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문제 정의
- 'OS) 실제 생명체는 끝없이 생성되는유해한 활성산소에 대해 겹겹의 분자적 항산화 장치를마련하고 있으며 그중의 한 그룹인 항산화효소계로는 superoxide dismutase(SOD)> catalase, glutathione peroxidase(GPx)등이 있다.''-⑺ 특히 미토콘드리아의 MnSOD gene에는 항암유전자昭囘는 제안이 제기되었을 정도로 암과 항산화계의 밀접한 관계가 제시되고있음에 착안하여 본연구에서는 SD-994의 항암효과와항산화효소인 SOD, GPx, catalase 효소 활성 사이에유의성 있는 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
- 본 연구실에서는 이미 황해쑥의 열수추출액과 메탄올추출액은 HTB 176, TIB 67, SK-Mel-1, SNU-1 암 세포등 검색한 거의 모든 암세포주에 대하여 다른 천연계 생약제의 추출물과 달리상당히 높은 세포독성을 고르게 나타낸 결과를 얻어부분적으로 밝힌 바 있다.12)이들 결과로부터 황해쑥에는 다양한 암세포에 대하여 항암효과를 나타내는 성분이 다수 함유되어 있을 가능성이 시사되었기에 본 실험을 수행하였다. 분리정제 과정의 개요는 Scheme 1에 제시되어 있으며 황해쑥의 methanol 추출액으로부터의 분리 정제 첫 번째 단계인 각 용매 분획이 백혈병의 지표 암세포인 L1210 세포에 대해 나타내는세포독성을 검색한 결과 10 飓의 농도에서 he- xane(74, 6±63%), chloroform(85.
- 우선 산소(。2)로부터 유래하는 활성산소 대사과정의 첫째번 단계의 물질은 superoxide(O2-)로■써 이 superoxide 가 생성되면 순차적으로 H2O2 그리고 . OH radical이 생성되므로”心) SD-994의 첨가에 의하여 활성산소들이 생성되는 지알기 위하여 무엇보다도 superoxide 의 생성을 확인하고자 하였다. Table IV에 제시된 결과에 의하면 SD-994를 L1210세포에 농도별로 첨가했을 때 control 값에 비해 SD-994를 첨가한 실험군에 있어서 배양기간과 SD-994의 농도에 비례하여 (易-의 생성이 123.
- '2)쑥(Artemisia herbal 국화과 (Compositae)의 다년생 식물로 주로 식품으로 사용되는 한편 부작용이 없는 말라리아 치료제인 artemisin의 원료, 탁월한 간염치료제, 뜸쑥의 재료, 하복부 냉증 개선제 등에 두루 사용되어 왔다. 이외에도 최근 들어 쑥의 항세균활성, 항암활성등이 보고되고3切 있는 점과 연계하여 쑥으로 부터의 항암제 개발을 위해 동물실험과 암세포주 대상으로 세포독성 (cytotoxicity) 실험을 수행하였으며 동시에 무독성의 확인을 위하여 L1210 cells에 상응하는 normal lymphocytes에 대하여 독성 도(toxicity)를 확인하고 나아가 암을 비롯한 난치병의 원인과 치료의 관점에서 주요 핵심물질로 대두되고 있는 활성산소 소거효소의 활성변화를 측정함으로써 쑥 추출 정제 물인 SD-9942] 항암작용 기작의 일부를 규명하고 자 하였다.
제안 방법
- A의 소분획 I~IX의 L1210세포와 normal lympho- cytes에 대한 세포독성 비교 - 메탄올 추출액으로부터 chloroform 분획물을 얻고 이 chloroform 분획물로부터 A~G분획을 분리한 다음 다시 A 분획으로부터 I~IX물질을 얻어 이들에 대한 L121&세포에 대한 세포독성효과와 아울러 안전성의 견지에서 normal lymphocytes에 대한 세포독성 실험을 병행하여 그결과를 Tale II에 제시하였다. 이 실험에서는 이들 화합물들이 단일 화합물로 정제된 상태이므로 추출 혼합물보다 낮은 1 의 농도로 첨가하였다.
- Chloroform추출물의 분획 A〜G의 암세포주에 대한 세포독성 - 황해쑥의 methanol extract가 동물실험에서 생명 연장 효과가 있음을 토대로 이 methanol extract 로 부터 항암 성분을 채계적으로 분리 정제하기 위하여 용매의 극성에 따라 silica gel chromatography를 순차적으로 시행하였다. 본 연구실에서는 이미 황해쑥의 열수추출액과 메탄올추출액은 HTB 176, TIB 67, SK-Mel-1, SNU-1 암 세포등 검색한 거의 모든 암세포주에 대하여 다른 천연계 생약제의 추출물과 달리상당히 높은 세포독성을 고르게 나타낸 결과를 얻어부분적으로 밝힌 바 있다.
- L1210 암세포가 사멸하는 과정에 SOd에 의해 생성된 H2O2< GPx이외 catalase도 분해하는지 검색하기 위하여 다음 실험으로 SD-994를 첨가함에 따라 변화하는 catalase 활성 변화를 측정하였다. 그 결과를 Table V에 제시하였는데 무엇보다도 특이 한 것은 어느 실험 조건에서나 catalase 활성이 절대적으로 적어서 측정이 잘되지 않았다는 점이다.
- 되었다. L121Q세포에 대해 50%이상의 충분한세포독성을 일으키는 농도인 1 ng/mZ~10 의 SD-994를 첨가하여 50 mZ의 culture flask에서 3일간배양을 한 다음 각각의 cytoplasm과 mitochondria 분획을 분리하여 각 분획의 superoxide dismitase(SOD), catalase, glutathione peroxidase(GPx) 효소활성을 측정하였다. 이들 효소들은 분자 산소에서 유래한 유해활성산소들을 제거하는 대표적인 항산화효소“頂)로서그들의 활성이 SD-994를 첨가함으로서 변화하는 것은곧 활성산소의 대사 변화를 의미하는 것으로 간주할수 있기 때문이다.
- OH 를 대사를 파악하는데 중요하므로 다음 실험에서는 이들 두가지 효소의 활성을 측정하였다.
- SD-9942I 첨가에 의한 L1210세포의 superoxide dismutase(SOD) 및 이utatMione peroxidase(GPx) 효소활성의 변화 - 다음으로 SD-994의 항암 기작의 규명을 위하여 SD-994에 의해 유발된 세포독성과 활성산소 제거효소인 항산화효소 활성과의 연관 실험을 행하게 되었다. L121Q세포에 대해 50%이상의 충분한세포독성을 일으키는 농도인 1 ng/mZ~10 의 SD-994를 첨가하여 50 mZ의 culture flask에서 3일간배양을 한 다음 각각의 cytoplasm과 mitochondria 분획을 분리하여 각 분획의 superoxide dismitase(SOD), catalase, glutathione peroxidase(GPx) 효소활성을 측정하였다.
- SD-994의 첨가에 의한 L1210세포에서의 %■■생성 -이상의 결과들로부터 SD-994가 L1210세포에 대해강한 세포독성을 일으키는 것을 알게 되었는데 이러한암세포의 사멸현상의 기작을 규명하고자 L1210세포에 SD-994를 첨가함으로써 야기되는 변화를 활성산소의관점에서 검색하여 보았다. 우선 산소(。2)로부터 유래하는 활성산소 대사과정의 첫째번 단계의 물질은 superoxide(O2-)로■써 이 superoxide 가 생성되면 순차적으로 H2O2 그리고 .
- 방법을 적용하였다?。)ICR mouse로 부터 venous bloodt EDTA를 함유한 용기에 신속하게 모은 다음 약 1시간 이내에 모든 조작을 수행하였다. 실온에서 15 I血의 conical test tube에 3 n乂의 dextran 유도체인 histopateque를 가한 다음 혈액 3 m/ 를조심스럽게 layering 하여 400 g에서 정확히 30분간 실온에서 원심분리 하였다.
- 고자하는 황해쑥의 methanol extract를 10 ng/100 pZ으로, 그리고 황해쑥에서 최종적으로 분리 정제하여 항암성분으로 선택한 SD-994를 1 飓과 2 曲/100 W의 농도로 제조하여 10일간 매일 100 pZ/20 g body weights. 경구투여 하면서 사망일자를 검사하였다. 이 결과를 복수암만 유도시킨 대조군의 사망일자와 비교하여 백분율(%)로 비교함으로써 생명연장 효과 즉 항암효과의 일부로 간주하였다.
- 주입 후 24시간 째부터 검사히. 고자하는 황해쑥의 methanol extract를 10 ng/100 pZ으로, 그리고 황해쑥에서 최종적으로 분리 정제하여 항암성분으로 선택한 SD-994를 1 飓과 2 曲/100 W의 농도로 제조하여 10일간 매일 100 pZ/20 g body weights. 경구투여 하면서 사망일자를 검사하였다.
- 다음으로 황해쑥의 메탄올 추출액으로부터 최종적으로 항암물질인 SD-994를 정제하여가는 과정중에 얻어진 중간 분획들 즉 chloroform 분획, °] chloro form 분획으로부터 얻어진 subfraction I~IX에 대해 L1210 암세포주에 대한 세포독성과 정상세포에 대한안전성의 검색을 위하여 정상 세포인 normal lymphocytes에 대한 독성을 측정하였으며 최종적으로얻어진 SD-994에 대해서는 반응 기작의 규명을 위하여 활성산소 및 항산화효소와의 관계를 실험하여 그결과를 다음에 순차적으로 제시하였다.
- 따라서 A~G까지의 분획중에서 세포독성이 가장 탁월한 A분획을 선택하여 다시 hexane : EtOAc=5:l 용매 계로 용출하였을 때 1~成까지의 9가지의 정제 물이 얻어졌다. 이들은 evaporation 과 frSeze-dry를 시켰을 때 oil과 powder로 얻어졌으므로 TLC와 융점 검사로 단일 화합물인 것을 확인하고 L121Q세포에 대한 세포독성을 검사하였으며, 아울러 암세포에 대한 세포 독성 못지 않게 정상세포에 대한 세포독성이 낮을수록 항암제로서의 안전성이 확보될 수 있으므로 normal lymphocytes에 대한 세포독성 검사를 병행 실험하여 그 결과를 Table .
- 상등액은 8겹의 gauze로 여과시켜 여액을 회수하고(1차추출액) 잔사에 다시 500 血의 메탄올을 가하여 24시간 방치하여 재차 여과하여 여액을 회수 한 다음 1차추출액과 합하여 감압 농축하였다. 메탄올 추출액으로부터 용매극성에 따라 계통분리한 각 분획의 조제 방법은 Scheme 1에 표시하였으며 본논문의 중심 물질은 SD-994로 표시한 정제물로서 TLC와 융점의 검색에 의하여 확인하였다. 정제과정중 필요한 분획에 대해서는 L121Q세포와 더불어 normal lymphocyte 에대해서도 세포독성 검사를 시행하였다.
- 이 마지막 세척 조작을 다시 한번 반복하여 최종적으로 배양액에 현탁하여 세포 수를 계산 한 다음 세포배양에 사용하였다. 배양은 DMEM 배지에 streptomycin과 penicilHrr을 1 卩g/mZ의농도로 첨가하여 primary culture를 시행하였다.
- 세포배양, 세포독성 검사, 항산화효소 용액 조제 - L1210 세포는 생쥐에서 유래한 leukemia cell로서 계대 배양은 3~4일에 한 번씩 시행하였다. 배양조건은 37°C, 5% CO?의 humidified condition이었으며 세포독성 검사는 NCI방법19)의 protocol에 준하여 24 well plate에 106 cells/mZ의 세포를 가한후 3일간 배양하고그 세포수의 변화를 hemocytometer로 계산하여 control 세포수에 대한 감소를 백분율(%)로 나타내었다.
- 대해서는 매우 저독성임을 알게 되었다. 아울러 이와 같은 SD-994의 효과를 기존의 항암제의 일종인 5- Huorouracil(5-FU侦과 참고로 비교 검색하였다. Table HI에 제시된 결과에 의하면 0.
- 경구투여 하면서 사망일자를 검사하였다. 이 결과를 복수암만 유도시킨 대조군의 사망일자와 비교하여 백분율(%)로 비교함으로써 생명연장 효과 즉 항암효과의 일부로 간주하였다. 각 실험군의 동물은 6마리였다.
- Tale II에 제시하였다. 이 실험에서는 이들 화합물들이 단일 화합물로 정제된 상태이므로 추출 혼합물보다 낮은 1 의 농도로 첨가하였다. 결과로 부터알 수 있듯이 I~IX 까지의 물질은 L1210 암세포주에대해서는 각각 26.
- 이들은 evaporation 과 frSeze-dry를 시켰을 때 oil과 powder로 얻어졌으므로 TLC와 융점 검사로 단일 화합물인 것을 확인하고 L121Q세포에 대한 세포독성을 검사하였으며, 아울러 암세포에 대한 세포 독성 못지 않게 정상세포에 대한 세포독성이 낮을수록 항암제로서의 안전성이 확보될 수 있으므로 normal lymphocytes에 대한 세포독성 검사를 병행 실험하여 그 결과를 Table .II에 표시하였다
- 이 결과는 L1210 세포에 SD-994를 가하여사멸시킬 때 L1210 세포에서는。2-의 생성이 증가된다는 것을 시사하는 것으로 볼 수 있으며 이 사실은 본 저자가 다른 종류의 암세포의 경우에서도 보고한바 있는데12)최근들어 여러 항암제의 작용기작이 활성산소의 유발에 의해 apoptosis가 촉발되기 때문이라는 보고가 점증되고 있음에 비추어 본 SD-994의 작용기작 역시。2「생성을 기점으로 활성산소와 그들의 대사 물질이 관여하는 것이 아닌가 사료되었다. 이와 같은 논리의 추시를 위하여 다음 실험으로 superoxide의 전환효소인 superoxide dismuitase(SOD) 그리고 그 생성물인 H2O2S] 분해효소인 catalase와 glutathione peroxidase(GPx)의 활성을 측정하여 보았다.
- 메탄올 추출액으로부터 용매극성에 따라 계통분리한 각 분획의 조제 방법은 Scheme 1에 표시하였으며 본논문의 중심 물질은 SD-994로 표시한 정제물로서 TLC와 융점의 검색에 의하여 확인하였다. 정제과정중 필요한 분획에 대해서는 L121Q세포와 더불어 normal lymphocyte 에대해서도 세포독성 검사를 시행하였다.
- 8% 정도의 약한 세포독성을 나타내어 독성이 작으면서도상당히 우수한 항암 효과를. 지닌 성분으로 간주 할 수있었으므로 이중에서 I 화합물을 선택하여 SD-994로칭하고 작용기작의 검색을 활성산소 및 항산화효소와연계하여 추진하게 되었다.
- 황해쑥의 메탄올 추출액과 SD-994의 암유발 동물의생명연장 효과 - 황해쑥에서 분리한 물질들의 항암효과와 항산화효소와의 관계를 실험하기 전에 우선 항암효과의 일환으로 암유발동물의 생명연장 효과를 검색하였다. Table I에 표시되어 있듯이 메탄올 추출액은암을 유발시킨 쥐보다 평균 4.
대상 데이터
- 이 결과를 복수암만 유도시킨 대조군의 사망일자와 비교하여 백분율(%)로 비교함으로써 생명연장 효과 즉 항암효과의 일부로 간주하였다. 각 실험군의 동물은 6마리였다.
- (New Ybrk, USA) 로 부터 구입하였으며 membrane hlter는 Sartorius Co. 그리고 ICR mouse는 국제 실험동물센터로부터구입하여 사용하였다.
- 동물 실험 -4주령 째의 ICR mouse를 구입하여 2주일 동안 실험실 조건에 적응시키면 체중이 약 18-22 g이 된다. 이때 복수암의 형태로 계대 보존하였던 Sarcoma 18。을 mouse로 부터 채취하여 cel0mZ 의 농도로 조절한 후 100 阿20 g body weights.
- 12)이들 결과로부터 황해쑥에는 다양한 암세포에 대하여 항암효과를 나타내는 성분이 다수 함유되어 있을 가능성이 시사되었기에 본 실험을 수행하였다. 분리정제 과정의 개요는 Scheme 1에 제시되어 있으며 황해쑥의 methanol 추출액으로부터의 분리 정제 첫 번째 단계인 각 용매 분획이 백혈병의 지표 암세포인 L1210 세포에 대해 나타내는세포독성을 검색한 결과 10 飓의 농도에서 he- xane(74, 6±63%), chloroform(85.7± 62%), ethylacetate (44.8 ± 6.6%), buthanol(27.9 ± 5.3%), water(25.3 ± 6.1%)의 세포독성 결과를 엄었으며 이중에서 암세포에대하여 세포독성이 높으면서도 normal lymphocytes에대하여 10%이내의 약한 세포독성을 나타낸 분획이 chloroform 분획과 ethylacetate 분획이었는데 이 두분획 중에서 chloroform 분획의 암세포에 대한 세포독성이 더 높았으므로 다음 분리 정제의 대상물로 chloroform 분획을 선택하였다.
- 재료 - 황해쑥은 강화도에서 채취하여 3년이상 건조된 제품을 구입하였으며 L1210 cell과 기타 암세포주는 서울대학교 부설 암연구소로 부터 분양받아 사용하였다. 배양에 필요한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), fetal bovine serum, culture flask 등은 Grand Island Biological Co.
- 의 sonicatorS. 1。초씩 5차례 초음파처리를 하여 미토콘드리아의 matrix 존재하는 것으로 알려진 MnSOD효소를 노출하여 미토콘드리아 분획의 항산화효소의 조효소액으로 사용하였다.
이론/모형
- Catalase활성의 측정은 Maral et al, 의 방법22)에준하여 250 nm, 20°C에서의 흡광도감소를 근거로 이루어졌다. 반응액 1 mZ에는 50 mM의 potassium phosphate buffer(pH 7.
- GPx활성의 측정은 Matsuo의 방법23)에 의하여 tertiarybutylhydroperoxideS 기질로 하여 이루어졌匸L 반응액 ] m/에는 5 mM EDTA, 0.134 mM NADPH, 2 mM reduced glutathione, lu/mZ glutathione re ductase, enzyme solution을 함유하며 37°C에서 수 분간 예열시킨 다음에 최종적으로 0.16 mM tertiary butylhydroperoxideS- 첨가하여 340 nm에서 NADPH 의 산화에 의한 홉광도 감소를 10초 간격으로 기록하였다. GPx 활성은 H2O2 nmoles degraded/min/108 cells로 표시하였다.
- Normal lymphocytes 분리 - ICR mouse로 부터 normal lymphocytes를 조제하는 방법은 기본적으로 Boyum의 방법을 적용하였다?。)ICR mouse로 부터 venous bloodt EDTA를 함유한 용기에 신속하게 모은 다음 약 1시간 이내에 모든 조작을 수행하였다. 실온에서 15 I血의 conical test tube에 3 n乂의 dextran 유도체인 histopateque를 가한 다음 혈액 3 m/ 를조심스럽게 layering 하여 400 g에서 정확히 30분간 실온에서 원심분리 하였다.
- 준하였다. SOD의 측정방법은 McCord & Fridovich 의 방법幻)에 의하였으며 반응액은 50 mM potassium phosphate buffer; 1X105 M cytochrome c, 0.05M xanthine, 0.1 mM EDTA. SOD 조효소 액을 함유하며 이용액을 25。(3에서 15분간 항 온화 시킨 다음 xanthine oxidase를 가하여 반응이 개시된다.
- 5% CO?의 humidified condition이었으며 세포독성 검사는 NCI방법19)의 protocol에 준하여 24 well plate에 106 cells/mZ의 세포를 가한후 3일간 배양하고그 세포수의 변화를 hemocytometer로 계산하여 control 세포수에 대한 감소를 백분율(%)로 나타내었다. 한편 황해쑥으로부터 얻은 각 분획의 세포독성과연관된 L1210 세포내 항산화효소 활성변화를 검색하기 위해서는 50 ml culture flask에 106 cells/m/농도의 seed cells 0.
성능/효과
- 모두에서。2-의 전화효소인 superoxide dismutase(SOD) 와 그 생성물인 玮%의 분해효소인 glutathione peroxidase(GPx) 효소활성이 control치에 비하여 50배 정도로 높은 증가율을 보였다.
- 56%로 모두 증가하는 것을 알 수있었다. 이 결과는 L1210 세포에 SD-994를 가하여사멸시킬 때 L1210 세포에서는。2-의 생성이 증가된다는 것을 시사하는 것으로 볼 수 있으며 이 사실은 본 저자가 다른 종류의 암세포의 경우에서도 보고한바 있는데12)최근들어 여러 항암제의 작용기작이 활성산소의 유발에 의해 apoptosis가 촉발되기 때문이라는 보고가 점증되고 있음에 비추어 본 SD-994의 작용기작 역시。2「생성을 기점으로 활성산소와 그들의 대사 물질이 관여하는 것이 아닌가 사료되었다. 이와 같은 논리의 추시를 위하여 다음 실험으로 superoxide의 전환효소인 superoxide dismuitase(SOD) 그리고 그 생성물인 H2O2S] 분해효소인 catalase와 glutathione peroxidase(GPx)의 활성을 측정하여 보았다.
- SD-994와 5・FU(5・fluggmcil)의 세포독성 비교 - 이상으로 부터SD-994로 명명된 I화합물은 L1210 세포에 대해서는 독성이 강하면서도 normal lymphocytes 에 대해서는 매우 저독성임을 알게 되었다. 아울러 이와 같은 SD-994의 효과를 기존의 항암제의 일종인 5- Huorouracil(5-FU侦과 참고로 비교 검색하였다.
- 아울러 이와 같은 SD-994의 효과를 기존의 항암제의 일종인 5- Huorouracil(5-FU侦과 참고로 비교 검색하였다. Table HI에 제시된 결과에 의하면 0.015 iLg/m/~10의 넓은 농도범위에서 SD-994의 L1210 암세포와 normal lymphocytes에 대해 세포독성을 검색했을 때 0.125 ng/m; 까지의 저농도에서는 각각 6.80±3.21% 와 0.73±0.38%정도의 매우 적은 세포독성을 나타내었다. 반면에 5-FU는 같은 농도에서 암세포와 normal lymphocytes에 대해 79.
- Table I에 표시되어 있듯이 메탄올 추출액은암을 유발시킨 쥐보다 평균 4.5일 정도 더 살아 18.36%의 생명연장을 나타냈고, SD-994의 경우 1 卩g^Og body weight에서는 5.3일 그리고 2 卩g/20 g body weight의 농도에서는 약 6일 정도 더 살아 각각 17.67%와 25.83%의 생명연장 효과를 나타내었다. 이 결과로 부터 황해쑥의 메탄올추출액과 그 추출액으로 부터의 최정 정제물인 SD-994는 Sarcoma 180으로 발암된 mouse의 종양을 제거하지는 못하였어도 생명을 연장하는 효과가 비교적 높은 것으로 판단되었다.
- 54%의 심한 세포독성을 보였다. 구체적인 예로 단일 항암 성분의 보통 사용량인 1 ug/m;의 농도에서의 세포독성을 비교하여 보면 SD-994는 L1210세포와 normal lymphocytes0!] 대해서 82.31~5.11%와 4.68~0.85%의 세포독성을, 5-FU는 84.2±6.74~55.87±9.63%의 세포독성을 각각 나타낸 것으로 보아 SD-994는 L1210세포에 대해서는 5-FU와 비슷한 세포독성을 나타내면서도 normal lymphocytes에 대해서는 독성이 약 1/10에 불과흐卜므로 안전성이 훨씬 높은 것을 알 수 있었다. L121M1 포에 대하여 계산된 SD-994와 5-FU의 IC50 값은 각각 0.
- 이 실험에서는 이들 화합물들이 단일 화합물로 정제된 상태이므로 추출 혼합물보다 낮은 1 의 농도로 첨가하였다. 결과로 부터알 수 있듯이 I~IX 까지의 물질은 L1210 암세포주에대해서는 각각 26.6±8.4~80.7土9.1%의 세포독성을나타내었고 세포생존율은 거의 90%이상의 수치를 나타내었다. 이 물질들이 정상 lymphocytes에 대해서나타낸 세포독성은 2.
- 다시 말하면 분자산소 (。2)가 부분적으로 환원되면서 02- h2o2, oh 등의 활성산소를 생성하는 다단계 경로에서 결정적으로 중요한 첫 번째와 두번째 단계의 반응을 촉매하는 SOD와 GPx 또는 catalase 효소의 활성이 전체 활성산소의 향^를 결정하는 주요요인이 될 수있는 데 본 연구의 결과 catalase활성은 cytoplasm 과 mitochondria 에서 거의 측정되지 않았으므로로부터 생성된 는 catalase에 의해 HQ+Oj가 되는반응보다는 GPx효소에 의해 HQ?—HQ+hyrogem acceptor의 경로로 진행되는 것으로 판단 되었다.
- 본 실험을 통하여 황해쑥의 특징으로서 파악하게된사항은 작은 fraction A 한가지로 부터 유래한 I-IX 의 소분획에만 해도 L121O세포사멸효과가 있는 물질이 다수 존재할 가능성을 시사되었는데 이 사실은 황해쑥 식물 전체에는 아마도 각각 다른 구조와 작용기작을 발휘하는 여러종류의 항암물질이 공존할 것으로판단되어 실제 발생기작이 복잡한 암을 임상적으로 치료하기 위해서는 오히려 황해쑥 전초의 추출물 자체를투여하면 다각도로 항암효과를 유도할 수 있지 않을까사료되었다.
- 언급한대로 다른 종류의 암세포에서는 물론 아직 보고하지 않은 수종의 항암 추출물의 경우에서도 암세포의종류에 관계없이。2「의 발생이 포착되고 있다. 본 연구실에서의 결과와 다른 연구실로부터 보고되고 있는결과들을 종합하여 보면 천연 항암제에 의해 암세포가사멸하는 경우에 0/를 비롯한 활성산소 무리들이 암세포의 necrosis 는 물론 최근에 거론되는 apoptosis 의 주요 인자일 가능성을 강하게 시사하고 있다. 암세포와 달리 normal lymphocytes에 있어서는 SD-994 를 가함에 따라 cytoplasm과 mitochondria분획의 SOD 활성의 증가가 17.
- ng/m! 에서 약 90%의 세포독성을 나타낸 반면 normal lymphocytes에 대해서는 약 5%의 약한牴 독성을 나타낸 것으로 보아 비교적 안전성이 큰 것으로 보였다.
- 암세포는 70—80% 사멸하고 반면에 normal lymphocytes 는 5%~20% 정도로 사멸하는 1 gg/m/~10 g/mZ의농도에서 GPx 활성은 SOD의 경우와 마찬가지로 두가지 세포종류간에 매우 뚜렷한 차이를 보였다. 우선 SOD의 경우에서 처럼 SD-994를 가하지 않은 control 그룹의 L1210암세포는 정상세포인 normal lympho- cytes에 비하여 GPxx의 활성이 극히 작았는데 이와같은 control 세포에서의 GPX의 활성은 SD-994를 1~10 ng/m血농도로 첨가했을 때 급격하게 변화하는 양상을 보였다. 즉 GPx활성이 극히 미약하였던 암세포가 SD-994의 첨가에 의하여 cytoplasm과 mito chondria 분획 모두 30~70배의 급격한 GPx활성증가를 나타내었으며 그 변화 정도는 顷oplasm의 경우가더욱 현저하였다.
- 83%의 생명연장 효과를 나타내었다. 이 결과로 부터 황해쑥의 메탄올추출액과 그 추출액으로 부터의 최정 정제물인 SD-994는 Sarcoma 180으로 발암된 mouse의 종양을 제거하지는 못하였어도 생명을 연장하는 효과가 비교적 높은 것으로 판단되었다.
- 1%의 세포독성을나타내었고 세포생존율은 거의 90%이상의 수치를 나타내었다. 이 물질들이 정상 lymphocytes에 대해서나타낸 세포독성은 2.7±1.2~14.3±2.8%로 암세포주에 대한 세포독성 보다는 훨씬 미약한 것을 알 수 있었으며 이 경우에도 세포생존율은 대부분 90% 이상의값을 나타내었다. 특히 I와 Vin화합물은 각각 77.
- 이상의 결과들을 종합하였을 때 황해쑥에는 다수의항암제가 함유되어 있을 뿐 아니라 최종 정제물인 SD-994는 L1210 세포에 대하여 우수한 세포독성을나타낸 반면 normal lymphocytes에 대해서는 미약한세포독성을 나타내어 안전성이 높을 것으로 판단되며, 이와 같은 암세포사멸 현상에는 활성산소인 6「의 생성은 물론 항산화효소인 SOD 와 GPx의 증폭된 활성증가가 수반 된 것을 보아 암세포사멸 기작에는 활성산소의 대사과정이 개입된 것으로 사료되었다.
- 이상의 결과와 연계하여 암세포사멸에 항산화 효소의 활성 변화가 수반됨을 알게 되었는데 항산화효소중에서 SOD와 GPx 이외 catalase 역시 H2O2S] 제거에 주요한 효소로서 세포내에서는 주로 peroxisome에 국한되어 있는 것으로 알려져 있는 효소이다. L1210 암세포가 사멸하는 과정에 SOd에 의해 생성된 H2O2< GPx이외 catalase도 분해하는지 검색하기 위하여 다음 실험으로 SD-994를 첨가함에 따라 변화하는 catalase 활성 변화를 측정하였다.
- 우선 SOD의 경우에서 처럼 SD-994를 가하지 않은 control 그룹의 L1210암세포는 정상세포인 normal lympho- cytes에 비하여 GPxx의 활성이 극히 작았는데 이와같은 control 세포에서의 GPX의 활성은 SD-994를 1~10 ng/m血농도로 첨가했을 때 급격하게 변화하는 양상을 보였다. 즉 GPx활성이 극히 미약하였던 암세포가 SD-994의 첨가에 의하여 cytoplasm과 mito chondria 분획 모두 30~70배의 급격한 GPx활성증가를 나타내었으며 그 변화 정도는 顷oplasm의 경우가더욱 현저하였다. 이러한 결과는 SD-994의 첨가에 의해 암세포내부에 GPx로 처리해야 할 HR?가 다량생성되었다는 것을 의미하는 것으로 볼 수 있다.
- 8%로 암세포주에 대한 세포독성 보다는 훨씬 미약한 것을 알 수 있었으며 이 경우에도 세포생존율은 대부분 90% 이상의값을 나타내었다. 특히 I와 Vin화합물은 각각 77.0+ 9.2%과 80, 7± 9.1%의 높은 세포독성에 비해 normal lymphocytes에 대해서는 9.2 + 2.1%와 14.3土2.8% 정도의 약한 세포독성을 나타내어 독성이 작으면서도상당히 우수한 항암 효과를. 지닌 성분으로 간주 할 수있었으므로 이중에서 I 화합물을 선택하여 SD-994로칭하고 작용기작의 검색을 활성산소 및 항산화효소와연계하여 추진하게 되었다.
- 그 결과를 Table V에 제시하였는데 무엇보다도 특이 한 것은 어느 실험 조건에서나 catalase 활성이 절대적으로 적어서 측정이 잘되지 않았다는 점이다. 효소의 양을 많이 사용하였을 때 흔적량의 흡광도 변화가 있는 것으로 추정해보아 미량의 cat涵se활성이 존재하기는 하나 그 양이 워낙 적은 것을 보아 peroxisome에 국한 되어 있는 catalase는 본실험계의 H20^ 분해에는 관여하지 않는 것으로 판단되었다. 그 뿐 아니라 SD-994를 첨가한 시료에서도 역시 효소활성은 거의 측정되지 않은 것으로 보아 L1210 암세포가 SD-994에 의해 사멸될 때。2가 생성되며 이 。2-의 분해를 위해서는 SOD와 GPx 두가지 효소활성이 크게 유발되는 것으로 판단되었다.
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