.
- 디클로로메탄(dichloromethane)은 J.T.Baker(Center Valley, PA, USA)의 HPLC급을 구입하였고, 에틸카바메이트, 부틸카바메이트, 수산화나트륨은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서, d5-에틸카바메이트는 C/D/N Isotopes(Pointe-Claire, Quebec, Canada)에서 구입하였다. 염화나트륨은 SAMCHUN CHEMICAL(Pyoungtaek, Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였으며, 정제컬럼(Chem Elut, 50 mL)은 Agilent Technologies(Milwaukee, WI, USA)에서 구입하였다.
- 그 중 m/z 62와 64가 주봉우리로 나타나 높은 감도(sensitivity)와 선별성(selectivity)을 고려하여 정량에 이용되었다. 선택이온 모드(SIM mode)에서 감도를 높이기 위해 6개 토막이온(m/z 62, 64, 74, 76, 89, 94)이 수집되었다. 내부표준물질인 d5-에틸카바메이트와 분석물질인 에틸카바메이트는 각각 15.
- 각 가정에서 담근 매실주는 경기도, 경상도, 전라도, 충정도 지역에서 총 10개 시료가 수집되었다. 시중에서 판매되고 있는 상업용 매실주 5개는 마트에서 구입되었다.
- 분석법의 정확성을 높이기 위해 2가지 내부표준물질을 사용하여 시료를 전처리하였다. 식품의약품안전처(KFDA 2008)에서 에틸카바메이트 시험법에 사용된 부틸카바메이트(butyl carbamate)와 에틸카바메이트의 에틸기 수소 5개가 중수소(deuterium)로 치환된 d5-에틸카바메이트(d5-ethyl carba mate)가 내부표준물질로 각각 이용되었다(Table 1). 회수율(recovery)을 측정하기 위해 매실주의 주 원료인 소주를 사용하였으며, 소주의 에틸카바메이트의 함량을 측정해 그 양을 제외한 후 회수율이 계산되었다.
- 에틸카바메이트의 내부표준물질로 d5-에틸카바메이트가 선정되었다. 에틸카바메이트의 일내(intra-day), 일간(inter-day) 정밀도를 측정한 결과, 회수율은 92.
- 에틸카바메이트의 정성 및 정량분석을 위해 사용한 기기는 GC/MSD(7820A Gas Chromatograph-5977E Mass Spectrometer, Agilent Technologies, Shanghai, China)였다. 컬럼은 DB-WAX(Agilent Technologies, 30 m×0.
- Louis, MO, USA)에서, d5-에틸카바메이트는 C/D/N Isotopes(Pointe-Claire, Quebec, Canada)에서 구입하였다. 염화나트륨은 SAMCHUN CHEMICAL(Pyoungtaek, Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였으며, 정제컬럼(Chem Elut, 50 mL)은 Agilent Technologies(Milwaukee, WI, USA)에서 구입하였다. 각 가정에서 담근 매실주는 경기도, 경상도, 전라도, 충정도 지역에서 총 10개 시료가 수집되었다.
- 컬럼은 DB-WAX(Agilent Technologies, 30 m×0.25 mm i.d., 0.25 µm film thickness)를 사용하였고, 운반기체는 99.9999%의 헬륨가스를 1 mL/min의 유속으로 하였다.
데이터처리
- 기체크로마토그래프/질량분석기로 에틸카바메이트를 정성 및 정량 분석하였다. 모든 시료는 3회 반복실험한 후 평균과 상대표준편차를 산출하였다.
- 회수율(recovery)을 측정하기 위해 매실주의 주 원료인 소주를 사용하였으며, 소주의 에틸카바메이트의 함량을 측정해 그 양을 제외한 후 회수율이 계산되었다. 소주에 첨가한 부틸카바메이트와 에틸카바메이트의 양은 각각 500 ng이었으며, 각 실험은 3회 반복하여 평균과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 산출하였다.
이론/모형
- 시료는 70 eV의 에너지에 의해 전자 충격 이온화법(electron impact ionization)으로 이온화되었으며, 150℃의 사중극자형(quadrupole) 질량분석관을 통해 이온이 분리되었다. 선택 이온질량은 SIM(selected ion monitoring) 방법으로 m/z 62, 74, 89는 에틸카바메이트와 부틸카바메이트의 정량에, m/z 64, 76, 94는 d5-에틸카바메이트의 정량에 사용되었다. 선택성과 감도가 높은 토막이온(fragments)인 m/z 62와 m/z 74의 비율을 이용하여 에틸카바메이트를 정성 분석하였다.
- 오븐온도는 60℃에서 90℃까지 분당 10℃로 승온하고, 130℃까지 분당 2℃로 승온 후 5분간 유지한 후 220℃까지 분당 20℃로 승온하고, 3분간 유지하여 물질을 분리시켰다. 시료 주입방법은 비분할법(splitless)을 사용하였으며, 주입구와 transfer line 및 ion source 온도는 각각 210, 240, 230℃였다. 시료는 70 eV의 에너지에 의해 전자 충격 이온화법(electron impact ionization)으로 이온화되었으며, 150℃의 사중극자형(quadrupole) 질량분석관을 통해 이온이 분리되었다.
- 시료 주입방법은 비분할법(splitless)을 사용하였으며, 주입구와 transfer line 및 ion source 온도는 각각 210, 240, 230℃였다. 시료는 70 eV의 에너지에 의해 전자 충격 이온화법(electron impact ionization)으로 이온화되었으며, 150℃의 사중극자형(quadrupole) 질량분석관을 통해 이온이 분리되었다. 선택 이온질량은 SIM(selected ion monitoring) 방법으로 m/z 62, 74, 89는 에틸카바메이트와 부틸카바메이트의 정량에, m/z 64, 76, 94는 d5-에틸카바메이트의 정량에 사용되었다.
- 에틸카바메이트의 추출방법은 AOAC 방법(AOAC 2000)과 식품의약품안전처의 고시방법(KFDA 2008)에 근거하였다. 1 N 수산화나트륨 용액을 소량씩 첨가하면서 pH meter(3200P, Agilent Technologies, Shanghai, China)를 이용하여 pH를 7∼8정도로 중화시켰다.
성능/효과
- 8가지 농도의 에틸카바메이트와 d5-에틸카바메이트의 농도비와 면적비를 통해 검량선을 작성한 결과, 상관계수(R2)의 값이 0.9992로 직선성(linearity)을 나타내었다. 이는 에틸카바메이트와 d5-에틸카바메이트의 회수율과 반복성이 일정하여 농도의존적으로 농도비가 증가함에 따라 면적비 또한 일정하게 증가하였음을 보여준다.
- 선택이온 모드(SIM mode)에서 감도를 높이기 위해 6개 토막이온(m/z 62, 64, 74, 76, 89, 94)이 수집되었다. 내부표준물질인 d5-에틸카바메이트와 분석물질인 에틸카바메이트는 각각 15.44분, 15.68분에서 검출되어 크로마토그램에서 완벽하게 분리되었다(Fig. 4).
- 상업용 매실주보다는 가정에서 담근 매실주에서 검출된 에틸카바메이트의 함량이 비교적 높게 나타났다. 또한, 매실주의 숙성기간은 에틸카바메이트 농도와 양의 상관관계를 보였다. 즉, 매실의 침지기간과 매실이 분리된 후 숙성기간이 매실주의 에틸카바메이트 함량에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
- 매실의 침출 기간이 길어질수록, 침출 온도가 높을수록 에틸카바메이트 함량도 증가되었다. 매실을 침출할 때 자외선의 양이 많으면 암실이나 냉장고에 보관한 것보다 에틸카바메이트 함량이 높아졌다. 90일 동안 설탕만으로 숙성한 매실엑기스에서는 에틸카바메이트가 검출되지 않은 반면에, 알코올과 숙성하였을 때는 60일부터 에틸카바메이트가 검출되었다(Kim et al 2013b).
- Hwang et al(2009)은 16%와 30% 알코올 농도의 매실주를 45일에서 180일까지 저장기간이 길어질수록 에틸카바메이트 함량이 증가하였다고 보고하였다. 매실의 침출 기간이 길어질수록, 침출 온도가 높을수록 에틸카바메이트 함량도 증가되었다. 매실을 침출할 때 자외선의 양이 많으면 암실이나 냉장고에 보관한 것보다 에틸카바메이트 함량이 높아졌다.
- 매실주의 주재료인 소주에 3가지 농도의 에틸카바메이트(50, 500, 3,000 ng)를 첨가하여 분석한 결과, 92.54∼103.59%의 회수율을 나타내었고, 상대표준편차는 0.87∼5.64%로 각 반복 횟수 간 편차가 크지 않음을 확인하였다(Table 3).
- 40 ppb까지 최대 5배까지 높아졌다고 보고하였다. 본 연구에서 매실이 술에 8년간 침지되었던 것으로 확인된 매실주의 에틸카바메이트 함량은 2,546.67 ppb로 가장 높았다. 반면에, 10년 동안 숙성된 시료의 에틸카바메이트 함량은 666.
- CODEX에서 제시한 정량분석에 적합한 회수율 범위는 70∼120%, 상대표준편차 범위는 10∼20% 이내이어야 한다. 본 연구의 회수율과 상대표준편차는 CODEX의 분석기준에 부합되었기 때문에 에틸카바메이트 분석법으로 적합하였다. 분석법의 검출한계는 1.
- 5), 시료 별 3회 반복의 상대표준편차는 20%를 넘지 않았다. 분석된 매실주의 에틸카바메이트 함량 범위는 최소 118.48 ppb부터 최대 2,640.42 ppb이었다. 이는 Kim et al(2013b)의 연구에서 보고된 대형 유통매장에서 구매한 매실주의 에틸카바메이트 평균함량인 79.
- 9992)을 나타내었다. 상업용 매실주보다는 가정에서 담근 매실주에서 검출된 에틸카바메이트의 함량이 비교적 높게 나타났다. 또한, 매실주의 숙성기간은 에틸카바메이트 농도와 양의 상관관계를 보였다.
- 이는 에틸카바메이트와 d5-에틸카바메이트의 회수율과 반복성이 일정하여 농도의존적으로 농도비가 증가함에 따라 면적비 또한 일정하게 증가하였음을 보여준다. 에틸카바메이트와 d5-에틸카바메이트의 질량스펙트럼을 비교한 결과, 분자이온(m/z 89과 m/z 94), 메틸기가 제거된 토막이온(m/z 74와 m/z 76), 에틸기가 제거된 후 McLafferty 자리옮김 반응산물(m/z 62와 64)이 공통적으로 나타났다(Fig. 3). 그 중 m/z 62와 64가 주봉우리로 나타나 높은 감도(sensitivity)와 선별성(selectivity)을 고려하여 정량에 이용되었다.
- 에틸카바메이트의 일내(intra-day), 일간(inter-day) 정밀도를 측정한 결과, 회수율은 92.54∼103.59%, 상대표준편차는 0.87∼5.64%로 CODEX 기준에 부합하였다.
- 3배 높게 검출되었다. 이러한 결과는 매실 원액의 함량, 첨가물, 침지기간이 에틸카바메이트 생성에 영향을 준다는 것을 보여준다.
- 매실 과육만으로 매실주를 제조하였을 때는 에틸카바메이트가 생성되지 않은 반면에, 매실씨로 제조된 경우에는 에틸카바메이트가 생성되었다(Hwang et al 2009). 이러한 연구결과를 종합해 보면, 본 연구에서 수집된 매실주는 각기 다른 방법으로 제조되었기 때문에 에틸카바메이트 농도 범위가 큰 것으로 사료된다.
- 일반적으로 3개월 후에 매실을 분리하는 것과 달리, 이 시료는 1년 동안 매실을 분리하지 않고 숙성된 시료였다. 전체적으로 매실주의 숙성 기간은 에틸카바메이트 함량과 양의 상관관계(R2=0.3328)를 나타냈다(Fig. 5). 에틸카바메이트 생성은 매실의 분리 시기 등 다양한 요인의 영향을 받기 때문에 본 실험에서는 숙성기간이 강한 요인으로 작용하지는 않은 것으로 생각된다.
- 또한, 매실주의 숙성기간은 에틸카바메이트 농도와 양의 상관관계를 보였다. 즉, 매실의 침지기간과 매실이 분리된 후 숙성기간이 매실주의 에틸카바메이트 함량에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
- 집에서 담근 매실주의 에틸카바메이트 함량은 129.19∼2,546.67 ppb로 상업용 매실주의 함량(153.91∼1,193.36 ppb)보다 2배 이상 넓게 분포되었다.
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