백련초 (Opuntia ficus-indica var., saboten)의 Salmonella와 Escherichia coli O157 : H7에 대한 항균효과 Antimicrobial Activity of Natural Product Made by Opuntia ficus-indica var. saboten Against Salmonella spp. and Escherichia coli O157:H7원문보기
항생제 및 항균 물질 등의 오, 남용으로 인하여 항생제 내성균들이 등장, 사회적으로 큰 문제가 되고 있으며, 최근에는 식물이나 probiotics 등과 같이 항생제를 대체할 수 있는 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이에 본 연구에서는 국내에서 오래 전부터 민간 요법으로 사용되어 오던 백련초 (Opuntia ficus-indica var. saboten)를 이용하여 in vitro와 in vivo에서 Salmonella enteyica serova. Enteritidis (S. enteritidis), S. enterica serova. Typhimurium (S. Typhimurium) DT104 및 Escherichia coli O157:H7에 대한 항균능을 평가하였다 백련초의 수용액이 포함된 Moulter Hinton agar에 Salmonella spp. 및 S. coli O157:H7를 접종한 결과 이들 균에 대한 억제능(inhibitory activity)을 확인할 수 있었다. 백련초 제제를 경구투여한 군에서 분변으로 배출되는 S.typhimurium DT104의 수가 급격히 감소하였고, 낀 후에는 더 이상 분변으로 균이 배출되지 않았으며, intestinal IgA가 유의적으로 증가함이 확인되었다. 본 연구를 통하여 백련초가 in vitro에서 S. enteritis, S. Typhimurium DT104와 E. coli O157:H7대한 항균력을 나타낼 뿐만 아니라 마우스의 gastrointestinal tract에서 역시 Salmonella에 대한 항균력을 보임을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 백련초 및 그 성분을 이용한 병원성 세균의 제거 및 면역 증진 효과 등과 같은 연구의 필요성이 확인되었고, 그 응용 가능성도 매우 높을 것으로 사료된다.
항생제 및 항균 물질 등의 오, 남용으로 인하여 항생제 내성균들이 등장, 사회적으로 큰 문제가 되고 있으며, 최근에는 식물이나 probiotics 등과 같이 항생제를 대체할 수 있는 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이에 본 연구에서는 국내에서 오래 전부터 민간 요법으로 사용되어 오던 백련초 (Opuntia ficus-indica var. saboten)를 이용하여 in vitro와 in vivo에서 Salmonella enteyica serova. Enteritidis (S. enteritidis), S. enterica serova. Typhimurium (S. Typhimurium) DT104 및 Escherichia coli O157:H7에 대한 항균능을 평가하였다 백련초의 수용액이 포함된 Moulter Hinton agar에 Salmonella spp. 및 S. coli O157:H7를 접종한 결과 이들 균에 대한 억제능(inhibitory activity)을 확인할 수 있었다. 백련초 제제를 경구투여한 군에서 분변으로 배출되는 S.typhimurium DT104의 수가 급격히 감소하였고, 낀 후에는 더 이상 분변으로 균이 배출되지 않았으며, intestinal IgA가 유의적으로 증가함이 확인되었다. 본 연구를 통하여 백련초가 in vitro에서 S. enteritis, S. Typhimurium DT104와 E. coli O157:H7대한 항균력을 나타낼 뿐만 아니라 마우스의 gastrointestinal tract에서 역시 Salmonella에 대한 항균력을 보임을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 백련초 및 그 성분을 이용한 병원성 세균의 제거 및 면역 증진 효과 등과 같은 연구의 필요성이 확인되었고, 그 응용 가능성도 매우 높을 것으로 사료된다.
With the incidence of antibiotic resistant bacteria there is increasing interest in natural products such as herb extract and probiotics to control antibiotic resistant bacteria. This study was focused on the determination of antimicrobial activity of Opuntia ficus-indica var. saboten against Salmon...
With the incidence of antibiotic resistant bacteria there is increasing interest in natural products such as herb extract and probiotics to control antibiotic resistant bacteria. This study was focused on the determination of antimicrobial activity of Opuntia ficus-indica var. saboten against Salmonella enetrica serovar Enteritidis (S. enterifidis), S. enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) DT 104 and Escherichia coli 0157:H7. Though bactericidal effect of 0. ficus-indica var. saboten was not observed, it had significant inhibitory activity against Salmonella spp. and E. coli O157:H7 on the Moulter Hinton agar containing its solution dissolved in deionized water. To investigate the antimicrobial activity in vivo, mice were challenged with 5. Typhimurium DT104 (3.7$\times$108 cfu/mouse) after pre-feeding 0. ficus-indica var. saboten solution. The fecal shedding of S. Typhimurium DT104 was more dramatically decreased and not detectable in feces and intestines 3 days after challenge in mice fed with 0. ficus-indica var. saboten. Antibody responses of the intestinal IgA were also significantly increased in mice fed with 0. ficus-indica var. saboten. These findings suggest that Opuntia ficus-indica var. saboten decreased the shedding of S. Typhimurium DT104 in vitro and also in the gastrointestinal tract in mice. In addition, administration of the product might enhance the mucosal immune response against S. Typhimurium DT 104. In conclusion, Opuntia ficus-indica var. saboten might be useful to control antibiotic resistant bacteria in vivo and in vitro.
With the incidence of antibiotic resistant bacteria there is increasing interest in natural products such as herb extract and probiotics to control antibiotic resistant bacteria. This study was focused on the determination of antimicrobial activity of Opuntia ficus-indica var. saboten against Salmonella enetrica serovar Enteritidis (S. enterifidis), S. enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) DT 104 and Escherichia coli 0157:H7. Though bactericidal effect of 0. ficus-indica var. saboten was not observed, it had significant inhibitory activity against Salmonella spp. and E. coli O157:H7 on the Moulter Hinton agar containing its solution dissolved in deionized water. To investigate the antimicrobial activity in vivo, mice were challenged with 5. Typhimurium DT104 (3.7$\times$108 cfu/mouse) after pre-feeding 0. ficus-indica var. saboten solution. The fecal shedding of S. Typhimurium DT104 was more dramatically decreased and not detectable in feces and intestines 3 days after challenge in mice fed with 0. ficus-indica var. saboten. Antibody responses of the intestinal IgA were also significantly increased in mice fed with 0. ficus-indica var. saboten. These findings suggest that Opuntia ficus-indica var. saboten decreased the shedding of S. Typhimurium DT104 in vitro and also in the gastrointestinal tract in mice. In addition, administration of the product might enhance the mucosal immune response against S. Typhimurium DT 104. In conclusion, Opuntia ficus-indica var. saboten might be useful to control antibiotic resistant bacteria in vivo and in vitro.
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문제 정의
이러한 배경에서 본 연구에서는 국내에서 오래 전부터 민 간 요법으로 사용되어 오던 백련초를 이용하여 그 항균능 등을 평가하고자 하였다.
제안 방법
3주령의 Specific Pathogen Free (SPF) ICR 마우스 암,수 각각 22마리를 본 실험에 사용하였으며, SPF 마우스임을 확인하기 위하여 분변에 대한 미생물학적 검사를 실시하여 특정 병원체가 없는 것을 확인한 후 실험을 실시하였다. 마 우스는 암, 수 각각 Negative Control군은 4마리, 3개의 실 험군은 각각 6마리씩 (Negative Contro군 총 8마리, 3개의 실험군 각각 총 12마리) 임의로 선택하여 케이지에 분리하였으며, 1 주일 간의 적응기간을 둔 후 실험을 실시하였다.
IgA와 IgG 즉정을 위한 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)용 항원으로 사용하기 위하여 S. typhimurium DT104를 TSB (Difco BRL)에 37℃에서 24시간 배양한 후, 2, 500 rpm에서 30분간 원심분리하고, PBST 세척한 후 3% formalin으로 1시간 동안 처리하였다. 이후 2, 500 rpm 에서 30분간 원심분리하여 균체를 회수하고, PBS에 세척하여 formalin 성분을 제거하고 PBS에 재부유하여 균수를 2x106 cfb/ml 이 되도록 하였다.
IgG 측정을 위해서는 혈청 100 µl 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBST로 5회 세척한 후 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (Zymed)를 1:4000으로 PBS에 희석하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이후 O-phenylene diamine (OPD; Sigma)로 발색시켜 ELISA reader (IDEXX)를 이용하여 490nm에서 optical density (OD)를 측정하였다20,23,36).
실험은 Negative Control 군, ST군, RNL+ST 군, RNL+ST+RNL군으로 총 4군으로 나누어 실시하였다. Negative Control군은 실험기간 동안 PBS만을 투여하였고, ST군은 7일 동안 PBS를 투여한 후 S. tyhpimurium DT104으로 공격 접종하였다. RNL+ST군과 RNL+ST+RNL 군은 O.
마 우스는 암, 수 각각 Negative Control군은 4마리, 3개의 실 험군은 각각 6마리씩 (Negative Contro군 총 8마리, 3개의 실험군 각각 총 12마리) 임의로 선택하여 케이지에 분리하였으며, 1 주일 간의 적응기간을 둔 후 실험을 실시하였다. SPF 상태를 유지하기 위해 음수, 사료, 깔짚 등은 모두 고압 멸균 후 사용하였으며, 온도 22℃, 습도 50%, 12시간 간격 으로 조명이 조절되고, 환기도 자동으로 조절되는 실험동물사육징치 (MJ-721CS, Myung-Jin, Korea)에서 사육하였다.
ficus-indica var. saboten 용액을 투여하였다.
ficus-indica var. saboten 용액의 최종 농도가 1, 2, 3, 4 및 5%가 되도록 혼합하여 최종 10 ml씩 시험관에 분주하였다. 그리고 O.
경구로 섭취된 항원 (antigen)에 대한 일차적인 방어를 담 당하는 장에서 분비되는 IgA를 측정하기 위하여 각 군별로 마우스의 분변을 모으고 그 양을 0.5 g으로 일정하게 조정하여 PBS에 잘 섞은 후 2, 500 rpm으로 15분간 원심분리하여 그 상층액으로부터 S. typhimurium DT104에 대한 IgA를 측정하였다. 또한 systemic immune response를 측정하기 위하여 마우스의 혈청을 분리하여 혈청 내의 S.
0 x 104 cfii가 되도록 접종하였다. 그 뒤 37℃에서 36시간 동안 배양하여 minimum inhibitory concentration (MIC), 즉 균의 성장이 관찰되지 않은 최소농도를 측정하였다6,21,22).
typhimurium DT104에 대한 IgA를 측정하였다. 또한 systemic immune response를 측정하기 위하여 마우스의 혈청을 분리하여 혈청 내의 S. typhimurium DT104에 대한 IgG를 측정하였다.
3주령의 Specific Pathogen Free (SPF) ICR 마우스 암,수 각각 22마리를 본 실험에 사용하였으며, SPF 마우스임을 확인하기 위하여 분변에 대한 미생물학적 검사를 실시하여 특정 병원체가 없는 것을 확인한 후 실험을 실시하였다. 마 우스는 암, 수 각각 Negative Control군은 4마리, 3개의 실 험군은 각각 6마리씩 (Negative Contro군 총 8마리, 3개의 실험군 각각 총 12마리) 임의로 선택하여 케이지에 분리하였으며, 1 주일 간의 적응기간을 둔 후 실험을 실시하였다. SPF 상태를 유지하기 위해 음수, 사료, 깔짚 등은 모두 고압 멸균 후 사용하였으며, 온도 22℃, 습도 50%, 12시간 간격 으로 조명이 조절되고, 환기도 자동으로 조절되는 실험동물사육징치 (MJ-721CS, Myung-Jin, Korea)에서 사육하였다.
typhimurium DT104의 양상을 분석하기 위하여 공격 접종 후 3일 동안 각 군의 마우스로부터 분변을 수집하였다. 마우스의 분변을 0.85% 생리식염수에 십진 희석 하고, Xylose Lysine Desoxycholate agar (XLD, Difco BRL)를 사용하여 37℃에서 24시간 배양한 후 균수를 측정하고 분변 중의 S. typhimurium DT104의 숫자를 cfii/g 으로 환산하였다40).
본 공시제제는 증류수에 잘 용해되므로 in vitro에서의 항 균력 시험에는 공시제제 2g을 10ml의 증류수에 녹이고0.45 fim syringe filter (Sartorius, Germany)로 여과한 것을 사용하였으며, 마우스 접종 실험에는 제조사 (RNL, Korea)가 제시한 사람의 섭취량인 6g/60kg에 따라 공시제제 4 mg을 10 ml의 증류수에 녹이고 마우스 평균 체중: 20 g) 각 개체당 0.5 ml씩 투여하였다.
분변으로 배출되는 S. typhimurium DT104의 양상을 분석하기 위하여 공격 접종 후 3일 동안 각 군의 마우스로부터 분변을 수집하였다. 마우스의 분변을 0.
실험은 Negative Control 군, ST군, RNL+ST 군, RNL+ST+RNL군으로 총 4군으로 나누어 실시하였다. Negative Control군은 실험기간 동안 PBS만을 투여하였고, ST군은 7일 동안 PBS를 투여한 후 S.
IgG 측정을 위해서는 혈청 100 µl 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBST로 5회 세척한 후 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (Zymed)를 1:4000으로 PBS에 희석하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이후 O-phenylene diamine (OPD; Sigma)로 발색시켜 ELISA reader (IDEXX)를 이용하여 490nm에서 optical density (OD)를 측정하였다20,23,36).
typhimurium DT104에 대한 IgG를 측정한 결과 백련초 제제를 공격 접종 전, 후로 투여 한 경우 다른 군들과 비교하여 비교적 높은 수준의 OD 값을 나타내었지만 유의성 있는 수준은 아니었다. 일반적으로 외부에서 침입 또는 주입한 항원에 대한 항체의 생성이 최 고로 일어나는 시기는 10-17일이 경과된 후 이지만, 본 실험 에서는 공격 접종 후 분변으로 배줄되는 S. typhimurium DT104과 항체가를 함께 확인해보기 위해 공격접종 1일과 3 일 후에 항체가를 측정하여 보았다. 단 한번의 공격 접종과 공격 접종 후 너무 빨리 그 값을 측정하였기 때문에 S.
장에서 S. typhimurium DT104를 검출하기 위하여 공격 접종 1일과 3일 후 마우스를 부검하여 장의 일부를Rappaport and Vassiliadis (RVS) broth (Merck, Germany)에 넣고 42℃에서 18시간 동안 증균시킨 후 XLD agar (Difco BRL)에 접종하여 장에서 S. typhimurium DT104가분리되는지 확인하였다40).
대상 데이터
In vitro에서의 항균력 시험에는 Salmonella enterica serovar Enteritidis (이후 S. enteritidis로 표기) ATCC 13076과 ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, sulfonamides, 그리고 tetracycline 등 5가지 항생제에 대해 내성 (ACSSuT type)을 보이는 S. enterica serovar Typhimurium DTI04 (이후 S. typhimurium DT104로 표기, 미국 Washington State University에서 분양) 및 vero cytotoxin (VT) I과 II 를 모두 분비하는 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894 를 사용하였다. 균주들은 blood agar (KOMED, Korea)에서 배양하여 오염여부를 확인한 뒤 Tryptic Soy Broth (TSB; Difco BRL, USA)에 접종, 37℃에서 24시간 동안 배양하여실험에 사용하였다.
typhimurium DT104로 표기, 미국 Washington State University에서 분양) 및 vero cytotoxin (VT) I과 II 를 모두 분비하는 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894 를 사용하였다. 균주들은 blood agar (KOMED, Korea)에서 배양하여 오염여부를 확인한 뒤 Tryptic Soy Broth (TSB; Difco BRL, USA)에 접종, 37℃에서 24시간 동안 배양하여실험에 사용하였다.
본 연구에 사용된 제제는 주성분이 백련초 (Opuntia ficus-indica var. saboten)로서 북제주군 한림읍에서 재배한것이며, 북제주군 농업기술센터에서 줄기와 열매를 수세 및 탈수과정을 거쳐 동결 및 건조한 분말을 시료로 사용하였다.
데이터처리
0 (Microcal Software, USA)를 이용 하.여 Student's /-test와 analysis of variance as appropriate(ANOVA)를 이용하여 자료를 분석, 통계처리 하였다.
성능/효과
S. typhimurium DTI04 공격 접종 1일 후에는 ST군, RNL+ST군, RNL+ST+RNL군의 마우스의 장에서 모두 S.typhimurium DT104를 검출할 수 있었으나, 3일 후에는 ST 군에서만 S. typhimurium DT104가 검출되었다. Negative Control군의 경우 S.
ST군에서도 S. typhimurium DT104의 배출이 감소하였으나 RNL+ST군과 RNL+ST+RNLe。] 좀 더 빨리 감소하였으며, RNL+ST군과 RNL+ST+RNL 군의 경우 3일 후에는 분변에서 S. typhimurium DT104의 배출이 검출되지 않은 반면 ST군에 서는 3일에도 균이 계속 배출되었다. Negative Contr이군의 경우 실험 전 기간 동안 S.
ficus-indica var. saboten 투여 없이 S. typhimurium DT104만을 공격 접종한 ST군과 비교하여 그 배출이 급격히 감소함을 확인할 수 있었다. ST군에서도 S.
ficus-indica var. saboten의 최종 농도가 1%에서 5%까지 모든 농도에서 균의 성장이 관찰되었으며, 본 실험에서는 minimum bactericidal concentration (MBC)은 5% (v/v), 즉 lOmg/ml 이상으로 정확한 농도는 측정할 수 없었다 (데이터 생략).
typhimurium DT104과 항체가를 함께 확인해보기 위해 공격접종 1일과 3 일 후에 항체가를 측정하여 보았다. 단 한번의 공격 접종과 공격 접종 후 너무 빨리 그 값을 측정하였기 때문에 S.typhimurium DT104에 대한 IgA 및 IgG가 peak에 이르는 값을 측정할 수는 없었지만 RNL+ST군과 RNL+ST+RNL군 의 경우 다른 군과 비교하여 이미 공격 접종 후 3일째에 비교적 높은 수준의 IgA와 IgG의 생성이 유도되었음을 확인할 수 있었다.
typhimurium DT104에 대한 IgA 를 측정한 결과 RNL+ST군과 RNL+ST+RNL군에서는 공격 접종 1일 후부터 다른 군들과 비교하여 다소 높은 OD 값을 보임을 확인할 수 있었다. 또한 공격 접종 3일 후에도 두 군에서 역시 높은 OD 값을 보였으며, 특히 RNL+ST+RNL 군에서 높은 IgA가 존재함을 확인할 수 있었다 (p<0.05)(Fig- 2).
마우스 분변의 S. typhimurium DT104에 대한 IgA를 측정한 결과 백련초를 투여한 경우 높은 OD 값을 확인할 수 있었으며, 특히 백련초를 S. typhimurium DT104 공격 접종이후에도 지속적으로 3일간 투여한 경우에 더욱 높은 항체 가를 확인할 수 있었다. 분변의 IgA는 장으로 배출되는 IgA 를 간접적으로 대변하는 것19)으로서 백련초를 경구투여하고S.
typhimurium DT104에 대한 항균력이 높게 나타난 원인의 하나로 생각된다. 마우스 혈청으로부터 S. typhimurium DT104에 대한 IgG를 측정한 결과 백련초 제제를 공격 접종 전, 후로 투여 한 경우 다른 군들과 비교하여 비교적 높은 수준의 OD 값을 나타내었지만 유의성 있는 수준은 아니었다. 일반적으로 외부에서 침입 또는 주입한 항원에 대한 항체의 생성이 최 고로 일어나는 시기는 10-17일이 경과된 후 이지만, 본 실험 에서는 공격 접종 후 분변으로 배줄되는 S.
마우스를 이용한 항균능 실험에서는 백련초 제제를 투여하지 않고 S. typhimurium DT104를 공격 접종한 ST군의 경우 실험기간 동안 계속 분변으로 S. typhimurium DT104가 배출되었으나 백련초 제제를 경구투여한 결과 S. typhimurium DT104 공격 접종 3일 후에는 분변으로부터 S. typhimurium DT104의 배출이 확인되지 않았으며, 장에서 또한 균을 분리할 수 없었다.
마우스의 분변 내에 S. typhimurium DT104에 대한 IgA 를 측정한 결과 RNL+ST군과 RNL+ST+RNL군에서는 공격 접종 1일 후부터 다른 군들과 비교하여 다소 높은 OD 값을 보임을 확인할 수 있었다. 또한 공격 접종 3일 후에도 두 군에서 역시 높은 OD 값을 보였으며, 특히 RNL+ST+RNL 군에서 높은 IgA가 존재함을 확인할 수 있었다 (p<0.
마우스의 혈청 내에 S. typhimurium DT104에 대한 IgG 를 측정한 결과 RNL+ST 및 RNL+ST+RNL 군에서 Negative control군과 비교하여 비교적 높은 OD 값을 나타 내었지만 유의성이 있는 차이를 보이지는 않았다 (Fig. 3).
백련초 (O. ficus-indica var. saboten)^] 항균능을 평가해 보기 위해 실시된 본 실험 결과 flavonoids 등 항균력이 인 정된 성분으로 구성된 백 련초 제제는 S. enteritidis, S. typhimurium DTI04 및 E. coli O157:H7에 대한 억제능 (inhibitory activity)은 있으나 사멸능 (bactericidal activity)은 없는 것으로 판단되었다. Salmonella spp.
본 연구를 통해 민간요법으로 사용되던 백련초의 S.enteritidis, S. typhimurium DTI04 및 E. coli O157:H7에대한 항균력뿐만 아니라 그에 대한 강한 항체 생성능 유도 또한 확인할 수 있었으며, 또한 백련초 제제를 S. typhimurium DT104 공격 접종 전에만 투여한 군에 비하여 공격 접종 후에도 지속적으로 투여한 군에서 Salmonellae 대한 항균력 및 이에 대한 항체 생성능이 더 높았으므로 백 련초를 지속적으로 섭취하는 것이 중요할 것으로 사료된다. 본 연구를 통해 백련초 및 그 성분을 이용한 병원성 세균의 제거 및 면역 증진 효과 등과 같은 연구의 필요성을 확인할 수 있었으며, 백련초의 응용 가능성이 매우 높은 것으로 사 료되었다.
후속연구
의 경우에는 ethanol extraction 방법으로 추출한 경우에 항균력 이 가장 높은 것으로 확인되었다. 본 실험에서는 제재의 특 성상 보다 높은 농도의 수용액을 얻기가 불가하였으므로 더 높은 농도에서의 항균력 시험은 수행하지 않았으며, 추후ethanol 또는 methanol extraction 방법으로 추출한 백련초를이용하여 항균능 실험을 실시하여 그 항균능의 차이를 비교 하는 실험이 수행되어야 할 것이다.
typhimurium DT104 공격 접종 전에만 투여한 군에 비하여 공격 접종 후에도 지속적으로 투여한 군에서 Salmonellae 대한 항균력 및 이에 대한 항체 생성능이 더 높았으므로 백 련초를 지속적으로 섭취하는 것이 중요할 것으로 사료된다. 본 연구를 통해 백련초 및 그 성분을 이용한 병원성 세균의 제거 및 면역 증진 효과 등과 같은 연구의 필요성을 확인할 수 있었으며, 백련초의 응용 가능성이 매우 높은 것으로 사 료되었다.
또한 백련초 성분의 추출 방법도 항균력에 영향을 미칠 수 있었을 것으로 사료된다. 본 연구에는 동결, 건조된 백련 초 열매 및 줄기의 분말이 사용되었는데 ethanol 또는 methanol extraction 등과 같은 방법으로 추출을 할 경우보다 높은 항균력을 보일 것으로 예상된다. Okeke 등이Landolphia owerrience 를 ethanol, cold water 및 hotwater* 이용하여 추출한 결과 각 방법에 따라 실험물질에 포함되어 있는 여러가지 성분들의 농도가 달리 추출되었으 며, 각 추출 방법에 따라 항균력을 나타내는 균의 종류도 달리 나타났다27).
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