곤충변원성충(Steinernema carpocapsae Weiser)의 감염태 유충에 대한 액체질소( $-190^{\circ}C$)냉동 저장하는 방법을 개발하기 위하여, 냉동보관 전처리 과정 및 저장기간에 따른 선충생존율과 감염력 변이를 조사하였다. 냉동저장 전에 22% 글리세롤로 선충은 6, 12, 24시간 동안 배양한 후 70% methanol($0^{\circ}C$)안에 10분간 유지하였다. 글리세롤과 methanol에 넣어 둔 샘플을 0,85% 식염수에 넣어 24시간 유지한 후 생존능력을 측정하였다. 글리세롤 배양시간에 따른 선충 생존율의 차이는 없었으나, methanol처리에서는 글리세롤 처리 시간이 길수록 선충 생존율이 높게 나타났다. 냉동저장에 따른 선충의 생존율은 글리세롤 배양시간이 짧았던 처리(6시간)를 제외하고는 5개월 동안 평균 70% 이상으로 높게 나타났다. 냉동저장 되었던 선충의 곤충감염율은 저장기간에 관계없이 90% 이상을 나타내었다. 이상의 결과는 곤충병원선충이 냉동저장에 의해 장기간보존이 가능하다는 것을 제시한다.
곤충변원성충(Steinernema carpocapsae Weiser)의 감염태 유충에 대한 액체질소( $-190^{\circ}C$)냉동 저장하는 방법을 개발하기 위하여, 냉동보관 전처리 과정 및 저장기간에 따른 선충생존율과 감염력 변이를 조사하였다. 냉동저장 전에 22% 글리세롤로 선충은 6, 12, 24시간 동안 배양한 후 70% methanol($0^{\circ}C$)안에 10분간 유지하였다. 글리세롤과 methanol에 넣어 둔 샘플을 0,85% 식염수에 넣어 24시간 유지한 후 생존능력을 측정하였다. 글리세롤 배양시간에 따른 선충 생존율의 차이는 없었으나, methanol처리에서는 글리세롤 처리 시간이 길수록 선충 생존율이 높게 나타났다. 냉동저장에 따른 선충의 생존율은 글리세롤 배양시간이 짧았던 처리(6시간)를 제외하고는 5개월 동안 평균 70% 이상으로 높게 나타났다. 냉동저장 되었던 선충의 곤충감염율은 저장기간에 관계없이 90% 이상을 나타내었다. 이상의 결과는 곤충병원선충이 냉동저장에 의해 장기간보존이 가능하다는 것을 제시한다.
Cryopreservation of infective juveniles of entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae Weiser, was conducted at $-190^{\circ}C$ liquid nitrogen and its, efficacy was analysed on nematode survival and pathogenicity with glycerol pretreatments and storage periods. Infective juveniles...
Cryopreservation of infective juveniles of entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae Weiser, was conducted at $-190^{\circ}C$ liquid nitrogen and its, efficacy was analysed on nematode survival and pathogenicity with glycerol pretreatments and storage periods. Infective juveniles were pre-treated before being frozen by incubating the nematodes in 22% glycerol for each of 6, 12, and 24 h, followed by 70% methanol at $0^{\circ}C$ for 10 minutes. Just after glycerol and methanol incubations, subsamp1es of the nematodes were resuspended in 0.85% saline and maintained during 24h for viability determination. Different glycerol incubation periods significantly affected the nematode susceptibility to methanol infiltration. Six hour incubation in glycerol resulted in much less nematode survival than did 12 h or 24 h incubation. About 70% of the infective juveniles frozen at $-190^{\circ}C$ for 5 months, preincubat-ed in glycerol at least for 12h, were able to survive after being resuspended in 30°C saline. They did not also show any change in their pathogenicity during cryopreservation. These results suggest an improved technique for long-term storage of the entomopathogenic nematodes.
Cryopreservation of infective juveniles of entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae Weiser, was conducted at $-190^{\circ}C$ liquid nitrogen and its, efficacy was analysed on nematode survival and pathogenicity with glycerol pretreatments and storage periods. Infective juveniles were pre-treated before being frozen by incubating the nematodes in 22% glycerol for each of 6, 12, and 24 h, followed by 70% methanol at $0^{\circ}C$ for 10 minutes. Just after glycerol and methanol incubations, subsamp1es of the nematodes were resuspended in 0.85% saline and maintained during 24h for viability determination. Different glycerol incubation periods significantly affected the nematode susceptibility to methanol infiltration. Six hour incubation in glycerol resulted in much less nematode survival than did 12 h or 24 h incubation. About 70% of the infective juveniles frozen at $-190^{\circ}C$ for 5 months, preincubat-ed in glycerol at least for 12h, were able to survive after being resuspended in 30°C saline. They did not also show any change in their pathogenicity during cryopreservation. These results suggest an improved technique for long-term storage of the entomopathogenic nematodes.
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문제 정의
이를 위해 냉동시키기 전에 글리세롤이 생체내로 충분히 집적되어야 한다. 그러나 높은 농도의 글리세롤 자체가 무해하지 않기 때문에 (Park et al., 1998) 본 연구에서는 바로 이 글리세롤 전처리 과정의 전처리 과정의 시간을 줄이려는데 연구의 초점을 두었다. Popiel and Vasquez(1991)의 연구결과에서도 글리세롤의 처리 시간이 길어짐에 따라 선충의 초기 치사율이 높아졌다.
본 연구는 곤충병원선충의 장기보관법 개발에 궁극적 목적을 두고 감염태 선충의 냉동보관방법의 적용 가능성을 분석하였다. 이에 대한 실질적 방법을 Popiel and vasquez(1991)가 제시하였고, 이를 경남 동래에서 채집된 St.
본 연구에서는 동래에서 채집된 곤충병원선충(St. carpospwze)에 대해 냉동보관을 위한 최적 글리세롤 처리시간을 결정하였으며, 이 선충에 대한 효과적인 장기보관법을 제시하였다.
이러한 이유로 본 실험에서는 Steinernema carpo-capsae를 장기간 보관하기 위하여 액체질소에 냉동보관하면서 저장기간 중 선충의 생존율과 감염력 변이를 조사하였다.
제안 방법
Methanol 안에 든 선충현탁액을 1.5 ml 튜브에 1ml씩 넣고 -190℃ 액체질소통에 각각 1, 10, 20, 30, 60, 150일간 냉동보관하였다. 샘플을 녹일 때는 0.
이 선충은 70% methanol(0℃)에 넣어 얼음 위에서 10분간 유지하고, 이것을 다시 원심분리 하여 methanol을 제거하였다. 글리세롤과 methan이에 배양한 선충을 각각 0.85% 식염수(0.85%, NaCl)에 넣어 15℃에서 24시간 유지한 후 생존능력을 측정하였다.
글리세롤안에서 Steinernema carpocapsae 감염태 유충의 최적 배양시간을 결정하기 위하여 , 22% (w/v) 글리세롤에 선충을 2×l05/mi로 접종하였다. 이것을 250ml 플라스크에 선충이 담긴 글리세롤 용액 10 ml를 넣고 ro-tary shake에 100rpm으로 25℃에서 각각 6, 12, 24시간 동안 유지시켰다.
냉동저장되었던 병원선충의 기주 곤충감염율을 알아보기 위해 petri dish (지름×높이:90×15mm)에 여과지 (#2 Advantec, Toyo, Japan)를 깔고, 동결 저장하여 녹인 선충 현탁액 (400IJ/0.5ml)을 여과지에 접종한 다음 인공사료와 함께 파밤나방 5령충을 3마리씩 3반복하여 처리하였다. 이후 처리된 petri dish들은 항온기 (온도 25± 1℃, 광주기 16:8h(L:D))에 두고 48시간 후에 선충에 의한 기주 사망률을 조사하였다.
85% 식염수 (30℃)에 넣어 완전히 녹을 때까지 흔들어 주고, 선충을 가라앉혀 식염수에 10회 이상 희석하였다. 생존능력은 녹인 후 15℃에서 24시간 유지한 후 조사하였다. 선충의 생존은 50배 배율의 해부 현미경하에서 미침으로 충격후 자생적으로 움직이는 선충을 판별 기준으로 정했다.
생존능력은 녹인 후 15℃에서 24시간 유지한 후 조사하였다. 선충의 생존은 50배 배율의 해부 현미경하에서 미침으로 충격후 자생적으로 움직이는 선충을 판별 기준으로 정했다.
액체 질소 안에 냉동 보관한 곤충병원선충을 녹여 파밤나방 5령충을 이용하여 기주 감염율을 조사하였다(Table 2). 본 연구에서 조사 한계시기인 150일까지 냉동 보관한 곤충병원선충은 저장기간에 관계없이 (F=0.
5ml)을 여과지에 접종한 다음 인공사료와 함께 파밤나방 5령충을 3마리씩 3반복하여 처리하였다. 이후 처리된 petri dish들은 항온기 (온도 25± 1℃, 광주기 16:8h(L:D))에 두고 48시간 후에 선충에 의한 기주 사망률을 조사하였다.
대상 데이터
, 1998). 기주 곤충증식은 인공사료(Gho et al., 1990)를 이용하여 항온기 (온도 25±1 ℃, 광주기 16:8 h(L:D))에서 누대 사육하였다. 이 곤충의 성충 먹이로 10% 설탕물이 산란상자에 공급되었다.
이론/모형
곤충병원선충의 감염태 유충을 기주 곤충인 파밤나방 (HUbner))에 국부 처리하여 6일간 항온기 (25± 1℃)내에서 Baermann 깔대기법 (Han et al., 1999)으로 증식시켜 수거하여 사용하였다. 증식된 선충은 사용될 때까지 15℃에서 보관하였다 (Park et al.
분석하였다. 이에 대한 실질적 방법을 Popiel and vasquez(1991)가 제시하였고, 이를 경남 동래에서 채집된 St. carpocapsae에 적용하였다.
성능/효과
글리세롤 배양시간에 따른 선충의 생존율을 조사한 결과, 22% 글리세롤 안에 6, 12, 24시간 배양된 선충을 1,000rpm으로 원심분리하여 글리세롤 상층액을 제거한 후 선충 생존율을 조사하였을 때 배양시간에 관계없이 높은 생존율을 유지하였다 (Table 1). 그러나 methanol을 처리한 후 생존율을 조사하였을 때는 글리세롤 안에서 12, 24시간 배양한 선충시료가 6시간 배양시료에 비해 선충 생존율이 현저히 높아 글리세롤에서 배 양시 간이 길수록 methanol 처 리에 대한 높은 생존율을 나타내었다(Table 1).
요구됐다. 글리세롤 배양시간에 따른 선충의 생존율을 조사한 결과, 22% 글리세롤 안에 6, 12, 24시간 배양된 선충을 1,000rpm으로 원심분리하여 글리세롤 상층액을 제거한 후 선충 생존율을 조사하였을 때 배양시간에 관계없이 높은 생존율을 유지하였다 (Table 1). 그러나 methanol을 처리한 후 생존율을 조사하였을 때는 글리세롤 안에서 12, 24시간 배양한 선충시료가 6시간 배양시료에 비해 선충 생존율이 현저히 높아 글리세롤에서 배 양시 간이 길수록 methanol 처 리에 대한 높은 생존율을 나타내었다(Table 1).
냉동보관하기 전에 methanol 대해 감수성이 높았던 6시간 글리세롤 처리 시료는 보관초기부터 매우 낮은 생존율을 보였다. 반면에 12시간과 24시간의 글리세롤처리 시료는 두 처리 사이에 차이가 없이 (F = 402;df = 1,51; P=0.0504) 냉동 보관초기부터 150일까지 약70%의 높은 생존율을 유지했다.
본 연구 결과에서는 선충의 최적 냉동보관을 위해서는 글리세롤 처리과정이 최소한 12시간 이상이 요구되었다. Popiel and Vasquez (1991)는 이 글리세롤 처리 단계가 선충의 냉동보관에 가장 중요한 단계라고 지적했으며, 그들이 분석했던 시간대의 최소 단위인 24시간을 기준으로 이 이상의 글리세롤 처리를 제시했다.
(Table 2). 본 연구에서 조사 한계시기인 150일까지 냉동 보관한 곤충병원선충은 저장기간에 관계없이 (F=0.06;df=1,11; P 0.8166) 90% 이상의 높은 치사감염율을 보였다.
Popiel and Vasquez (1991)는 이 글리세롤 처리 단계가 선충의 냉동보관에 가장 중요한 단계라고 지적했으며, 그들이 분석했던 시간대의 최소 단위인 24시간을 기준으로 이 이상의 글리세롤 처리를 제시했다. 우리의 결과는 이러한 글리세롤 처리 시간을 12시간으로 단축해도 선충의 냉동 보관에 큰 차이가 없음을 나타냈다.
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