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문제 정의
- 따라서 본 연구는 지금까지 많이 사용되고 있는 체외성숙 배지를 비교 검토하고 액상정액을 이용한 체외수정 방법을 개발하고자 실시하였다.
- 본 연구는 지금까지 돼지 난포란 성숙을 위해서 많이 사용하고 있는 mTCM-199, mWaymouth MB 752/1 그리고 NCSU-23 성숙배지를 비교하고 액상 정액을 이용한 체외수정 방법을 개발하고자 실시하였다. 미성숙 난포란은 0.
제안 방법
- 도살 직후 적출한 난소는 75“g/ml penicillin G potassium, 50"g/ml streptomycin sulfate, 그리고 0.1% BSA (Sigma A3311, USA)가 첨가된 0.9% 생리적 식염수 (30~35℃)에 담아 1~2시간 이내에 실험실로 운반하였다. 난포란은 25.
- 0 mM CaCl2 . 2H2O, 2.0 mM caffeine, 0.1% BSA (fraction V; Sigma A7888), 75.0//g/ml penicillin G sodium, 50.0 “g/ml streptomycin sulfhte가 함유된 mTBM 수정배지를 이용하여 체외수정 하였다. 상기의 체외수정 배지는 pH 7.
- mTCM니99 성숙배지와 mWaymouth 성숙 배지에서 배양시킨 성숙 난포란은 ① TCM-199 with Earle's salt에 26.19 mM NaHCO% 0.9 mM sodium pyruvate, 25 mM Hepes, 2.92 mM calcium lactate, 2.0mM caffeine, 0.4% BSA (w/v), 75.0 “g/ml penicillin G sodium 그리고 50.0 eg/ml streptomycin sulfate를 첨가한 mTCM-199 체외수정 배지에 체외수 정하였고, NCSU-23 성숙 배지에서 배양시킨 성숙 난포란은 ② 10.0 mM CaCl2 . 2H2O, 2.
- 포함된 mTLP-PVA에 노출시켜 cumulus cells 및 정자를 깨끗이 제거하고 슬라이드 글라스에 옮겨 실온의 25% acetic alcoho에서 48시간 고정한 후 1% acetic-orcein으로 염색하여 위상차 현미경 X200 그리고 X400에서 성숙배지별 성숙 난 포란의 정자침입율, 다정자침투율, 웅성전핵 형성율을 관찰하였다. 본 시험에 사용된 모든 시약은 특별한 언급이 없는 한 Sigma (USA)제품을 사용하였다.
- 1% hyaluronidase가 함유되지 않은 수정배지에 세 번 washing 하였다. 그리고 4-well polystyrene culture dish에 수정 배지를 0.5 ml씩 분주하고 mineral oil로 피복하여 2~3시간동안 38.5℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 조절된 CO2 배양기내에서 평형 시킨 수정 배지에 well당 30~40개의 성숙 난포란을 적하하고 수정 전 약 30분간 CO2 배 양기 에서 평형 시켰다.
- 우선 액상정액을 잘 흔들어 섞어 2 ml를 취하고 mTLP-PVA로 1500 rpm에서 5분간 두 번 washing 한 후 최종적으로 수정 배지 5 ml를 가하여 희석하였다. 그리고 성숙 배지 별난 포란이 침지되어 있는 수정배지에 정자농도가 2 xl03 * * 6/ml7]- 되도록 주입하고 CO2 배양기에서 6시간 동안 수정시켰다.
- 5℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 조절된 CO2 배양기내에서 평형 시킨 배지에 수정란들을 옮겼다. 그리고 체외배양 6시간 즉 체외수정 후 12시간 성숙배지별 난포란에 대한 정자침입율, 다정자 침투율, 웅성 전 핵형 성 율을 조사하였고, 수정 후 48시간 배 양하여 난할율을 조사하였다.
- 9% 생리적 식염수 (30~35℃)에 담아 1~2시간 이내에 실험실로 운반하였다. 난포란은 25.0 mM의 NaH-CO3를 2.0 mM로 바꾼 mTLP-PVA (Long 등, 1999) 세척 및 배양액을 이용하여 20-gauge의 주사침이 장착된 10 ml 주사기로 2—6 mm 직경의 포상 난포로부터 회수하였다. 회수된 난포란은 mTLP-PVA 액과 희석하여 60x 15 mm의 tissue culture dish (Falcon, USA)에 옮긴 후 실체현미경 (20~40x)하에서 난세포질이 균일하고 난구세포의 부착상태가 양호한 것만을 체외성숙에 이용하였다.
- 미성숙 난포란은 0.5 ml의 성숙배지에 각 well 당 30~40개씩 적하하였고, 38SC, 5% CO2, 95% 공기로 조절된 CO2 배양기에서 44시간 성숙시켰다. 미성숙 난포란을 mTCM-199, mWaymouth MB 752/1 그리고 NCSU-23 성숙배지에서 44시간 배양한 결과 GVBD 발생율은 각각 95.
- 5일 보관 후 운동성이 70% 이상인 정자를 체외수정에 이용하였다. 성숙 후 cumulus cell들이 제거된 성숙난포란은 0.5 ml의 mTCM-199 또는 mTBM 수정 배지에 30~40개씩 적하하고, 최종정자농도를 2 xl06/ml 되도록하여 6시간 동안 수정시켰다. 체외수정시킨 수정 란들은 0.
- 성숙배양액은 4-well polystyrene culture dish (Nunc, Denmark)에 0.5 ml씩 분주하고 mineral oil 로 피복한 후 2~3시간동안 38.5℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 조절된 CO2 배양 기내에서 평형 시킨 후 well당 30~40개의 미성숙 난포란 을 적하하여 모두 44시간 배양하여 성숙을 유도하였다. 체외성숙 배양액들은 pH 7.
- 5 ml의 mTCM-199 또는 mTBM 수정 배지에 30~40개씩 적하하고, 최종정자농도를 2 xl06/ml 되도록하여 6시간 동안 수정시켰다. 체외수정시킨 수정 란들은 0.5 ml의 NCSU-23 배양 배지에서 수정 후 6시간 배양하여 정자침입율, 다정자침입율 그리고 웅성전핵형성율을 조사하였고, 수정 후 48시간 배 양하여 난할율을 조사하였다. NCSU-23 성숙배지와 mTBM 수정배지를 이용하였을 때 웅성전핵형성율이 48.
대상 데이터
- 1% hyaluronidase?} 포함된 mTLP-PVA에 노출시켜 cumulus cells 및 정자를 깨끗이 제거하고 슬라이드 글라스에 옮겨 실온의 25% acetic alcoho에서 48시간 고정한 후 1% acetic-orcein으로 염색하여 위상차 현미경 X200 그리고 X400에서 성숙배지별 성숙 난 포란의 정자침입율, 다정자침투율, 웅성전핵 형성율을 관찰하였다. 본 시험에 사용된 모든 시약은 특별한 언급이 없는 한 Sigma (USA)제품을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 난소는 충남 공주시 의당면 수촌리 614번지의 (주) 국일기업 도축장에서 도축되는 암돼지 (체중 WO kg 내외)로부터 채취하였다. 도살 직후 적출한 난소는 75“g/ml penicillin G potassium, 50"g/ml streptomycin sulfate, 그리고 0.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 자료는 SAS package (1996) 를 이용하여 분산분석을 하였으며, 처리간의 유의성은 Duncan's multiple range test를 이용하여 검정하였다.
성능/효과
- 0%로써 mTCM-199 성숙 배지와 수정배지 또는 mWaymouth MB 752/1 성숙 배지와 mTCM-199 수정배지를 이용하였을 때보다 웅성전핵형성율이 높았다. 2~4세포기까지의 난 할 율은 mTCM-199 성숙, 수정 및 배양배지에서 24.1%, mWaymouth 752/1 성숙배지, mTCM-199 수정 및 배양배지에서 43.6%, 그리고 NCSU-23 성숙 배지, mTBM 수정배지 및 NCSU-23 배양 배지를 이용한 것이 71.2%였다.
- 같다. 2~4세포기까지의 난할율은 NCSU-23 성숙배지, mTBM 수정배지 및 NCSU-23 배양 배지를 이용한 것이 71.2%로 mTCM-199 성숙, 수정 및 배양 배지를 이용한 24.1%나 mWaymouth MB 752 /I 성숙배지, mTCM-199 수정 및 배양배지를 이용한 43.6%보다 우수한 것으로 나타났다.
- 나타난 바와 같다. NCSU-23 성숙배지 와 mTBM 수정배지를 이용하였을 때 웅성전핵형성율이 48.0 %로써 mTCM-199 성숙배지와 수정배지 또는 m-Waymouth MB 752/1 성숙배지와 mTCM-199 수정 배지를 이용하였을 때보다 웅성전핵형성율이 높았다. 그러나 정자침입율과 다정자침입율은 NCSU -23 성숙배지와 mTBM 수정배지에서 각각 79.
- 나타난 바와 같다. NCSU-23 성숙배지 와 mTBM 수정배지를 이용하였을 때 웅성전핵형성율이 48.0 %로써 mTCM-199 성숙배지와 수정배지 또는 m-Waymouth MB 752/1 성숙배지와 mTCM-199 수정 배지를 이용하였을 때보다 웅성전핵형성율이 높았다. 그러나 정자침입율과 다정자침입율은 NCSU -23 성숙배지와 mTBM 수정배지에서 각각 79.
- 0 %로써 mTCM-199 성숙배지와 수정배지 또는 m-Waymouth MB 752/1 성숙배지와 mTCM-199 수정 배지를 이용하였을 때보다 웅성전핵형성율이 높았다. 그러나 정자침입율과 다정자침입율은 NCSU -23 성숙배지와 mTBM 수정배지에서 각각 79.5% 와 19.1%로 다른 성숙 및 수정배지에 비하여 통계적 유의성은 없었으나 롷은 결과를 나타내었다.
- 5 ml의 성숙배지에 각 well 당 30~40개씩 적하하였고, 38SC, 5% CO2, 95% 공기로 조절된 CO2 배양기에서 44시간 성숙시켰다. 미성숙 난포란을 mTCM-199, mWaymouth MB 752/1 그리고 NCSU-23 성숙배지에서 44시간 배양한 결과 GVBD 발생율은 각각 95.6, 94.1 그리고 94.9%였으며, Mil단계까지의 성숙율은 각각 92.5, 90.1 그리고 91.1%였다. 성숙배지별, GVBD 발생율과 MII까지의 성숙율간에 유의성은 인정되지 않았다.
- 서로 다른 성숙배지별 미성숙 돼지 난포란의 성숙효과는 Table 1에 나타난바와 같이 mTCM-199, mWaymouth MB 752/1 그리고 NCSU-23의 성숙 배지 간에 GVBD 발생율과 MU까지의 성숙율에 있어서 차이가 없었다. mTCM-199 배지로 87~92%, mWaymouth MB 752/1 배지로 89—94% (Yoshida 등, 1990, 1992a, 1993; Wang 등, 1997) 그리고 NCSU-23 배지로 93% (Wang 등, 1997)의 MU까지의 성숙율을 나타내었다는 보고와 본 실험의 결과와는 비슷한 경향을 나타내었다.
- 1%였다. 성숙배지별, GVBD 발생율과 MII까지의 성숙율간에 유의성은 인정되지 않았다. 액상정액의 제조용 정액은 90% 이상의 운동성을 가진 농후정자부분을 사용하였으며 정액채취 후 2시간 동안에 22~24℃의 실온까지 냉각시켰다.
- 이상의 결과를 종합하면 BTS 희석액으로 17℃ 에서 5일 보존한 액상정액으로 체외수정이 가능함을 입증하였고, NCSU-23 성숙배지, mTBM 수정 배지 및 NCSU-223 배지가 미성숙 난포란의 성숙, 수정 및 배양에 우수한 배지임을 입증하였다.
후속연구
- 앞으로는 액상정액을 이용한 돼지의 인공수정이 확대될 것임으로 액상정액의 정자를 이용한 체외수정의 방법도 개발할 필요성을 갖게 되었다.
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