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문제 정의
- 이처럼 항산화 효과는 단일성분에 의한 직접적인 작용이라기 보다는 여러 성분들의 조화를 통한 정상화 효과에 의한 것이라는 보고17)들이 있으나, 인삼의 항산화 활성성분 및 그 기전에 대하여 현재까지 확실히 규명되어 있지 않아 보다 세부적으로 물 추출물, 알코올 추출물, 지용성 추출물, 총 사포닌, panaxadiol saponins(PD), panaxatriol saponins(PT) 등으로 홍삼을 분리 정제하여 구체적인 항산화 효과를 가져오는 성분이 무엇인지 알아보기 위하여 생쥐 간 조직으로부터 SOD, catalase등의 항산화 효소 활성과 malondialdehyde(MDA)의 함량 및 과산화수소 함량 변화 등을 비교하고, 홍삼의 항산화 활성 성분의 규명, 항산화 효소 등과 지질과산화와의 상호 관련성 그리고 항노화에 미치는 효과를 검토하고자 한다.
제안 방법
- . 100 ㎛ xylenol orange, 250 ㎛ ammonium fer-rous sulfate, 100 mM sorbitol, 25 mM H2SO4가 되도록 각각을 합한 용액을 FOX Ⅰ 시약으로 조제하고, 시료 50 ㎕에 FOX Ⅰ 시약 950 ㎕를 혼합한 후, 실온에서 30분 이상 방치한 다음, 원심분리 하여 응결된 물질을 제거하고, 560 nm에서 흡광도를 측정 하였으며, 과산화수소를 표준시 약으로 하였다.
- 측정하였다. 5 ㎛ xanthine, 20 ㎛ cytochrome c와 0.1 mM EDTA가 함유된 50 mM 인산완충액(pH 7.8)이 혼합된 반응액 2.9 m2에 희석시료 50 ㎕를 넣은후 50 ㎕의 xanthine oxidase를 가한 다음 25T에서 550 nm에서의 흡광도 증가속도를 측정하였으며, SOD 활성도는 위의 조건에서 cytochrome c의 환원속도를 50% 억제하는 효소의 양을 1 unit로 표시하였다.
- 각 홍삼 추출물의 항산화 작용을 screening하기 위하여 20-25 g의 ICR계 생쥐 5마리를 1군으로 하여 무처리군을 대조군으로 하고, 물 추출물 투여군, 알코올 추출물 투여군, 지용성 추출물 투여군, 총 사포닌 투여군, PD 투여군, PT 투여군 등 7가지로 분류하여 대조군에는 생리식염수를, 실험군에는 물 추출물, 알코올 추출물, 지용성 추출물, 총 사포닌, PD 및 PT 를 생리식염수에 녹여 50 ㎎/㎏/0.1 ml 용량으로 15일간 경구투여 한 후 실험하였다.
- 홍삼 사포닌의 항산화 작용을 나타내는 활성성분을 screen-ing하기 위하여 홍삼 추출물(물 추출물, 알코올 추출물, 지용성 분획, 총 사포닌, PD 및 PT)이 항산화 효소(SOD, catalase)의 활성도 변화와 H2O2 및 MDA의 함량 변화에 미치는 영향을 조사하였다.
- 홍삼 추출물을 15일간 경구 투여한 후 하루간 절식시킨 생쥐를 경구탈구 한 후, 간 조직을 적출 하여 차가운 생리식염수로 세척한 다음 무게를 달고 간 조직은 차가운 생리식염수에 넣고 세절하고 3회 수세하여 혈액을 제거한 후, sucrose/EDTA(0.25 M/1 mM) 용액을 넣고 마쇄기로 분쇄하여 10% 균질액을 만들었다. 이 균질액을 원심분리(20,000><g, 20분) 하고, 상등액을 시료로 하여, SOD, catalase 활성과 H2O2 및 지질 과산화(malondialdehyde; MDA), 단백질 함량 등의 측정 시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 실험 동물은 4주령의 ICR계 수컷 생쥐를 24±4℃, 12시간 명암주기의 사육실에서 상품화된 마우스용 사료와 물을 자의로 먹게 하였고, 일주일간 적응시킨 후 각 실험군으로 분류하여, 체중이 20-25 g의 생쥐만을 선별하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 시약은 sucrose, ethylendiamine tetraacetic acid(EDTA-2Na), xanthine monosodium salt, xanthine oxi-dase, cytochrome c, superoxide dismutase(SOD), hydrogen peroxide, sodium dodecyl sulfate(SDS), 1,1,3,3-tetrame- thoxy propanol, thiobabituric acid, pyridine, Fbline-cio-calteus phenol, potassium tartrate, bovine serum albumin, potas-sium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, xylenol orange, ammonium ferrous sulfate, butylated hydroxytoluene, sulfuric acid 등은 Sigma 제품을 사용하였고, Na2CO3, NaHCO3, methanol 및 기타 시약 등은 일반 특급시약을 사용하였다.
- 25 M/1 mM) 용액을 넣고 마쇄기로 분쇄하여 10% 균질액을 만들었다. 이 균질액을 원심분리(20,000><g, 20분) 하고, 상등액을 시료로 하여, SOD, catalase 활성과 H2O2 및 지질 과산화(malondialdehyde; MDA), 단백질 함량 등의 측정 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 의 방법에 따라 측정하였다. 또한 모든 실험 결과의 통계처리는 Sigma plot에 의한 student's t-test를 이용하여 상호 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- Catalase 활성도 측정은 Aebi19) 방법에 따라 측정하였다. 50 mM 인산 완충액(pH 7.
- Hydroperoxide 함량은 Simon20)의 방법을 사용하여 측정하였다. 100 ㎛ xylenol orange, 250 ㎛ ammonium fer-rous sulfate, 100 mM sorbitol, 25 mM H2SO4가 되도록 각각을 합한 용액을 FOX Ⅰ 시약으로 조제하고, 시료 50 ㎕에 FOX Ⅰ 시약 950 ㎕를 혼합한 후, 실온에서 30분 이상 방치한 다음, 원심분리 하여 응결된 물질을 제거하고, 560 nm에서 흡광도를 측정 하였으며, 과산화수소를 표준시 약으로 하였다.
- SOD활성은 Flohe와 Otting18)의 ferricytochrome-c 환원 방법으로 측정하였다. 5 ㎛ xanthine, 20 ㎛ cytochrome c와 0.
- 조직의 단백질 함량은 bovine serium albumin을 표준물질로 사용하여 Lowry22)의 방법에 따라 측정하였다. 또한 모든 실험 결과의 통계처리는 Sigma plot에 의한 student's t-test를 이용하여 상호 유의성을 검정하였다.
- 측정 시료의 지질과산화 수준은 지질의 과산화물인 MDA를 Ohkawa21)방법을 사용하여, thiobabituric acid(TBA)법에 의해 측정하였다. 간 조직의 10% 균질액 0.
성능/효과
- catalase 활성도는 지용성 추출물 투여군이 가장 높았고, 그 다음으로 총 사포닌, 알코올 추출물 투여군 순으로 조사되었다. 유리기에 의해 생성된 지질과산화의 최종산물인 MDA의 함량은 모든 추출물 투여군에서 유의성(p<0.
- 생쥐에 홍삼 추출물을 15일 동안 경구 투여한 후 간 조직에서 활성산소에 의하여 야기되는 세포막 지질과산화의 최종산물인 MDA 함량 변화를 조사한 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 물 추출물 투여군은 2.28%, 알코올 추출물 및 지용성 추출물 투여군은 각각 18.53%, 30.01%씩 감소함을 보였으며, 총 사포닌 투여군은 13.25%, PD 및 PT 투여군 역시 각각 15.92%, 11.26%씩 물 추출물을 제외한 모든 추출물에서 유의성(p<0.0l) 있게 감소함을 보였다.
- 생쥐에 홍삼 추출물을 15일 동안 경구 투여한 후 간 조직에서의 H2O2 함량을 조사한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이대조군(8.21±0.20 mM/g liver)에 비해 물 추출물 투여군은 8.18±0.20 mM/g liver(0.37%), 알코올 추출물 투여군 및 지용성 추출물 투여군은 각각 7.84±0.20 mM/g liver(4.51%; p<0.01), 7.98±0.24 mM/g liver(2.80%)a로 조사되었으며, 총 사포닌 투여군은 8.15±0.12 mM/g liver(0.73%), PD 투여군 및 PT 투여군 역시 각각 7.90±0.20 mM/g liver(3.78%; p<0.05), 7.69±0.25 mM/g liver(6.33%; p<0.01)으로 유의성 있게 감소하였다.
- 생쥐에 홍삼 추출물을 15일 동안 경구 투여한 후 간 조직에서의 SOD 활성도를 측정한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이대조군(57.98±4.99 U/mg protein)에 비해 물 추출물 투여군은59.83±5.48 U/mg protein(3.19%), 알코올 추출물 투여군 및 지용성 추출물 투여군은 각각 65.14±6.51 U/mg protein (12.35%; p<0.05), 74.03 + 4.95 U/mg protein(27.68%; p< 0.01)으로 조사되었으며, 총 사포닌 투여군은 61.07±2.22 U/mg protein(4.97%), PD 및 PT 투여군 역시 각각 64.31 ± 1.96 U/mg protein(10.54%; p<0.01), 61.95 ±3.03 U/mg protein(6.48%; p<0.05)으로 물 추출물 투여군과 총 사포닌 투여군을 제외한 모든 군에서 유의성 있게 증가함을 보였다.
- 생쥐에 홍삼 추출물을 15일 동안 경구 투여한 후 간 조직에서의 catalase 활성도 변화를 조사한 결과 Fig. 3에서 보는 바와 같이 생리식염수 투여군인 정상 대조군(56.39±7.49 U/mg protein)에 비해 물 추출물 투여군은 58.85±4.76 U/mg pro- tein(4.36%), 알코올 추출물 및 지용성 추출물 투여군은 각각 65.31±4.37 U/mg protein(15.82%; p<0.05), 69.19±3.13 U/ mg protein(22.70%; p <0.01)으로 조사되었으며, 총 사포닌 투여군은 67.26±7.55 U/mg protein(19.28%), PI) 및 PT 투여군 역시 각각 60.53±3.56 U/mg protein(7.34%), 60.47± 3.75 U/mg protein(7.24%)으로 조사되었다.
- catalase 활성도는 지용성 추출물 투여군이 가장 높았고, 그 다음으로 총 사포닌, 알코올 추출물 투여군 순으로 조사되었다. 유리기에 의해 생성된 지질과산화의 최종산물인 MDA의 함량은 모든 추출물 투여군에서 유의성(p<0.01) 있게 감소하였으며, 그 중에서도 지용성 추출물, 알코올 추출물, PD 투여군 순으로 가장 많이 감소하였다.
- 이러한 결과로 종합하여 볼 때 H2O2의 함량 변화는 SOD 활성도의 활성 증가로 인하여 catalase의 유도가 증가함으로서 과산화수소의 함량이 유의성 있게 감소되었다고 생각된다.
- 이러한 결과를 종합하여 볼 때 활성산소에 의해서 생성된 지질 과산화의 최종산물인 MDA 함량 변화는 SOD, catalase 등의 항산화 효소의 활성도가 증가함에 따라 유의성(p<0.01) 있게 감소됨을 볼 수 있었으며, 사포닌 중에서 특히 PD의 경우가 항산화 효과가 가장 좋은 것으로 조사되었다. 따라서 앞으로 PD계 사포닌과 PT계 사포닌에 대하여 폭 넓게 연구가 진행되어야 될 것으로 생각된다.
- 이런 결과를 종합하여 볼 때 PT보다는 PD가 보다 더 catalase의 활성도 증진에 기여함을 볼 수 있고, PD 분획물 중에서 Rb2가 더 특이적으로 활성도를 높일 것으로 생각된다.
- 한편 홍삼 사포닌 투여군에서의 상호 유의성 관계를 알아보기 위해서 총 사포닌 투여군을 대조군으로 PD 및 PT 투여군의 상호 유의성 관계를 조사한 결과 PD, PT 투여군 모두 상호 유의성이 없는 것으로 조사되었다.
- 한편 홍삼 사포닌 투여군에서의 상호 유의성 관계를 알아보기 위해서 총 사포닌 투여군을 대조군으로 PD 및 PT 투여군의 상호 유의성 관계를 조사한 결과 PD, PT 투여군 모두 상호 유의성이 없는 것으로 조사되었다.
- 한편 홍삼 사포닌 투여군에서의 상호 유의성 관계를 알아보기 위해서 총 사포닌 투여군을 대조군으로 하여 PD 및 PT 투여군의 상호 유의성을 조사한 결과 PD(p<0.05) 및 PT 투여군(p<0.01)에서 유의성 있게 감소하였으며, PD와 PT 투여군 사이의 상호 유의성은 없는 것으로 조사되었다.
- 한편 홍삼 사포닌 투여군에서의 상호 유의성 관계를 알아보기 위해서 총 사포닌 투여군을 대조군으로 하여 PD와 PT 상관관계를 조사한 결과 PD 투여군 만이 유의성(p<0.01) 있는 증가를 보였다.
- 항산화 효소인 SOD의 활성도를 조사해 본 결과 지용성 추출물, PD, 알코올 추출물 투여군 순으로 활성도를 높이는 것으로 조사되었으며, SOD에 의한 중간 생성물인 H2O2의 함량을 조사한 결과 모든 추출물 투여군에서 감소하였으며, 그 중에서도 PT 알코올 추출물 및 PD 투여군이 유의성 있게 감소하였다. catalase 활성도는 지용성 추출물 투여군이 가장 높았고, 그 다음으로 총 사포닌, 알코올 추출물 투여군 순으로 조사되었다.
후속연구
- 01) 있게 감소됨을 볼 수 있었으며, 사포닌 중에서 특히 PD의 경우가 항산화 효과가 가장 좋은 것으로 조사되었다. 따라서 앞으로 PD계 사포닌과 PT계 사포닌에 대하여 폭 넓게 연구가 진행되어야 될 것으로 생각된다.
- 이러한 결과를 종합하여 볼 때 PD성분이 SOD의 활성도를 가장 유의성 있게 증가시키는 것으로 생각되며 그 중에서도 ginsenoside Rb2 성분이 가장 활성을 띠는 성분으로 생각되고, 계속적인 실험이 수행되어져야 한다고 생각된다.
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