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문제 정의
- 본다. 따라서 본 연구에서는 생쥐에 물 추출물, 알코올 추출물, 지용성 추출물, 총 사포닌 panaxadiol, panaxatriol을 투여했을 때 간의 지질과산화 수준과 GSH, GSSG의 함량 및 GPX의 활성도에 미치는 영향을 검토하여 지질과산화와의 상호 관련성, 항산화 효소 활성 성분의 규명에 있어서 부가적인 자료를 제시하고자 한다.
제안 방법
- 5) 용액 700 μl, 6 mM DTNB용액 100 μl와 200 B의 측정 시료를 혼합한 반응액을 30℃로 조절되는 thermostatted cuvette holder에서 4분간 안정화시킨 다음 412 nm에서 흡광도 변화를 1분간 측정하였다. GSSG의 정량은 GSH를 제거하기 위해 측정시료와 2-vinyIpyridine(2-VPW 혼합(50 :1, v:v)하여 60분간 방치한 다음 total GSH와 동일한 조건에서 단지 GR(200 kU/D 용액을 20 W로 증가하여 반응시켜 흡광도의 변화를 측정하였다. GSH의 함량은 다음 식에 의하여 계산하였다.
- 각 홍삼 추출물의 항산화 작용을 알아보기 위하여 25-30 g의 ICR계 생쥐 5마리를 1군으로 하여 무처리군을 대조군으로 하고 물 추출물 투여군, 알코올 추출물 투여군, 지용성 추출물 투여군, 총 사포닌 투여군, PD 투여군, PT 투여군 등 7가지로 분류하여 대조군에는 생리식염수를, 실험군에는 각 홍삼 추출물을 생리식염수에 녹여 50 mgkg/0.1 m/ 용량으로 15일간 경구투여 한 후 실험하였다.
- 작용으로의 소.무- 이외에도 acetaldehyde와 GSH 결합, GSH의 간내 합성의 저해, 담즙으로의 배설 증가, 혈액으로의 유출증가3)등을 제시하였다.
- 5 mM H2O2용액 B를 가한 후 위와 같은 조건에서 5 분간 흡광도 감소를 측정하였다. 비효소적 반응은 위와 동일한 조건으로 측정 시료 대신에 인산 완충액을 넣고 흡광도 변화를 측정하였으며, 단위는 분당 산화된 NADPH 1 μmol를 1 unit의 효소 활성으로 하였다.
- lmZ 용량으로 4주령 수컷.생쥐에게 15일간 경구투여 하여 생쥐 간으로부터 항산화 효소(GPX)의 활성도 변화와 GSH, GSSG 및 MDA의 함량 변화에 미치는 영향을 조사하였다. GPX의 활성도는 PD, PT TS 순으로 활성도가 높은 것으로 조사되었으며, 항산화 물질인 환원형 GSH 또한 같은 순으로 증가하는 것으로 조사되었다.
- 25 M/1 mM) 냉용액을 넣고 마쇄기 (glass teflon homogenizer)로 분쇄하여 10% 균질액을 만들었다. 이 균질액을 원심분리 (20, 000Xg, 20분)하여 상등액을 시료로 하여 GPX의 활성과 읺utathione 함량 및 지질과산화(mal- ondialdehyde; MDA), 단백질 함량 측정 시료로 사용하였다.
- GPX 활성은 Flohe13) 등의 방법으로 측정하였다. 즉 1 mM EDTA가 함유된 0.1 M 인산완충액 (pH 7.0) 500μl에 100 B의 측정시료, 2.4 U GR 100 B와 10 mM GSH(환원형) 100B를 넣고 전체 반응액에서 농도가 1mM이 되도록 NaNa을 첨가한 후 37℃에서 10 분간 incubation한 다음 파장 340 nm에서 3분 동안 NADPH의 농도 변화를 측정하며, 전체 반응은 위 반응액에 1.5 mM H2O2용액 B를 가한 후 위와 같은 조건에서 5 분간 흡광도 감소를 측정하였다. 비효소적 반응은 위와 동일한 조건으로 측정 시료 대신에 인산 완충액을 넣고 흡광도 변화를 측정하였으며, 단위는 분당 산화된 NADPH 1 μmol를 1 unit의 효소 활성으로 하였다.
- 홍삼 추출물을 15일간 경구투여 한 후 24시간 절식시킨 실험 동물을 경추탈구 한 후, 간 조직을 적출하고, 간 조직의 일부분을 취하여 세 번 생리적 식염수로 세척하여 혈액을 제거한 다음, sucrose/EDTA(0.25 M/1 mM) 냉용액을 넣고 마쇄기 (glass teflon homogenizer)로 분쇄하여 10% 균질액을 만들었다. 이 균질액을 원심분리 (20, 000Xg, 20분)하여 상등액을 시료로 하여 GPX의 활성과 읺utathione 함량 및 지질과산화(mal- ondialdehyde; MDA), 단백질 함량 측정 시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 실험 동물은 녹십자(주) 지정사육소인 경남축산에서 분양받은 4 주령의 수컷 생쥐를 실험동물용 사료로 7 일간 사육시킨 후, 실온이 20~25℃, 습도 50-60%, 12 시간 명암주기의 사육 조건에서 사료와 물을 자의로 먹게 하여, 체중이 25~30g인 생쥐를 사용하였다. 실험에 사용한 시약은 su- crouse, potassium phosphate, 1, 1, 3, 3-tetramethoxy propane, acetic acid, n-butanol, pyridine, sodium dodecyl sulfate (SDS), thiobarbituric acid(TBA), hydrogen peroxide, NADPH - tetrasodium salt, 5, 5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid), glutathione reductase(GR), GSH(reducedglutathione), sodium cabonate, sodium phosphate, t-butyl hydroperoxide, pota ssium tartrate, bovine serum albumin(BSA), Folin-ciocal- teus phenol reagent 등의 시약은 Sigma사의 제품을 사용하였고, 기타 ethyl ether를 비롯한 일반 시약은 특급을 사용하였다.
- 생쥐를 사용하였다. 실험에 사용한 시약은 su- crouse, potassium phosphate, 1, 1, 3, 3-tetramethoxy propane, acetic acid, n-butanol, pyridine, sodium dodecyl sulfate (SDS), thiobarbituric acid(TBA), hydrogen peroxide, NADPH - tetrasodium salt, 5, 5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid), glutathione reductase(GR), GSH(reducedglutathione), sodium cabonate, sodium phosphate, t-butyl hydroperoxide, pota ssium tartrate, bovine serum albumin(BSA), Folin-ciocal- teus phenol reagent 등의 시약은 Sigma사의 제품을 사용하였고, 기타 ethyl ether를 비롯한 일반 시약은 특급을 사용하였다.
- 홍삼 사포닌 성분은 한국 인삼연초연구원으로부터 제공받아 사용하였다.
- 홍삼의 물 추출물, 알코올 추출물, 지용성 추출물, 총 사포닌, PD 및 PT 각 홍삼 추출물을 생리식염수에 녹여 50 m^O.lmZ 용량으로 4주령 수컷.생쥐에게 15일간 경구투여 하여 생쥐 간으로부터 항산화 효소(GPX)의 활성도 변화와 GSH, GSSG 및 MDA의 함량 변화에 미치는 영향을 조사하였다.
데이터처리
- 방법에 따라 측정하였다. 또한 모든 실험결과의 통계처리는 Sigma plot에 의한 student's t-test> 이용하여 상호유의성을 검정하였다.
이론/모형
- GPX 활성은 Flohe13) 등의 방법으로 측정하였다. 즉 1 mM EDTA가 함유된 0.
- 간 조직에서의 total glutathione(GSH+2GSSG)와 GSSG 함량은 Tietze의 방법을 변형한 Griffith^)의 방법에 의해 측정하였다. Total glutathione의 정량은 0.
- 조직의 단백질량은 BSA을 표준물질로 사용하여 Lowrys 등의 방법에 따라 측정하였다. 또한 모든 실험결과의 통계처리는 Sigma plot에 의한 student's t-test> 이용하여 상호유의성을 검정하였다.
- 측정 시료의 지질과산화 수준은 지질과산화물인 MDA를 Ohkawa15)방법을 사용하여, TBA법에 의해 측정하였다. 간 조직액의 10% 균질액 0.
성능/효과
- 생쥐에게 15일간 경구투여 하여 생쥐 간으로부터 항산화 효소(GPX)의 활성도 변화와 GSH, GSSG 및 MDA의 함량 변화에 미치는 영향을 조사하였다. GPX의 활성도는 PD, PT TS 순으로 활성도가 높은 것으로 조사되었으며, 항산화 물질인 환원형 GSH 또한 같은 순으로 증가하는 것으로 조사되었다. 한편 GSSG 함량은 지용성 추출물, PD, 알코올 추출물 순으로 감소하는 것으로 조사되었다.
- GSSG/total GSH 비율의 변화를 조사한 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 GSSG/total GSH의 비율 변화는 대조군에 비해 물 추출물 투여군은 11.57% 감소하였으며, 알코올 추출물 투여군은 22.08%, 지용성 분획물은 31.17%, 총 사포닌 투여군은 27.11%, PD 및 PT 투여군 또한 33.20%, 27.22% 로 모두 유의성 (p<0.01) 있게 감소하였다.
- 한편 GSSG 함량은 지용성 추출물, PD, 알코올 추출물 순으로 감소하는 것으로 조사되었다. 동물조직세포내의 산화환원반응과 해독작용상태의 평가에 중요한 GSSG/total GSH 비율은 지용성 추출물, PD, 총 사포닌 순으로 감소하는 것으로 조사되었다. 활성 산소에 의해 생성된 지질과산화의 최종산물인 MDA의 함량은 GSSG/total GSH 비율의 조사 결과와 비슷한 경향을 보였다.
- 생쥐 간 조직에서 GSH의 함량 변화를 조사한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 환원형 GSH의 함량 변화는 생리적식염수를 투여한 대조군에 비해 물 추출물 투여군은 17.13% 로 증가한 반면, 알코올 추출물 투여군 19.61%, 지용성 분획물 투여군은 32.04%, 총 사포닌 투여군은 55.85%, PD 및 PT 투여군 또한 45.48%, 37.46%로 모두 유의성(p<0.01) 있게 증가하였다.
- 생쥐에 홍삼 추출물을 15일 동안 경구 투여한 후 간 조직에서의 GPX의 활성도를 조사한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 물 추출물 투여군은 0.95% 증가한 반면, 알코올 추출물 투여군은 5.23%, 지용성 추출물 투여군은 6.66%, 총 사포닌 투여군은 17.31%이었으며, PD 및 PT 투여군 또한 각각 31.73%, 25.96%으로 모두 유의성 (p<0.01) 있게 증가하였다.
- 생쥐에 홍삼 추출물을 경구 투여한 후 간 조직에서 지질 과산화의 최종 산물인 MDA 함량 변화를 조사한 결과 Fig. 5 에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 물 추출물 투여군은 7.13%, 알코올 추출물 투여군은 14.92%, 지용성 분획물 투여군은 19.16%, 총 사포닌 투여군은 13.25%, PD 및 PT 또한 각각 15.92%, 11.26%으로 물 추출물 투여군을 제외한 모든 군에서 유의성(pcO.Ol) 있게 감소하였다.
- 생쥐의 간 조직에서 GSSG의 함량 변화를 조사한 결과 Fig. 3에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 물 추출물 투여군은 1.92%, 알코올 추출물 투여군은 11.54%, 지용성 분획물 투여군은 17.31%, 총 사포닌 투여군은 53.54%, PD 및 PT 또한 24.41%, 37.80%로 모두 유의성 (p<0.01) 있게 감소하였다.
- 이러한 결과들을 종합하여 볼 때 GSSG/total GSH 비율의 유의성 (P<0.01) 있는 감소는 GSH의 생성촉진, GPX의 활성증대로 생성된 GSSG가 담즙이나 혈액으로 배출되거나, GR 에 의해서 GSSG가 환원되어진 결과라고 생각된다.
- 이러한 결과를 종합하여 볼 때 Fig. 6, 7에서 보는 바와 같이 활성산소에 의해서 생성된 지질과산화의 최종산물인 MDA의 함량 변화는 GPX의 항산화 효소와 항산화 물질인 GSH의 산화 환원 비율에 따라 유의성(pvO.Ol) 있게 감소됨을 볼 수 있었으며, 특히 지용성 분획물의 경우가 가장 좋았으며 PD, 총 사포닌 순으로 조사되었다. 따라서 앞으로 PD계 사포닌에 대하여 M 폭 넓게 연구가 진행되어야 될 것으로 생각된다.
- 이런 결과를 종합하여 볼 때 홍삼 추출물의 각 성분이 GSH의 생성촉진, GSH의 산화억제, GSH biosynthesis의 첫 단계에서 요구되어지는 y-이utamylcysteine synthetase 효소의 활성화 증대 및 peroxide, 화학물질의 체내 유입에 따른 해독작용에 사용되어진 GSH가 glutathione reductase에 의해 다시 GSH로 원활한 환원이 되어진 결과로 생각된다.
- 활성 산소에 의해 생성된 지질과산화의 최종산물인 MDA의 함량은 GSSG/total GSH 비율의 조사 결과와 비슷한 경향을 보였다. 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때 항산화 효소 활성과 항산화 물질 활성 증대를 강화시키는 홍삼 '성분으로는 지용성 추출물, PD 및 총 사포닌인 것으로 조사되었으며, 이러한 성분들이 산화적 손상에 대한 방어기전 향상에 좋은 것으로 생각된다.
- GPX의 활성도는 PD, PT TS 순으로 활성도가 높은 것으로 조사되었으며, 항산화 물질인 환원형 GSH 또한 같은 순으로 증가하는 것으로 조사되었다. 한편 GSSG 함량은 지용성 추출물, PD, 알코올 추출물 순으로 감소하는 것으로 조사되었다. 동물조직세포내의 산화환원반응과 해독작용상태의 평가에 중요한 GSSG/total GSH 비율은 지용성 추출물, PD, 총 사포닌 순으로 감소하는 것으로 조사되었다.
- 한편 총 사포닌을 대조군으로 홍삼 사포닌의 상호 유의 성관계를 조사한 결과 PD, PT 모두 유의성 (pv 0.01) 있게 증가하였으며, 그 중에서도 PD가 PT보다 5.77% 높게 증가함을 보였다.
- 한편 홍삼 사포닌의 상호 유의성 관계를 알아보기 위해서 총 사포닌을 대조군으로 하여 PD, PT의 상관관계를 조사한 결과 PD, PT 모두 유의한 차이는 없었다.
- 한편 홍삼 사포닌의 상호 유의성 관계를 알아보기 위해서 총 사포닌을 대조군으로 하여 PD, PT의 상관관계를 조사한 결과, PD에서만 유의성 (p<0.01) 있게 감소함을 보였다.
- 한편 홍삼 사포닌의 상호 유의성 관계를 총 사포닌을 대조군으로 조사한 결과 PD, PT 투여군 모두 유의성 (pcO.Ol) 있게 증가하였다.
후속연구
- 그러나 이와 같은 홍삼 성분에 대한 항산화 물질의 활성은 투여량이나 홍삼 추출물의 종류에 따라 달라지는 것으로 알려져 있고, 항산화기전 연구에 대해서도 확실하게 알려져 있지 않은 실정이므로, 여러 종류의 홍삼 추출물 성분에 대한 활성검색과 아울러 작용기전에 대한 연구가 있어야 한다고 본다. 따라서 본 연구에서는 생쥐에 물 추출물, 알코올 추출물, 지용성 추출물, 총 사포닌 panaxadiol, panaxatriol을 투여했을 때 간의 지질과산화 수준과 GSH, GSSG의 함량 및 GPX의 활성도에 미치는 영향을 검토하여 지질과산화와의 상호 관련성, 항산화 효소 활성 성분의 규명에 있어서 부가적인 자료를 제시하고자 한다.
- Ol) 있게 감소됨을 볼 수 있었으며, 특히 지용성 분획물의 경우가 가장 좋았으며 PD, 총 사포닌 순으로 조사되었다. 따라서 앞으로 PD계 사포닌에 대하여 M 폭 넓게 연구가 진행되어야 될 것으로 생각된다.
- 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때 대조군에 비해 홍삼 추출물 투여군의 GSSG 함량이 감소한 것은 담즙이나 혈액으로 유출되었거나 glutathione redutase에 의해 GSSG가 GSH로 환원되었기 때문으로 생각되며, 차후에 이러한 항산화 물질의 기전에 대해서 좀더 상세히 연구할 필요성이 제기된다.
- 지금까지 조사된 결과를 종합하여 볼 때 GPX의 활성도를 모든 홍삼 추출물이 증가를 시키지만 그 중에서도 가장 유효한 성분으로는 PD인 것으로 생각되며, PD에 대한 자세한 분리 정제를 하여 PD분획물중에서 어느 성분이 GPX의 활성화를 나타내는지 계속적인 연구가 필요할 것이라 생각된다.
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