선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이 ftision protein의 분비를 조사하였다. 또한 본 연구 결과를 바탕으로, 유용한 외래 단백질을 효과적으로 생산, 분비할 수있는 secretion vector의 원형을 개발하였다.
- 본 연구에서는 Salmonella의 type Ⅲ 분비단백질 중 SopE를 선정하고, 앞서 언급한 Yersinia 연구결과를 토대로 sopE의 프로모터와 SopE 의 N-말단 일부를 이용하여 SopE-OmpR translational fusion을 만들었으며, Salmonella type Ⅲ 분비장치에의한 이 ftision protein의 분비를 조사하였다. 또한 본 연구 결과를 바탕으로, 유용한 외래 단백질을 효과적으로 생산, 분비할 수있는 secretion vector의 원형을 개발하였다.
제안 방법
- 1% NaCl LB에서 배양한 세포배양액을 3, 300Xg에서 20분간 원심분리 후 상등액을 취하여 low-protein binding filter인 Gelman사의 HT Tuffryn membrane Syringe Filter로 filtering하였다. 여기에 같은 부피의 ice-cold aceton을 천천히 교반시키면서 가한 후 15분간 더 ice상에서 교빈시켜 침전시켰다.
- PCR산물은 QIAEX kit로 추출하였으며. BamHI 과 EcoRI을 처리한 뒤 같은 처리를 거친 reporter plasmid와 ligation 하였다.
- NCBI를 통해 S. enterica serovar Typhimurium의 sopE 유전자 염기서열을 얻고, D. Zuker 박사가 인터넷으로 제공하는 MFOLD를 이용하여 sopE mRNA의 2차 구조를 분석하였다.
- E U (5 'cggaattctaattaccctgacgattt3'), EI0 (5'cgggatccgctaataaatatatacaaaacactc3'), E15(5'cgggatcc atactagaaaa- cattgctaataaa3'). PCR산물은 QIAEX kit로 추출하였으며. BamHI 과 EcoRI을 처리한 뒤 같은 처리를 거친 reporter plasmid와 ligation 하였다.
- Reporter 단백질로 사용하기 위한 ompR의 DNA절편을 얻기 위해 primer를 제조하여 PCR을 수행하였다. 이를 Xbal, PstL으로처리한 뒤 같은 처리를 거친 pGEM3Z vector와 ligation하여 reporter plasmid를 제조하였다.
- type Ⅲ 분비와 관련된 mRNA 신호는 시작 코돈에서부터 약 15개 코돈까지로 알려져있다. Type Ⅲ 분비장치들은 각 세균사이에서 보존되어 있으므로, 일단 sopE의 프로모터 부위와 시작 코돈으로부터 15개 정도의 코돈들을 선정하여 reporter 단백질(OmpR)과 융합시킨 후, 융합단백 질의 분비 여부를 조사하였다. 이를 위해 우선 Salmonella 균주인 SL1344의 genomic DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 scpE의 프로모터와 시작 코돈으로부터 10, 15개 코돈들을 포함하는 DNA 절편들을 제조하였다(Fig.
- plasmid를 제조하였다. cloning해 넣은 ompR의 상위부분에 sopE의 분비신호에 해당하는 DNA 절편을 fiarne에 맞춰 삽입함으로써 translational fiision을 제조하였다(Fig. 3). 이렇게 제조한 재조합 플라스미드를 대장균 균주인S DH5a 에 형질전환하고 여기서 얻은 플라스미드를 다시 SF586을 거쳐 최종 숙주인야생형 Salmonella 균주인 SL1344로 형질전환 하였다.
- sopE와 ompR의 translational fusion을 만들기 위해 ompR DNA 절편을 PCR로 합성한 다음 pGEM-3Z에 cloning하여 reporter plasmid를 제조하였다. cloning해 넣은 ompR의 상위부분에 sopE의 분비신호에 해당하는 DNA 절편을 fiarne에 맞춰 삽입함으로써 translational fiision을 제조하였다(Fig.
- 따라서 우리는 Yersinia의 type Ⅲ 분비단백질의 mRNA 2차 구조와 S. enterica serovar Typhimurium의 그것을 서로 비교해보았다(Fig. 1). 그 결과, 이들간에는 특징적인 유사점이 발견되었는데.
- 3). 이렇게 제조한 재조합 플라스미드를 대장균 균주인S DH5a 에 형질전환하고 여기서 얻은 플라스미드를 다시 SF586을 거쳐 최종 숙주인야생형 Salmonella 균주인 SL1344로 형질전환 하였다.
- primer를 제조하여 PCR을 수행하였다. 이를 Xbal, PstL으로처리한 뒤 같은 처리를 거친 pGEM3Z vector와 ligation하여 reporter plasmid를 제조하였다.
- Type Ⅲ 분비장치들은 각 세균사이에서 보존되어 있으므로, 일단 sopE의 프로모터 부위와 시작 코돈으로부터 15개 정도의 코돈들을 선정하여 reporter 단백질(OmpR)과 융합시킨 후, 융합단백 질의 분비 여부를 조사하였다. 이를 위해 우선 Salmonella 균주인 SL1344의 genomic DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 scpE의 프로모터와 시작 코돈으로부터 10, 15개 코돈들을 포함하는 DNA 절편들을 제조하였다(Fig. 2A). 그리고 ompR DNA절편은 역시 coding 부위만을 가지도록 primer를 제조하여 SL1344 의 genomic DNA를 주형으로 PCR을 통해 얻었다(Fig.
대상 데이터
- SopE의 N-말단부위에 해당하는 DNA 절편을 PCR을 통해 얻기 위해 주형으로 사용할 genomic DNA를 S. enterica serovar Typhimurium SL1344로부터 얻었으며, 형질전환용 숙주세포로는 DH5a을 사용하였다. 중간 숙주로는 Salmonella 균주인 SF586 을 사용하였으며, reporter 플라스미드를 넣어 OmpR의 분비를 확인하기 위해 ompR 돌연변이주로 Salmonella 균주인 CDJ359 를 사용하였다.
- enterica serovar Typhimurium SL1344로부터 얻었으며, 형질전환용 숙주세포로는 DH5a을 사용하였다. 중간 숙주로는 Salmonella 균주인 SF586 을 사용하였으며, reporter 플라스미드를 넣어 OmpR의 분비를 확인하기 위해 ompR 돌연변이주로 Salmonella 균주인 CDJ359 를 사용하였다.
이론/모형
- Protein methods(3)의 방법에 따랐다.
- 이를 원심분리하고 5분간 얼음에 둔 후 여기에 1ml/의 50 mM CaCl:를 넣고 1시간 30분가량 얼음에 방치하고 그리고 4TC에서 1분 30초 동안 정확하게 열 충격을 준 뒤 미리 준비한 LB를 1 m/정도 넣고 60분 정도배양하여 선택배지 위에 도말하였다. S. enterica serovar Typhimurium균주는 electroporation 방법으로 형질 전환하였다. 37<, C에서 하룻밤동안 전 배양 한 뒤 OD=0.
- Secretion vector의 원형을 만들기 위해 pGEM-3Z vector를 사용하였으며 TA 클로닝을 위해 pGEM T-easy system)Promega, Madison, USA)을 사용하였다.
- 대장균 균주는 CaCU 방법으로 형 질전환 하였다. 세포를 37℃ 에서 하룻밤 전 배양 한 뒤, 역시 3KC에서 OD600=0.
- 나올 것이다. 우리는 이와 같은 방법으로 secretion vector 의 원형을 제조하였다(Fig. 5). pGEM-3Z vector의 multi-cloning site에 sopE의 분비신호부위를 클로닝하여 만든 이 플라스미드는 효율적인 목적단백질의 발현을 위해 앞으로도 몇 가지의 개선이 이루어져야 할 것이다.
성능/효과
- 여기서는 분비단백질들이 공극을 형성하여 자신들의 분비를 유도하게 된다(5, 11, 12). 마지막으로, type Ⅲ 분비장치는 sec-independent이며, 목적단백질 N-말단의 15-20개 아미노산이 분비신호로 작용할 것이라 제시되어져왔다. 그러나, 연구자들은 분비신호로 작용할 구조적 특징을 관찰하지 못하였고, N-말단의 아미노산을 변형시키는 돌연변이에 의해서도 목적단백질의 분비가 영향 받지 않는다는 것을 관찰하였다.
- 분비된 OmpR 단백질을 확인하기 위해, 세균을 배양한 상등액으로부터 단백질을 얻은 다음, SDS-PAGE후 immunoblot을 통해 융합된 OmpR reporter 단백질이 상등액으로 분비됨을 확인하였다(Fig. 4).
- 위의 연구결과를 토대로 볼 때, sopE의 분비신호 뒤에 목적단백질의 DNA 염기를 클로닝하면 그 단백질이 세포배양액으로 분비되어 나올 것이다. 우리는 이와 같은 방법으로 secretion vector 의 원형을 제조하였다(Fig.
- 이상의 두 가지 DNA절편들을 TA vector에 클로닝한 뒤 sequencing을 통해 point mutation이 일어나지 않았음을 확인하였다(data not shown).
- type I-IV까지의 네 가지가 알려져 있다(7). 첫째, type I 분비 장치는 sec-independent로, 전형적인 신호펩타이드가 목적 단백질의 N-말단부위에 있지 않고, C-말단부위에 있다. 이 장치는 3-4 개의 단백질이 trans-membrane channel을 형성하여 목적 단백질을 통과시키는 것이다(13).
후속연구
- pGEM-3Z vector의 multi-cloning site에 sopE의 분비신호부위를 클로닝하여 만든 이 플라스미드는 효율적인 목적단백질의 발현을 위해 앞으로도 몇 가지의 개선이 이루어져야 할 것이다. Yersinia의 type Ⅲ 분비장치에서도 보고된 바(2)와 같이 우선 전사수준에서의 조절로서 과발현시키기에 적당한 다른 프로모터를 의 프로모터 대신으로 이용하여 그발현정도를 높여야 할 것이다. 또, secretion vector에 과발현시킨 MIA DNA절편을 클로닝하여 type Ⅲ 분비장치의 과발현을 유도할 필요가 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.