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문제 정의
- 본 연구에서는 이미 확보되어 있는 HBsAg에 대한 단세포군 anti-HBs 항체를 활용하여 금 입자를 이용하는 면역 크로마토그래피 kit를 개발하였다.
- ICA의 원리는 검체 속에 들어있는 항원이 유색입자에 결합된 표식 자 항체와 결합하여 nitrocellulose(NC)막의 미세구멍을 통하여 이동하는 중 막에 고정되어 있는 포획항체와 결합하여 발색띠를 형성함으로써 양성 . 음성을 육안으로 판별하는 것이다. 이 방법은 희석이나 세척 등의 조작이 필요 없이 단순하게 시료를 몇 방울만 떨어뜨리면 판독이 가능하므로 전문가가 아닌 사람도 쉽게 사용할 수 있고 도구나 기계 없이 사용할 수 있으며 실험결과도 counter나 reader 같은 기계를 사용해야 하는 기존의 방법들과는 달리 육안으로 판정할 수 있다.
제안 방법
- H30-1-6 hybridoma cell을 Balb/c 마우스 한 마리 당 "씩 복강에 주사하여 약 2주일 후 복수를 채취하였다. 여기에 동량의 50% 포화 황산암모늄((NHQ2SO4, Sigma, 미국) 용액을 가하여 4C에서 1시간 정치시킨 후 10, 000Xg로 30 분간 원심분리하여 침전물을 phosphate-buffered saline(PBS)으로 투석하였다.
- 사용하였다. Backing plate(3M, 미국)에 고정된 NC막, conjugate pad 및 아래와 위쪽에 흡습여지(Whatman, 독일)를 lamination module (BIODOT사, 미국)을 사용하여 붙이고 절단기를 사용하여 0.6 mm의 폭으로 절단하여 assay strip을 제조하였다.
- Pore size 0.8 의 NC막(Schleicher & Schuell사, 독일)에 Bioject dispenser(BIODOT사, 미국)를 사용하여 1 mg/ml의 goat anti-HBs(Jackson Lab사, 미국) 용액을 분사하여 양성선 (test line)을 긋고 37℃ 항온기에서 하룻밤 동안 정치시켜 항체를 막에 고정시켰다. 대조선(control line)에는 goat antimouse IgG(Jackson Lab사, 미국)를 사용하였다.
- 고려 대 학교 부속병 원 임 상병 리 과에서 Behringer Manheim 사(독일)의 Enzygnost HBsAg로 음성 혹은 양성으로 판정된 혈청을 수집하여 위와 같은 방법으로 제조된 assay strip을 미리 strip에 맞게 준비된 cassette housing(6x58 nun) 에 넣어 kit 조립을 완성하고 kit의 sample well에 혈청 160 pl를 가하여 대조선 혹은 양성선이 확실하게 나타나는 시간을 측정하였다.
- 다시 200 V에서 1 시간, 500 V에서 30 분간 연속하여 전개시킨 후 IEF gel을 고정액(100 mM sulphosalicylic acid, 700 mM TCA) 에서 30분간 고정시켰다. 고정된 gel을 Coomassie blue 염색액(0.1% Coomassie brilliant blue R-250, 45% methanol, 10% glacial acetic acid)으로 10분간 염색한 후 탈색액(10% methanol, 10% 잉acial acetic acid)으로 탈색하여 Imagemaster VDS(Fuji him사, 일본)로 촬영하였다.
- 독일의 Paul-Urlhich Institute로부터 구입한 HBsAg 표준용액을 0.01% BSA가 포함된 PBS로 2배 연속 희석하여 각각의 농도별로 160 /〃씩 시험관에 가하고 여기에 assay strip을 수직으로 세워 넣고 5 ~ 10 분 후 양성선을 확인하였을 때 약 2 ng/M의 HBsAg 농도까지 양성으로 판정되었으므로(Figure 6) 본 assay strip의 HBsAg에 대한 검출한계는 2 ng/mC로 결정되었다.
- 독일의 Paul-Urlhich Institute로부터 구입한 HBsAg 표준용액을 0.01% BSA가 포함된 PBS로 2배 연속 희석하여 각각의 농도별로 160 J11 씩 assay strip에 가하여 양성으로 판정되는 최대 희석배수의 HBsAg 농도를 검출한계(detection limit)로 결정하였다.
- 5 ml 씩 가하여 30분간 교반하고 나서 상온에서 냉각하였다. 또한 각각의 반응용액을 spectrophoto- meter(Shimazu Model UV-265, 일본)를 사용하여 500—600 nm 파장에서 scanning하였고 전자현미경 사진으로 입자의 크기를 확인하였다.
- 면 역 크로마토그래피 진단방법을 이 용하는 B형 간염 스크리 닝 kit를 개발하기 위하여 두가지의 항체를 이용하였다. 표식 자항체로 사용된 것은 단세포군항체 anti-HBs이고 포획항체 는 goat anti-HBs인데 포획항체는 니트로셀룰로즈 막에 고정 되고 표식자항체는 금 입자에 결합된다.
- 주사하여 약 2주일 후 복수를 채취하였다. 여기에 동량의 50% 포화 황산암모늄((NHQ2SO4, Sigma, 미국) 용액을 가하여 4C에서 1시간 정치시킨 후 10, 000Xg로 30 분간 원심분리하여 침전물을 phosphate-buffered saline(PBS)으로 투석하였다. 투석인 끝난 후 동량의 결합완충액(binding buffer, Pierce, 미국)과 섞어 protein A-Sepharose colunui 에 가하고 5 배량의 결합완충액으로 세척한 후 elution 완충액(Pierce, 미국)을 가하여 분리되어 나오는 정제된 항체를 수집하였다.
- 25M K2CO3 용액으로 pH를 맞추고 30 분 이내에 항체 흡착에 이용하였다. 응집곡선은 항체를 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 傩/ml의 농도로 첨가하고 10 분간 교반한 다음 10% NaCl 용액을 최종농도 1% 되게 첨가하여 응집이 되지 않는 농도를 결정한 후 사용할 금 입자 현탁액에 항체를 넣고 10 분간 교반 한 뒤, 10% 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 용액을 사용하여 최종농도가 3% 되게 첨가한 후 2 분간 교반한다. 이후 1% polyeyhylene glycol(PEG) 20, 000를 최종농도 0.
- 전술한 방법으로 제조된 assay strip을 cassette housing에 넣어 kit를 조립하고 혈청 검체 160 成를 kit의 sample well에 일정 시간 간격으로 가하여 전개도, 양성선 및 대조선의 발색 양상을 관찰하였다(Figure 5). 전개 1분 경과 후부터 양성 선이 나타나기 시작하여 시간이 경과함에 따라 색이 짙어졌으며 3분이 경과하자 대조선이 나타났으나 붉은 색 입자가 이동하는 것으로 보아 반응이 완결되지 않았음을 알 수 있었고 이 현상은 약 5분 경과 후까지 계속 되었지만 그 후에도 색깔이 계속 짙어져 반응이 계속되고 있음을 볼 수 있었다.
- 제조하였다(17). 즉 200 ml의 증류수를 끓인 후 1% 구연산나트륨을 각각 7, 3, 1 및 0.5 ml씩 첨가하여 교반하면서 4% HAuCU 용액을 0.5 ml 씩 가하여 30분간 교반하고 나서 상온에서 냉각하였다. 또한 각각의 반응용액을 spectrophoto- meter(Shimazu Model UV-265, 일본)를 사용하여 500—600 nm 파장에서 scanning하였고 전자현미경 사진으로 입자의 크기를 확인하였다.
- 여기에 동량의 50% 포화 황산암모늄((NHQ2SO4, Sigma, 미국) 용액을 가하여 4C에서 1시간 정치시킨 후 10, 000Xg로 30 분간 원심분리하여 침전물을 phosphate-buffered saline(PBS)으로 투석하였다. 투석인 끝난 후 동량의 결합완충액(binding buffer, Pierce, 미국)과 섞어 protein A-Sepharose colunui 에 가하고 5 배량의 결합완충액으로 세척한 후 elution 완충액(Pierce, 미국)을 가하여 분리되어 나오는 정제된 항체를 수집하였다.
대상 데이터
- 단세포군항체의 등전점 결정은 미국의 Novex사에서 구입한 kit로 수행하였다. 단세포군항체(H31-1-6) 2 俸을 IX 음극 완충액(pH 3-10) 10 ml에 희석한 후 동량의 IEF (isoelectric focusing) sample buffer (pH 3-10)를 첨가하였다.
- 8 의 NC막(Schleicher & Schuell사, 독일)에 Bioject dispenser(BIODOT사, 미국)를 사용하여 1 mg/ml의 goat anti-HBs(Jackson Lab사, 미국) 용액을 분사하여 양성선 (test line)을 긋고 37℃ 항온기에서 하룻밤 동안 정치시켜 항체를 막에 고정시켰다. 대조선(control line)에는 goat antimouse IgG(Jackson Lab사, 미국)를 사용하였다.
- 준비된 금 입자중 입자 크기가 40 nm 내외의 것을 사용하였다. 이 금 입자 현탁액을 소량 분획하여 0.
이론/모형
- 금 입자는 HAuCk를 구연산으로 환원시키는 방법을 사용하여 제조하였다(17). 즉 200 ml의 증류수를 끓인 후 1% 구연산나트륨을 각각 7, 3, 1 및 0.
성능/효과
- 및 항체의 농도가 매우 중요하다<20). 따라서 pH 4~8의 범위에서 항체를 5 供矿ml의 농도로 첨가하여 최적 pH를 찾아본 결과 Figure 4에 나타난 바와 같이 pH 8에서 가장 높은 홉 광도를 나타냈고 최종농도 1% NaCl에서도 응집되지 않아가장 안정된 conjugates] sol을 형성하였으며 pH 5의 경우는 대부분이 응집이 일어나 sol 형성에 실패하였다. 이러한 결과는 H31-1-6 항체의 pl가 7.
- IgG의 량이 많을 수록 결합율은 떨어지지만 총량으로는 더 많이 결합하는 것으로 보고되었으나(20) 본 실험에서는 8 您/ml 이상에서는 최적 pH라고 하더라도 conjugate가 잘 형성되지 않았다. 따라서 항체농도는 4~ 5 “8血1의 농도가 가장 적절한 것으로 판단되며 co功ugate의 활성 측면을 고려하여 최적조건인 4 阐血 보다 다소 많은 4.5 俾~5 段/ml의 항체농도를 사용하는 것이 바람직할 것이다.
- 또한 pH 8에서 항체농도를 1 阐ml ~10 까지 높이면서 실험하였을 때 4 段/ml의 항체농도에서 NaCl을 최종농도 1% 되게 가하였을 때에도 응집되지 않고 높은 흡광도를 유지하여 가장 안정된 conjugate가 제조되었다. IgG의 량이 많을 수록 결합율은 떨어지지만 총량으로는 더 많이 결합하는 것으로 보고되었으나(20) 본 실험에서는 8 您/ml 이상에서는 최적 pH라고 하더라도 conjugate가 잘 형성되지 않았다.
- 또한 Norde(21)는 항체가 금 입자에 결합할 때 단백질의 pl를 고려하여 pl 근처의 pH에서 가장 좋은 결과를 얻고 있다. 본 실험결과는 Norde(21)의 보고와 일치하는 결과로 항체의 성격에 따라 보통 pl보다 0.5정도 높은 pH에서 반응시키는 것이 좋은 것으로 판단된다.
- 관찰하였다(Figure 5). 전개 1분 경과 후부터 양성 선이 나타나기 시작하여 시간이 경과함에 따라 색이 짙어졌으며 3분이 경과하자 대조선이 나타났으나 붉은 색 입자가 이동하는 것으로 보아 반응이 완결되지 않았음을 알 수 있었고 이 현상은 약 5분 경과 후까지 계속 되었지만 그 후에도 색깔이 계속 짙어져 반응이 계속되고 있음을 볼 수 있었다. 그러나 전체적으로 양성 반응은 1분내에 시작되어 5분 정도면 확인할 수 있었다.
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