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문제 정의
- 본 연구에서는 IHNV-NW의 역할을 확인하기 위한 첫 단계로 써 THNV의 NV 유전자를 클로닝하여 이를 분석하였다. 실험 재 료로는 한국에서 분리된 IHNV-PRT strain을 사용하였는데, 이 strain은 기존에 보고된 바 있는 ITON의 어떤 strain과도 혈청학 적인 특성이 다른 것이었다(16).
- 본 연구에서는 한국에서 분리된 IHNV sirain인 IHNV-PRT의 특성을 보다 명확히 규명하기 위하여 IHNVPRT의 NV의 cDNA 를 클로닝하여 유전자의 염기 서열을 분석하였으며, IHNV의 증 시에 있어서 NW가 필요한지의 여부를 확인하기 위하여 바이러 스 감염 후 발현양상 및 antisense oligonucleotide# 사용하여 발 현을 억제 시킨 후 IWW의 성장에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- gDNA의 합성은 Xhol 부위를 지 니는 hybrid oligo (dT) linker-primer와 MMLVRT를 사용하여 수행하였다. DNA polymerase I을 사용하여 dsDNA를 만든 후 EcoRI adapter를 붙였다. DNA를 Xhol으로 살라 DNA 양쪽에 EcoRI과 Xhol의 cohesive end를 만든 후 lambda ZAP vector의 EcoRL-XhoL 부위에 ligation 시켰다.
- , USA)를 사용하여 수행하였 다. DNA 염기서열과 이로부터 유추한 아미노산 서열을 GenBank에 존재하는 유전자믈과 비교 분석을 하였다. 유전자 의 아미노산 서열을 비교 분석하기 위하여 CLUSTAL W (18) program을 사용하였다.
- DNA polymerase I을 사용하여 dsDNA를 만든 후 EcoRI adapter를 붙였다. DNA를 Xhol으로 살라 DNA 양쪽에 EcoRI과 Xhol의 cohesive end를 만든 후 lambda ZAP vector의 EcoRL-XhoL 부위에 ligation 시켰다. Recombinant lambda DNA 를 lambda phage에 package한 후 이를 E.
- CHSE-214 서'!포에 IHNVPRT를 1 moi가 되도록 접종한 후 4℃(3에서 1시간 동안 배양하 였다. EMEM으로 3회 세척한 다음 FBS가 5% 들어 있는 EMEM을 첨가한 다음 antisense oligonucleotide를 0, 10, 20, 30, 50 uM의 농도로 첨가하였다. 에서 30시간 배양한 다 음 배양액에 존재하는 바이러스의 titer를 TCID50 방법으로 측 정하였다.
- IHNV-PRT의 NV의 아미노산 서열을 여러 지역에서 분리된 IHNV strain들과 Hirame rhabdovirus 그리고 viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV)의 NV 유전자의 아미노산 서열과 비 교 분석하였다(Fig. 2). 그림 2A에서 볼 수 있듯이 IHNV-PRT의 NV는 외국에서 분리된 IHNV strain들의 NV들과 90-95% 상동 성을 보였다.
- 한국에서 분리된 IHNV-PRT strain의 NV 유전지를 클로닝하기 위하여 먼저 cDNA Libraj를 제조하였다. IHNVPRT가 감염된 CHSE-214 세포에서 mRNA를 추출한 디음 이로부터 cDNA를 만들었으며 이를 AZAP vector-^ Eco^-Xhvl 부위에 ligation시켜 클로닝 하였다. 이와 같이 제조된 cDNA library에서 IHNV-PRT의 NV를 screening하기 위하여 probe를 제조하였다.
- cDNA library로부터 IHNV의 유전자를 지니는 clone들을 screening하고, 또한 Northern blotting 실험에 사용하기 위하여 PCR을 수행함으로써 probe를 제조하였다. IHNV의 NV의 PCR primer는 이미 보고(13)된 바 있는 IHNV-WRAC의 염기서열을 참고하여 제작하였다. 본 연구에 사용한 PCR primer^ 다음과 같다; sense, 5'-CGAA7TCTCTTITGATGACGG-3'; antisense, 5'- CGAATTCTATCTGGGATAAGC-3L CHSE-214 세포에 THNV- PRT를 감염시키고 25 시간 지난 후에 guanidium thiocyanate- acid phenol-chloroform 법(4)을 사용하여 total RNA를 추출하였 다.
- NV가 IHNV의 증식에 필요한지의 여부를 확인하기 위하여 IHNV에 감염된 세포에 NV의 antisense oligonucleotide를 처리한 후 바이러스의 성장을 확인하였다. 대조구로 사용하기 위하여 IHNV의 막단백질로 알려진 G의 antisense oligonucleotide를 처 리한후 바이러스의 성창을 확인하였다.
- NV가 IHNV의 증식에 필요한지의 여부를 확인하기 위하여 antisense oligonucleotide# 제직하여 NV의 발현 억제 실험을 수 행하였다. 이 실험의 대조구로써 의 구조단백질인 Glycoprotein (G)유전자의 antisense oligonucleotide도 같이 제작하였 다.
- 5 U의 Taq-polymerase와 5 pmole의 sense와 antisense primer들을 넣고 DNA를 증폭 시켰다 DNA 증폭은 92°C (30 sec), 55°C(30 sec) 그리고 72°C(30 sec)의 순서로 35 cycle을 수 행하였다. PCR 산물을 pGEM-T vector (Promega) 에 클로닝한 후 염기서열을 분석하여 IHNV-NV 유전자인지의 여부를 확인하 였다. pGEM-T vector에 클로닝된 IHNV-NV의 PCR 산물을 ERI을 사용하여 잘라낸 후 random priming kit (Stratagen)와 Lcc-32P]-dCTP< 사용하여 32P-labeled DNA probe를 만들었 으며 이를 cDNA library의 screening 및 Northern blotting에 사용하였다.
- DNA를 Xhol으로 살라 DNA 양쪽에 EcoRI과 Xhol의 cohesive end를 만든 후 lambda ZAP vector의 EcoRL-XhoL 부위에 ligation 시켰다. Recombinant lambda DNA 를 lambda phage에 package한 후 이를 E. coli XLl-Blue MRF' strain에 감염 시켜 cDNA library를 제조하였다. 앞에서와 같이 제조한 33P-labelled DNA를 probe로 하여 cDNA library 중 IHNV-PRT의 NV gene에 대한 clone들을 screenmg하였다.
- 세표 시료에서 4M guanidine thiocyanate를 사용한 방법으로 total RNA를 추출하였다. Total RNA 20 ug을 65℃에서 5분간 반응시켜 denature 시킨 다음 3% formaldehyde가 첨가된 1% agarose gel에 전기영동 을 하였다 Gel을 EtBr로 염색하여 rRNA의 양 및 상태를 확 인한 다음 nirrocelJuJose :membrane에 capillary blot방법으로 transfer하였다. Membrane을 prchybridization 용액 (5X SSC, 45% formamide, 0.
- CHSE-214 세포에 IHNV-PRT를 감염시킨 후 25시간 때에 guanidium thiocyanate-acid phenol-chloroform 법을 사용하여 total RNA를 추출하였다. Total RNA에서 o]jgo(dT)30-Latex suspension (QIAGEN Inc, USA)을 사용하여 mRNA롤 분리한 다옴 cDNA cloning kit (Stralagene; ZAP-cDNA Synthesis kit)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. gDNA의 합성은 Xhol 부위를 지 니는 hybrid oligo (dT) linker-primer와 MMLVRT를 사용하여 수행하였다.
- cDNA library로부터 IHNV의 유전자를 지니는 clone들을 screening하고, 또한 Northern blotting 실험에 사용하기 위하여 PCR을 수행함으로써 probe를 제조하였다. IHNV의 NV의 PCR primer는 이미 보고(13)된 바 있는 IHNV-WRAC의 염기서열을 참고하여 제작하였다.
- Total RNA에서 o]jgo(dT)30-Latex suspension (QIAGEN Inc, USA)을 사용하여 mRNA롤 분리한 다옴 cDNA cloning kit (Stralagene; ZAP-cDNA Synthesis kit)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. gDNA의 합성은 Xhol 부위를 지 니는 hybrid oligo (dT) linker-primer와 MMLVRT를 사용하여 수행하였다. DNA polymerase I을 사용하여 dsDNA를 만든 후 EcoRI adapter를 붙였다.
- PCR 산물을 pGEM-T vector (Promega) 에 클로닝한 후 염기서열을 분석하여 IHNV-NV 유전자인지의 여부를 확인하 였다. pGEM-T vector에 클로닝된 IHNV-NV의 PCR 산물을 ERI을 사용하여 잘라낸 후 random priming kit (Stratagen)와 Lcc-32P]-dCTP< 사용하여 32P-labeled DNA probe를 만들었 으며 이를 cDNA library의 screening 및 Northern blotting에 사용하였다.
- Probe는 PCR을 사용하여 제조하였는데. 기존에 외국에서 분리되 어 보고 (13)된 바 있는 1HNV-WRAC strain의 염기서열로부터 NV의 PCR primer들을 만들었다. 이를 사용하여 RT-PCR을 수행한 결 과 260 bp 정도의 PCR 산물을 얻을 수 있었다.
- NV가 IHNV의 증식에 필요한지의 여부를 확인하기 위하여 IHNV에 감염된 세포에 NV의 antisense oligonucleotide를 처리한 후 바이러스의 성장을 확인하였다. 대조구로 사용하기 위하여 IHNV의 막단백질로 알려진 G의 antisense oligonucleotide를 처 리한후 바이러스의 성창을 확인하였다. 먼저 G의 antisense oligonucleotide를 처리한 경우 20 uM 이후부터 바이러스의 증식 이 1/100이하로 급격히 억제됨이 확인되었다.
- IHNV의 NV의 PCR primer는 이미 보고(13)된 바 있는 IHNV-WRAC의 염기서열을 참고하여 제작하였다. 본 연구에 사용한 PCR primer^ 다음과 같다; sense, 5'-CGAA7TCTCTTITGATGACGG-3'; antisense, 5'- CGAATTCTATCTGGGATAAGC-3L CHSE-214 세포에 THNV- PRT를 감염시키고 25 시간 지난 후에 guanidium thiocyanate- acid phenol-chloroform 법(4)을 사용하여 total RNA를 추출하였 다. 추출한 total RNA 1 ug을 M-MLV reverse transcriptase (GibcoBRL, USA)를 사용하여 cDNA를 제조하였다.
- 이들이 1HNV의 NV 유전자의 단편이 맞는지를 확인하기 위하여 염기서열을 분석한 후 GenBank의 database에 수록된 유전자들과의 유사성을 분석한 결과 각각 JHNV의 NV와 높은 유사성을 보임이 확인되 었다, 따라서 이들을 probe로 하여 cDNA library를 screening하 였다. 세 차례의 greening과정을 거친 후 IHNV-PRT^ NV의 완전한 길이를 포함하는 클론들을 선별하였다.
- 세포에 IHNV NV gene의 발현 양을 측정하기 위하여 Northern blotting을 수행하였따. 세표 시료에서 4M guanidine thiocyanate를 사용한 방법으로 total RNA를 추출하였다. Total RNA 20 ug을 65℃에서 5분간 반응시켜 denature 시킨 다음 3% formaldehyde가 첨가된 1% agarose gel에 전기영동 을 하였다 Gel을 EtBr로 염색하여 rRNA의 양 및 상태를 확 인한 다음 nirrocelJuJose :membrane에 capillary blot방법으로 transfer하였다.
- coli XLl-Blue MRF' strain에 감염 시켜 cDNA library를 제조하였다. 앞에서와 같이 제조한 33P-labelled DNA를 probe로 하여 cDNA library 중 IHNV-PRT의 NV gene에 대한 clone들을 screenmg하였다.
- 이를 사용하여 RT-PCR을 수행한 결 과 260 bp 정도의 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 이들이 1HNV의 NV 유전자의 단편이 맞는지를 확인하기 위하여 염기서열을 분석한 후 GenBank의 database에 수록된 유전자들과의 유사성을 분석한 결과 각각 JHNV의 NV와 높은 유사성을 보임이 확인되 었다, 따라서 이들을 probe로 하여 cDNA library를 screening하 였다. 세 차례의 greening과정을 거친 후 IHNV-PRT^ NV의 완전한 길이를 포함하는 클론들을 선별하였다.
- IHNVPRT가 감염된 CHSE-214 세포에서 mRNA를 추출한 디음 이로부터 cDNA를 만들었으며 이를 AZAP vector-^ Eco^-Xhvl 부위에 ligation시켜 클로닝 하였다. 이와 같이 제조된 cDNA library에서 IHNV-PRT의 NV를 screening하기 위하여 probe를 제조하였다. Probe는 PCR을 사용하여 제조하였는데.
- 추출한 total RNA 1 ug을 M-MLV reverse transcriptase (GibcoBRL, USA)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 제조한 cDNA에 0.5 U의 Taq-polymerase와 5 pmole의 sense와 antisense primer들을 넣고 DNA를 증폭 시켰다 DNA 증폭은 92°C (30 sec), 55°C(30 sec) 그리고 72°C(30 sec)의 순서로 35 cycle을 수 행하였다. PCR 산물을 pGEM-T vector (Promega) 에 클로닝한 후 염기서열을 분석하여 IHNV-NV 유전자인지의 여부를 확인하 였다.
대상 데이터
- 이 실험의 대조구로써 의 구조단백질인 Glycoprotein (G)유전자의 antisense oligonucleotide도 같이 제작하였 다. 본 실험에 사용한 antisense oligonucleotides의 염기서열은 다 음과 같다- NV antisense oKgonucleotide, 5-ITCGCGGTGGTCCAITGGTCrC-3 부분의 reverse complementary sequence); NV scrambled oligonucleotide, 5- ACAGCAGCAIACGACGAGCAG 3; G antisense oligonucleotide. 5-CATGGTGTCCATrGTTTTGGT-3 (염기서열 —9~+12의 reverse complementary sequence): G scrambled oligonucleotide, 5- AAGCTAGACTAACAGCACACA-3.
- 유전자 의 아미노산 서열을 비교 분석하기 위하여 CLUSTAL W (18) program을 사용하였다. 비교 분석에 사용한 유전자들은 다음과 같다; IHNV-K (X73872). IHNV-WRAC (L40883).
- 세포배양 및 바이러스 1HNV의 숙주세푸라서 CHSE-214 (Chinook Salmon Embryos) (10) cell line을 사용하였다 세포는 fetal bovine serum0] 10% 첨가된 minimum essential medium (MEM)을 사용하여 18℃(2에 서 배양하였다. IHNW를 접종한 세포의 경우 16^에서 배양하였 다.
- 본 연구에서는 IHNV-NW의 역할을 확인하기 위한 첫 단계로 써 THNV의 NV 유전자를 클로닝하여 이를 분석하였다. 실험 재 료로는 한국에서 분리된 IHNV-PRT strain을 사용하였는데, 이 strain은 기존에 보고된 바 있는 ITON의 어떤 strain과도 혈청학 적인 특성이 다른 것이었다(16). 이들의 아미노산 서열을 외국에 서 분리된 IHNV straiii들의 NV 단백질들과 비교 분석한 결과 90-95%의 상동성을 보여 이들 유전지가 매우 잘 보존되어 잇음 을 알 수 있었다.
- IHNW를 접종한 세포의 경우 16^에서 배양하였 다. 실험에 사용한 바이러스는 한국의 양식 어류에서 분리된 IHNV 중 대부분을 차지하며 또한 한국에만 존재하는 것으로 확 인된 type (IHNV-PRT) (16)을 선택하여 실험하였다
- NV가 IHNV의 증식에 필요한지의 여부를 확인하기 위하여 antisense oligonucleotide# 제직하여 NV의 발현 억제 실험을 수 행하였다. 이 실험의 대조구로써 의 구조단백질인 Glycoprotein (G)유전자의 antisense oligonucleotide도 같이 제작하였 다. 본 실험에 사용한 antisense oligonucleotides의 염기서열은 다 음과 같다- NV antisense oKgonucleotide, 5-ITCGCGGTGGTCCAITGGTCrC-3 부분의 reverse complementary sequence); NV scrambled oligonucleotide, 5- ACAGCAGCAIACGACGAGCAG 3; G antisense oligonucleotide.
- 본 연구에 사용한 PCR primer^ 다음과 같다; sense, 5'-CGAA7TCTCTTITGATGACGG-3'; antisense, 5'- CGAATTCTATCTGGGATAAGC-3L CHSE-214 세포에 THNV- PRT를 감염시키고 25 시간 지난 후에 guanidium thiocyanate- acid phenol-chloroform 법(4)을 사용하여 total RNA를 추출하였 다. 추출한 total RNA 1 ug을 M-MLV reverse transcriptase (GibcoBRL, USA)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 제조한 cDNA에 0.
- 한국에서 분리된 IHNV-PRT strain의 NV 유전지를 클로닝하기 위하여 먼저 cDNA Libraj를 제조하였다. IHNVPRT가 감염된 CHSE-214 세포에서 mRNA를 추출한 디음 이로부터 cDNA를 만들었으며 이를 AZAP vector-^ Eco^-Xhvl 부위에 ligation시켜 클로닝 하였다.
이론/모형
- CHSE-214 세포에 IHNV-PRT를 감염시킨 후 25시간 때에 guanidium thiocyanate-acid phenol-chloroform 법을 사용하여 total RNA를 추출하였다. Total RNA에서 o]jgo(dT)30-Latex suspension (QIAGEN Inc, USA)을 사용하여 mRNA롤 분리한 다옴 cDNA cloning kit (Stralagene; ZAP-cDNA Synthesis kit)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
- DNA 염기서열 분석은 기초과학지원센터의 automatic DNA sequencer (Applied Biosystems. Inc., USA)를 사용하여 수행하였 다. DNA 염기서열과 이로부터 유추한 아미노산 서열을 GenBank에 존재하는 유전자믈과 비교 분석을 하였다.
- 특정 바이러스 유전자의 역할을 알기 위하여 바이러스 감염의 어느 시기에 발현하는 지를 확인하는 것이 중요하다. NV의 역할 을 예측하기 위한 첫 단계로써 바이러스 감염 후 어느 시기부터 발현되는 지의 여부를 확인하기 위하여 Northern blotting을 수행 하였다. 바이러스 감염 후 5시간 간격으로 세포의 total RNA를 추출하여 NV의 mRNA의 양을 확인한 결과 감염후 20 시간 정 도부터 뚜렷하게 증가하기 시작하였다(Fig, 3B).
- 세포에 IHNV NV gene의 발현 양을 측정하기 위하여 Northern blotting을 수행하였따. 세표 시료에서 4M guanidine thiocyanate를 사용한 방법으로 total RNA를 추출하였다.
- EMEM으로 3회 세척한 다음 FBS가 5% 들어 있는 EMEM을 첨가한 다음 antisense oligonucleotide를 0, 10, 20, 30, 50 uM의 농도로 첨가하였다. 에서 30시간 배양한 다 음 배양액에 존재하는 바이러스의 titer를 TCID50 방법으로 측 정하였다.
성능/효과
- IHNV-PRT의 NV는 hirame rhabdovirus 와 VHSV의 NV와는 각각 51%, 10%의 상동성을 보여 오랜 기간동안의 진화과정 중 변이가 발생하였고 그 결과 서로 다른 기능을 수행할 것이라고 추측을할수있다.
- IHNVPRT의 NV 단백짚이 IHNV strain들과는 높은 상동성을 보였지만 다른 종인 HRV 및 VHSV의 NV와는 51%, 10%의 비 교적 낮은 상동성을 보였다. 이로부터 이들간에는 진화학직으로 상당히 오랜 시간 전에 분리되어 각각 다른 특성을 지니는 바이 러스로 진화하여 나갔음을 나타내 준다.
- IHNV는 다섯 종류의 구조단백질 즉, polymerase (L), surface glycoprotein (G), nucleocapsid (N), 그리고 matrix protein (Ml과 M2)으로 이루어져 있으며(11, 12) 핵산으로 단일가닥의 (-)RNA> 지니고 있다(14). IHNV의 genomic RNA(3, 19)와 mRNA(8)을 분 석한 결과 다섯 종류의 구조 단백질 이외에 비구조 단백질인 non-virion (NV)을 암호화하는 유전자가 존재함이 확인되었으며 유전자의 배열이 3LN-M1-M2-G-NV-L5임이 밝혀졌다.
- 그림 2A에서 볼 수 있듯이 IHNV-PRT의 NV는 외국에서 분리된 IHNV strain들의 NV들과 90-95% 상동 성을 보였다. NV의 상동성을 부분적으로 살펴보면 N-말단 쪽보 다는 C-말단 쪽이 높은 상동성을 보였으며 특히 55번째 아미노 산 잔기 (Leu)에서부터 79번째 아미노산 잔기 (Leu>까지는 지금 까지 보고된 IHNV 모든 strain외 NV 염기서열이 동일하였다.아직까지 NV의 역할이 무엇인지는 알려진 바가 없다.
- 이로부터 바이러스의 증식에 있어서 NV가 중요한 역할을 할 것이라고 추측을 하였다 그러나 어 류의 rhabdovirus 들 중 hirame rhabdovirus, IHNV, viral haemonhagic septicemia 등의 바이러스에는 NV가 존재하는 반 면 vesiculovirus-like fish rhabdovirus 에는 NV가 존재하지 않음 이 확인되어 (9), IHNV가 포함되어 있는 어류 rhabdovirus의 증식 에 있어서는 NN가 필요하지 않을 가능성이 높음을 암시하였다. 그리고 Johnson둥⑺은 어류 rhabdovirus의 일종인 snakehead ihabdovinis의 NV 유전자를 knock out 시킨 바이러스를 제조한 후 체포에 접종한 결과 바이러스 증식에 변화가 없음을 확인하 여 배양중인 세포에서는 NV가 필요하지 않음을 확인하였다.
- 대조구로 사용하기 위하여 IHNV의 막단백질로 알려진 G의 antisense oligonucleotide를 처 리한후 바이러스의 성창을 확인하였다. 먼저 G의 antisense oligonucleotide를 처리한 경우 20 uM 이후부터 바이러스의 증식 이 1/100이하로 급격히 억제됨이 확인되었다. 반면에 NV의 antisense oligonucleotide를 처리한 경우, 바이러스의 증식이 약 1/10 정도로 감소함이 확인되었다.
- NV의 역할 을 예측하기 위한 첫 단계로써 바이러스 감염 후 어느 시기부터 발현되는 지의 여부를 확인하기 위하여 Northern blotting을 수행 하였다. 바이러스 감염 후 5시간 간격으로 세포의 total RNA를 추출하여 NV의 mRNA의 양을 확인한 결과 감염후 20 시간 정 도부터 뚜렷하게 증가하기 시작하였다(Fig, 3B). 바이러스의 성장 곡선과 비교하여 보았을 때 이 시기는 바이러스 감염 말기로써 감염성 있는 바이러스가 만들어지기 시작하는 때임이 확인되었다(Fig.
- 4). 이 결과로부터 IHNV-PR77} 세포주에서 증식을 할 때 NW는 반드시 필요하지는 않음을 확인할 수 있었다.
- 실험 재 료로는 한국에서 분리된 IHNV-PRT strain을 사용하였는데, 이 strain은 기존에 보고된 바 있는 ITON의 어떤 strain과도 혈청학 적인 특성이 다른 것이었다(16). 이들의 아미노산 서열을 외국에 서 분리된 IHNV straiii들의 NV 단백질들과 비교 분석한 결과 90-95%의 상동성을 보여 이들 유전지가 매우 잘 보존되어 잇음 을 알 수 있었다. 이는 IHNV의 NV가 strain과는 무관하게 모든 IHNV가 거의 유사한 구조를 지니고 있으며IHNV가 살아가는데 필수적인 역할을 수행하고 있음을 나타내주는 것이라고 할 수 있다.
- Northern blotting 결과 바이러스 감염의 말기인 감염 후 20시간 정도에서부터 발현이 증가하였다. 이로부터 NW는 바 이러스의 단백질 및 핵산의 합성에 관여하지 많고 감염 말기인 단백질 및 핵산의 결합, virion의 방출 혹은 감염 말기의 어떤 밀에 관여 할 것임을 확인 할 수 있었다. 만약 NV가 바이러스 의 감염 말기 어떤 과정 중에 필수저인 일을 수행하는 경우, NV 유전자의 발현을 억제하면 바이러스의 증식이 억제될 것이 다.
- 만약 NV가 바이러스 의 감염 말기 어떤 과정 중에 필수저인 일을 수행하는 경우, NV 유전자의 발현을 억제하면 바이러스의 증식이 억제될 것이 다. 이를 확인하기 위하여 IHNV에 감염된 세포에 NV의 antisense oligonucleotide를 처리한 후 바이러스의 증식을 확인하 였다 대조구로써 IHNV G의 antisense oligonucleotide# 처리한 결과 IHNV의 증식이 심하게 억제된 반면 NV를 처리한 경우에는 NV에 특이한 억제 효과가 나타나지 않았다. 이 결과는 Johnson 등C7)이 NV knock out 바이러스를 사용하여 실험한 결 과와 일치하는 것으로써, 세포주에서 fish rhabdovirus가 증식할 때 NV가 필수적이지 많음을 나타낸다.
후속연구
- NW가 이와 유사한 역할을 수행할지 의 여부는 바이러스 감염된 세포에서의 MHC class I 발현의 변 화여무를 관찰하고 만약 변화가 있는 경우 NV만을 transfection 시켰을 때 같은 현상이 일어나는 지를 확인하여야 할 것이다. 21 리고 NV에 돌연변이가 일어난 IHNV 돌연변이를 제작하여 숙주 에 감염시킨 후 질병을 유발하는 지의 여부를 확인하면 NV의 역할에 대하여 보다 자세한 이해가 가능할 것이다.
- Cytomegalovirus^ 경우 US2, US3, US6 그리고 USJI 듬의 단백질을 사용하여 바이러스 감염된 세포의 MHC classl 발현을 억제하여 cytotoxic T lymphocyte로부터의 공격을 막고⑴ 다른 한편으로는 MHC class I과 유사한 단벡질을 민들어 세포 표면에 발현함으로써 natural killer cell로부터의 공격으로부터 바이러스 감염된 세포를 보호하는 역할을 수행한다(6, 18). NW가 이와 유사한 역할을 수행할지 의 여부는 바이러스 감염된 세포에서의 MHC class I 발현의 변 화여무를 관찰하고 만약 변화가 있는 경우 NV만을 transfection 시켰을 때 같은 현상이 일어나는 지를 확인하여야 할 것이다. 21 리고 NV에 돌연변이가 일어난 IHNV 돌연변이를 제작하여 숙주 에 감염시킨 후 질병을 유발하는 지의 여부를 확인하면 NV의 역할에 대하여 보다 자세한 이해가 가능할 것이다.
- 이와 같이 여러 종류의 IHNV strain에 잘 보존되어 있는 NV가 어떤 역할을 수행할 것인지를 확인하기 위하여 Northern blotting을 수행하였다 비구조 단백질인 NV가 만약 단백질 및 핵산의 합성에 관여를 한다면 바이러스 감염 초기에 발현될 것 이고 반대로 이미 합성된 단백질 및 핵산의 assembly 혹은 virion의 방출에 관여한다면 바이러스 감염 말기에 발현이 증가 할 것이다. Northern blotting 결과 바이러스 감염의 말기인 감염 후 20시간 정도에서부터 발현이 증가하였다.
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