This study was conducted to investigate the effect of hormones, protein sources and anti-oxidants on in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization(IVF) of bovine follicular oocytes. The rates of Holstein follicular oocytes classified as grade A and B(50.2% and 33.2%) were higher than those of...
This study was conducted to investigate the effect of hormones, protein sources and anti-oxidants on in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization(IVF) of bovine follicular oocytes. The rates of Holstein follicular oocytes classified as grade A and B(50.2% and 33.2%) were higher than those of Hanwoo cattle(40.3% and 32.0%, P<0.05). The cumulus cell expansion rates of oocytes cultured in TCM-199 and Ham's F-10 medium supplemented with 10% FCS and hormones were higher (81.9~87.6%) than those of non-treated groups (74.5~81.7%). The fertilization rates of oocytes cultured in TCM-199 and Ham's F-10 medim supplemented with 10% FCS, 1% BSA and 10% bFF was 53.8~55.0%, 51.4~52.6%, and 47.0~50.0%, respectively. The polyspermy rates was 13.6~14.2%, 10.0~11.1%, and 10.0%, respectively. When the oocytes were cultured in TCM-199 and Ham's F-10 medium with 50${\mu}{\textrm}{m}$$\alpha$-tocopherol, the fertilization rates was 62.0 and 60.2%, respectively. In the maturation medium added of 100${\mu}{\textrm}{m}$ cysteamine, the fertilization rates was 64.7 and 66.7%, respectively. The fertilization and polyspermy rates of treated groups were higher than those of non-treated group. The results show that hormones, protein sources and anti-oxidants can provide a benefit for in vitro maturation and fertilization of bovine follicular oocytes.
This study was conducted to investigate the effect of hormones, protein sources and anti-oxidants on in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization(IVF) of bovine follicular oocytes. The rates of Holstein follicular oocytes classified as grade A and B(50.2% and 33.2%) were higher than those of Hanwoo cattle(40.3% and 32.0%, P<0.05). The cumulus cell expansion rates of oocytes cultured in TCM-199 and Ham's F-10 medium supplemented with 10% FCS and hormones were higher (81.9~87.6%) than those of non-treated groups (74.5~81.7%). The fertilization rates of oocytes cultured in TCM-199 and Ham's F-10 medim supplemented with 10% FCS, 1% BSA and 10% bFF was 53.8~55.0%, 51.4~52.6%, and 47.0~50.0%, respectively. The polyspermy rates was 13.6~14.2%, 10.0~11.1%, and 10.0%, respectively. When the oocytes were cultured in TCM-199 and Ham's F-10 medium with 50${\mu}{\textrm}{m}$$\alpha$-tocopherol, the fertilization rates was 62.0 and 60.2%, respectively. In the maturation medium added of 100${\mu}{\textrm}{m}$ cysteamine, the fertilization rates was 64.7 and 66.7%, respectively. The fertilization and polyspermy rates of treated groups were higher than those of non-treated group. The results show that hormones, protein sources and anti-oxidants can provide a benefit for in vitro maturation and fertilization of bovine follicular oocytes.
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문제 정의
따라서 본 연구는 배양액내 hormone, 단백질원 및 항산화제 첨가가 한우 미성숙 난포란의 체외성 숙과 체외수정율 및 다정자 침입율에 미치는 영향을 비교 . 조사하여, 한우 체외수정란의 효율적 생 산을 위한 자료를 제시하기 위하여 실시하였다.
본 실험은 체외성숙 배양액 내 호르몬, 단백질원 및 항산화제 첨가가 한우 미성숙 난포란의 쳬외성 숙과 수정 및 다정자 침입에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시하였다. 난포란의 등급 비교에 있어 서는 실험에 사용할 수 있는 A, B등급의 난포란이 한우보다 홀스타인 종에서 유의적으로 더 많았고, 체외성숙시 배양액내 호르몬을 첨가했을 때 난구세 포의 확장 정도는 처리구가 대조구보다 높았으나 유의적인 차이는 보이지 않았다.
따라서 본 연구는 배양액내 hormone, 단백질원 및 항산화제 첨가가 한우 미성숙 난포란의 체외성 숙과 체외수정율 및 다정자 침입율에 미치는 영향을 비교 . 조사하여, 한우 체외수정란의 효율적 생 산을 위한 자료를 제시하기 위하여 실시하였다.
제안 방법
B.O. mecbum에 ]0 mM의 caffeine(Sigma, U.S.A)을 첨가하여 정자 세척용 B.O. medium을 제 조하였고, B.O. mediml에 5 mM의 caffeine 및 Q 5% bovine serum albumin(BSA, Sigma)과 hep-arin(10 μl/ml)을 첨가하여 정자의 수정능 획득 및 성숙난자의 체외수정욤 B.O. medium을 제조하였으며, 0.22 "m syringe filter로 여과하고 15 ml cap tube(Falcon. England)에 분주하여 39"C, 5% CO2로 조절된 배양기 내에서 20시간 이상 평형시킨 후 사용하였다.
체외성숙 배양액은 TCM-199과 Ham's F-10 배 양액 에 streptomycin(100 “g/ml), penicillin G(100 unks/ml)와 hormonedO IU /ml PMSG, 10 IU /ml HCG), 단백질원CL。% FCS, 1% BSA, 10% bFF) 및 항산화제 (“-tocophero! 5.0 j“M, cysteamine 100 rM)를 첨가하여 사용하였다.
정자를 함유한 체외수정 배양액 200 M의 소적을60 mm petri-dish(Nunc)에 만든 후 mineral oil(Sigma)로 피복하고 체외성숙된 난자를 체외수정용 B.O.배양액으로 2~3회 세척한 후 정자 소적 당 45~50 개씩 옮겨 6시간 동안 CO2 incubator에서 체외수정 을 유도하였다,
흡입된난포액을 80 mm petri dish에 담아 약 5~10분한 정치한 뒤 실체 현미경 하에서 pasteur pipette을 사용하여 채취하였으며, 채취한 난포란은 3~4회세척 (TCM-199+10% FCS)하고, 난구세포 층과 세포질의 충실도에 따라 Wiemer 등(1991)의 방법에 따라 선별 - 채취하였다. 즉, 실체현미경 하에서 4~5충으로 난구세포 충이 충만하고 균일한 세포질을 가지며 전체적으로 밝은 갈색을 띤 것을 등급 A, 2~3충의 난구세포 층을 가지며 전체적으로 다소 어두운 것을 등급 B, 부분적으로 나화되었으며 전 체적으로 어두운 것을 등급 C, 난구세포층이 사방으로 퍼져 있으며 난세포질이 균일하지 않은 것을 등급 D로 구분하였으며 , 등급 A와 B에 해당하는 난포란 만을 실험에 공시하였다(Funahasi와 Day,1993).
체외수정 후 6시간 후에 체외배양액에 옮긴 후 다시 6시간 동안 체외배양시킨 수정란을 acetic acid 와 ethylalcohol을 3:1로 혼함한 용액에 48시간이상 고정시킨 후 1% orcein과 45% acetic acid로 염색하여여 위상차 현미경 하에서 난자의 수정율과 다정자 침입율을 조사하였다, 난자 내정자 또는 응성전핵이 관찰되면 정자의 침입이 이루어졌다고 판단하고, 한 개 이상의 정자와 응성전핵이 관찰되면다점자 침입으로 간주하였다(Nagai 등, 1984; Kano 등, 1994).
축협 한우 개량본부 한우 개량부에서 생산된 한우 동결정액을 익체질소탱크에서 꺼내 공기 중에서약 5초간 방치하고 38 P의 water bath에서 30초간 융해시킨 후 10 mM caffeine이 첨가된 B.O. 배양액이 담겨져 있는 15 ml 시험관에 혼합하여 희석한 다음 500 X g: 으로 5분간 2~3회 원심분리한 후, 정자 pellet 을 5 mM caffeine과 0, 5% BSA, 10 ㎍ / ml heparin이 첨가된 B.O, 배양액으로 재부유하였 다, 그 후 정자의 최종 농도가 1X106정 자 /ml가 되게 조정하여 체외수정에 대비하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 난소는 도살 직후 한우 암소에서 적출하여 penicillin G(100 units/ml)와 streptomycin sulfate(100 ㎍ /ml)가 함유된 생리시염수(30~36U)에 넣어 2시간 이내에 실험실로 운반하였다. 미성숙 난포란은 항생제가 첨가된 신선한 생리 식염수로 난소 표면을 3~4회 세 척한 후 18 gauged 주사침 이 부착된 10cc disposable syringe로 난소의 실질을 통과하지 않고 난소 표면을 조심스럽게 이동하면서 난포의 크기가 3~6mm인 난포에서 난포액과 함께 난포란을 흡입 .
데이터처리
본 실험에서 얻어진 결과는 S AS (statistical analysis system)> 이용한 chi-square test에 의해서분석하였고, P<0.05 일 때 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
채란하였다. 흡입된난포액을 80 mm petri dish에 담아 약 5~10분한 정치한 뒤 실체 현미경 하에서 pasteur pipette을 사용하여 채취하였으며, 채취한 난포란은 3~4회세척 (TCM-199+10% FCS)하고, 난구세포 층과 세포질의 충실도에 따라 Wiemer 등(1991)의 방법에 따라 선별 - 채취하였다. 즉, 실체현미경 하에서 4~5충으로 난구세포 충이 충만하고 균일한 세포질을 가지며 전체적으로 밝은 갈색을 띤 것을 등급 A, 2~3충의 난구세포 층을 가지며 전체적으로 다소 어두운 것을 등급 B, 부분적으로 나화되었으며 전 체적으로 어두운 것을 등급 C, 난구세포층이 사방으로 퍼져 있으며 난세포질이 균일하지 않은 것을 등급 D로 구분하였으며 , 등급 A와 B에 해당하는 난포란 만을 실험에 공시하였다(Funahasi와 Day,1993).
성능/효과
이러한 결과는 납구세포층의 부착유무와 성장에 따라 분류하는 花田(1985)의 방법에 준하여 구분하 였을 때 A, B, C, D 등급의 난자 비을이 각각 57. 2%, 9.6%, 25.7% 및 7.5%를 보였다고 보고한 花田(1985)의 결과와 A, B, D등급의 난자는 대체로 유사한 결과를 보였으나, B등급의 난자는 花田의 보고보다 높게 나타났다.
Holstein의 경우, 총 229개의 미성숙 난포란 중 A 등급의 난포란은 115개(50, 2%), B등급 76 개 (33. 2%), G등급 30개 (13.1%), D등급 8개(3.5%) 였고 한우의 경우는 176개 중 A 등급 71개(40.3%), B등 급 56개(32.0%), C등급 32개(18.2%), D등급 17개 (9.7%)로 A, B등급이 홀스타인종에서 83.4 %, 한 우에서 72.3%로 홀스타인종이 유의적으로 높았다(P<0.05).
TCM-199 배양액에 FCS를 첨가한 경우 수정율 은 55.0%, 다정자 침입율은 13.6%였고, BSA와 bFF를 첨가한 경우 52.6%와 47.0%의 수정율과 각각 :10, 0%의 다정자 침 입율을 보임으로써, 체외성숙 배 양액에 FCS를 첨가했을 때가 BSA나 bFF를 첨가했을 때보다 수정율과 다정자 침입율 모두 높았 다.
TCM-199에 a~tocopher이과 cysteamine을 첨가성숙배양 후 체외수정 결과는 체외수정율이 각각62.0%와 64.7%로 대조구의 55.9%에 비하여 약간 높았고, Ham's F-10을 체외성숙 배양액으로 사용 했을 경우에도 대조구의 53, 2% 보다 처리구에서 각각 60, 2%와 66.7%로 모두 높았으나 봉계적인 유의차는 없었다. 또한 다정자 침입율은 처리구에서 대조구보다 약간 높았으나 이것 역시 통계적인 유의차는 없었다'
Table 2 에서 제시한 바와 같이 TCM-199 에 hor- rwne을 첨가 배양했을 때 Holstein종의 경우 난구세포 확장 정도가 fully expanded 56.1%, partially expanded 3L5%로 총 87.6%였고, 한우의 경우 fully expanded 54.0%, partially expanded 30, 2%로총 84.2%로 hormone을 첨가하지 않은 구보다 높았으며 Ham's F-10 배양액에서도 비슷한 결과를 보였으나 유의적인 차이는 없었다(FC0.05).
본 실험은 체외성숙 배양액 내 호르몬, 단백질원 및 항산화제 첨가가 한우 미성숙 난포란의 쳬외성 숙과 수정 및 다정자 침입에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시하였다. 난포란의 등급 비교에 있어 서는 실험에 사용할 수 있는 A, B등급의 난포란이 한우보다 홀스타인 종에서 유의적으로 더 많았고, 체외성숙시 배양액내 호르몬을 첨가했을 때 난구세 포의 확장 정도는 처리구가 대조구보다 높았으나 유의적인 차이는 보이지 않았다.
배양액내 항산화제인 a-tocopherol 50 μM과 cysteamine 100을 첨가시 유의적인 차이는 보이지 않았으나 무첨가구 보다 높은 수정율과 다정자 침입율을 보였다.
체외수정율과 다정자 침입율은 10 % FCS를 첨가했을 때가 가장 높았으나(55.0%, 13.6%), BSA 및 bFF 첨가구와 유의차는 인정되지 않았고, 배양액 종류에 상관없이 TCM-199과 Ham's F-10 에서 비슷한 경향을 보였다.
후속연구
배양액내 호르몬과 혈청 및 항산화졔 첨가가 한우 미성숙 난포란의 체외성숙과 수정에 있어서 무 첨가구와 유의적안 차이는 없었지만 쫌 다 높은 결과를 보여 이러한 물질을 첨가하는 것이 한우 체외 수정란 생산의 효율을 높이는데 도움이 될 것이라 사료된다,
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