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문제 정의
- 따라서 본 실험은 날로 그 소비가 증가하는 대표적 샐러드용 채소인 상추에 저온관련 유전자인 BNH5 gene을 도입하여 저온에 내성을 가지는 상추를 선발하고자 하였다.
제안 방법
- 1993). Cloning된 유전자는 binary vector (An 1987)인 pBinl9에 재조합하여 disarmed Ti-plasmid를 가지는 A. tumefaciens GV 31()1 에 도입하였으며. 이를 실험에 사용하였다.
- 식물체 DNA 추출은 식물체의 잎을 이용하여 Edwards 등 (1991)의 방법에 따라 수행하였으며, 먼저 표지유전자인 nptD gene을 확인하고자 500 bp의 PCR 산물을 증폭하는 5'-GTGGAGAGGC TATTCGGCTA - 3, 과 5' - CCACCATG ATATTCGGCAAG -3' primer를 제작하여 수행하였다. PCR 반응은 Perkin Elmer PCR 기기를 사용하였으며, 반응조건은 96℃에서 3분간 pre-denaturation 반응을 거친 후 96℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 1분간 반응을 36회 반복하였으며, 최종 72℃에서 15분간 신장반응을 실시하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 생성된 PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동 후 EtBr염색을 하여 UV하에서 확인하였다.
- 한편, 선발된 shoot들은 PCR 반응을 이용하여 도입유전자의 삽입여부를 확인하였다. PCR 반응은 표지유전자인 nptU 와 저온관련 유전자인 BN115 및 식물에 도입되지 않는 v;'r G 유전자를 각각 특이적으로 증폭하는 primer를 가지고 실시하였다. PCR 반응 결과 대조구로 쓰인 정상 상추식물체에서는 nptll 와 BN115 유전자의 증폭을 볼 수 없는 반면에 형질전환체에서는 두 유전자 모두 PCR 증폭산물을 확인할 수 있었다 또한 확인된 식물체의 DNA에서는 vir G 유전자가 발견되지 않아 이는 Agrobacterium의 혼입에 의한 결과가 아님을 다시 한번 증명하였다.
- PCR 반응은 Perkin Elmer PCR 기기를 사용하였으며, 반응조건은 96℃에서 3분간 pre-denaturation 반응을 거친 후 96℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 1분간 반응을 36회 반복하였으며, 최종 72℃에서 15분간 신장반응을 실시하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 생성된 PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동 후 EtBr염색을 하여 UV하에서 확인하였다. 한편, PCR 반응 시 Agrobacterinn의 오염에 의한 일어날 수 있는 잘못된 밴드생성을 확인하기 위해 식물형질전환시 식물체내에 도입되지 않는 vir G 유전자를 증폭하여 965 bp의 PCR 산물을 만드는 5, - TTATCTGAGTGAAGTCGTCTCAGG - 3, 과 5, - CGTCGCCTGAGATTAAGTGTC - 3' primer를 제조하여 오염여부를 검증하고자 하였다.
- 공동배양은 대수증식기까지 증식시킨 Agrobacterium 배양액을 멸균수로 10배 희석하여 잎절편체와 5분 정도 접종하고 멸균여지를 이용하여 건조시킨 후 공동배양배지 (MS salt + 0.1 mg/L NAA + 0.5 mg/L kinetin) 에서 2일간 암배양하였다. 본 실험에 사용된 공시균주는 표지유전자로써 kanamycin 저항성을 가지므로 형질전환체의 선발은 MS기본 배지에 100mg/L kanamycin과 균의 제거를 위해 500 mg/L car- benicillin을 첨가한 재분화용 선발배지에서 4~6주간 실시하였다.
- 항생제 선발조건은 잎절편을 항생제 kanamycin 이 농도별 (0, 25, 50, 75, 100mg/L)로 첨가된 재분화배지에 치상 후 4주가 되는 시기에 생존여 부를 조사하였는데 , 25 mg/L kanamycin 농도에서부터 절편체가 고사되었다. 따라서 25 mg/L kanamycin 농도를 선발조건으로 할 수 있으나 보다 강력히 발현되는 형질전환체를 선발하고자 100 mg/L kanamycin 농도를 선발조건으로 하여 kanamycin에 저항성을 가지는 shoot를 선발하였다 (Figure 2). 한편, 공동배양한 잎절편체를 선발배지에 치상한후 4주부터 형질전환체로 추정되는 shoot들이 kanamycin 첨가 배지에서 잎절편체의 절단면에서부터 신초를 유기하며 재분화되기 시작하였으며 (Figure 2A), 이러한 신초는 곧바로 항생제가 첨가된 발근배지로 옮겨져 발근을 유도하였다(Figure 2B).
- 따라서 본 실험에서는 Agrobacterium^\ Ti-plasmid 내에는 존재하지만 식물체 내로 전이되지 않는 유전자인 vir G 유전자를 증폭하여 965 bp의 PCR 산물을 만들도록 제조된 primer를 사용하여 npt II gene이 확인된 식물체를 가지고 PCR 반응을 재 실시하였다. 이 primer를 이용하여 PCR 반응을 실시한다면 Agrobacterium이 식물체 내에 존재하여 DNA추출과정에서 섞이게 되었는지를 판단할 수 있을 것이다.
- 5 mg/L kinetin 첨가배지에서 왕성한 신초의 생성을 볼 수 있었으며, 특히 생성된 신초는 정상적인 형태를 보였으며 뿌리의 생성도 양호하여 정상적으로 성장하였다. 따라서 상추의 재분화 조건을 NAA 0.1 mg/L와 kinetin 0.5 mg/L으로 확립하였으며, 본 실험에서 공동배양배지와 선발배지의 재분화 조건으로써 이용하였다 (Figure 1).
- 증폭밴드를 확인 할 수 있었다 (Figure 4A). 또한 이러한 454 bp의 PCR 산물이 진정 형질전환시 사용한 binary vector 내에 있는 BN115 유전자의 일부분인지를 증명하기 위해 PCR 산물을 전기영동한 후 이를 nylon membrane으로 옮기고 DIG으로 labelling된 BN115 probe를 이용하여 Southern analysis를 실시하였다. 그 결과 형질전환이 확인된 식물체에서 나타난 PCR 밴드와 동일한 위치에서 밴드의 형성을 확인 할 수 있었다 (Figure 4B).
- RT/PCR Kit I을 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 반응조건은 먼저 cDNA합성을 위해 42℃에서 30분간 반응한 후 96℃ 3분, 55℃ 분, 72℃ 3분간 1 cycle을 수행하고 96℃ 30초 55℃ 30초, 72℃ 1 분간 40 cycle 후 72℃에서 15분 수행하였다.
- 처리된 종자는 멸균수로 3~5번 수세하여 무기염류농도가 1/2로 조절된 MS배지에 (1/2 MS) 호르몬이 무첨가된 고체배지에 치상하였다. 발아는 광조건에서 실시하였고 16시간 일장, 광도 40 PPF (pmol . m'2 . sec-1), 온도 25±2℃, 습도 70%의 생장상에서 모든 배양을 실시하였다. 절편체는 발아 후 본엽이 2~3매 전개된 시기의 잎절편을 1.
- 5 mg/L kinetin) 에서 2일간 암배양하였다. 본 실험에 사용된 공시균주는 표지유전자로써 kanamycin 저항성을 가지므로 형질전환체의 선발은 MS기본 배지에 100mg/L kanamycin과 균의 제거를 위해 500 mg/L car- benicillin을 첨가한 재분화용 선발배지에서 4~6주간 실시하였다. 선발배지에서 살아남은 신초는 1/2 MS, 100 mg/L kanamycin과 250 mg/L carbenicillin이 첨가된 rooting 배지로 계대하여 완전한 식물체로 재분화시켰으며, 이후 이를 이용하여 형질전환체의 특성검정을 실시하였다.
- 본 실험은 저온관련 유전자인 BN115 유전자를 겨울상추인 청치마 품종에 도입하였으며, 유전자의 도입과 발현여부는 PCR과 Southern analysis 그리고 RT-PCR analysis를 이용하여 확인하였다. 그러나 이렇게 도입된 저온 유도성 유전자인 8N115 gene이 형질전환체에 어느 정도의 내한성을 부여하는지는 계속적으로 연구되어져야 할 것으로 사료된다.
- 이렇게 선발표지유전 자의 도입이 확인된 식물체에서 저온관련 유전자인 BN115 유전자의 형질전환 여부를 확인하고자 5'-TCATGGCTATGTCACTCTCAGG - 3' 과 5'- CTAGGAGTTAAGT GGTTGAAGC-3'BN115 primer를 제작하여 상기 조건과 동일한 조건에서 PCR 반응을 실시하여 454 bp의 BN115 유전자의 PCR 산물을 확인하였다. 부가적으로 이렇게 확인된 PCR 산물이 도입하고자 하는 binary vector°1 pBin/BM/5 gene인지를 확인 하고자 PCR DIG labelling mix kit (Boehringer Mannheim)를 이용하여 BN115 gene의 probe 를 제조하고 이를 이용하여 Southern analysis를 실시하였으며, 도입된 유전자의 발현여부를 확인하기 위해 plant total RNA miniprep system (VIOGENE) 을 이용하여 대조식물체와 형질전환체의 total RNA를 추출한 후 (주) Bioneer의 PreMixTM.RT/PCR Kit I을 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 반응조건은 먼저 cDNA합성을 위해 42℃에서 30분간 반응한 후 96℃ 3분, 55℃ 분, 72℃ 3분간 1 cycle을 수행하고 96℃ 30초 55℃ 30초, 72℃ 1 분간 40 cycle 후 72℃에서 15분 수행하였다.
- 상추 (Lactuca sativa L. cv. Green Skirt. 청치마) 종자를 70% ethanol로 30초간 처리한 뒤 1% NaOCl에 Tween 20을 넣고 15분간 표면살균하였다. 처리된 종자는 멸균수로 3~5번 수세하여 무기염류농도가 1/2로 조절된 MS배지에 (1/2 MS) 호르몬이 무첨가된 고체배지에 치상하였다.
- 상추 잎절편에서의 식물체 재분화를 위하여 NAA (0.1mg/L)와 BA (0.25-2 mg/L), kinetin (0.25-2 mg/L)을 혼용 처리한 MS기본배지에 상추 잎절편체를 치상하여 상기 조건에서 배양하며 재분화 조건을 조사하였다. 절편체는 상추본엽을 직경 1.
- 방법으로 형질전환 시켰다. 상추의 잎절편을 Agrobacterium과공동배양 후 MS 기본배지에 100 mg/L kanamycin, 500 mg/L carbenicillin, 0.1 mg/L NAA, 0.5mg/L kinetin을 첨가한 선발배지에 치상하였는데, 치상 후 3~4주부터 절편체로부터 multiple shoot들이 생성되기 시작하였다. 선발배지에서 살아남은 선발체들은 1/2 MS배지에 100 mg/L kanamycin, 250 mg/L carbenicillin이 첨가된 발근배지로 옮겨졌다.
- 상추의 잎조직을 이용한 재분화 조건을 확립하기 위해 MS기본 배지에 NAA 0.1 mg/L 와 kinetin (0.25, 0.5, 1, 2 mg/L) 그리고 BA (0.25, 0.5, 1, 2 mg/L)를 농도별로 혼용처리한 배지에 잎절편을 치상하여 조사한 결과 치상 후 7일부터 조직이 비대되며 절단면에서부터 캘러스의 생성을 관찰할 수 있었으며, 3주 후부터는 신초의 재분화가 이루어졌다. 한편, BA 첨가구에서는 복수의 신초 (multiple shoot)가 유도되는 경향을 보였으며, 생성된 shoot는 유리화되는 현상을 보였으며, BA의 농도가 높아질수록 조직이 캘러스화되어 재분화가 어려운 경향을 보였다 (결과 미제시).
- 본 실험에 사용된 공시균주는 표지유전자로써 kanamycin 저항성을 가지므로 형질전환체의 선발은 MS기본 배지에 100mg/L kanamycin과 균의 제거를 위해 500 mg/L car- benicillin을 첨가한 재분화용 선발배지에서 4~6주간 실시하였다. 선발배지에서 살아남은 신초는 1/2 MS, 100 mg/L kanamycin과 250 mg/L carbenicillin이 첨가된 rooting 배지로 계대하여 완전한 식물체로 재분화시켰으며, 이후 이를 이용하여 형질전환체의 특성검정을 실시하였다.
- 또한. 이렇게 선발표지유전 자의 도입이 확인된 식물체에서 저온관련 유전자인 BN115 유전자의 형질전환 여부를 확인하고자 5'-TCATGGCTATGTCACTCTCAGG - 3' 과 5'- CTAGGAGTTAAGT GGTTGAAGC-3'BN115 primer를 제작하여 상기 조건과 동일한 조건에서 PCR 반응을 실시하여 454 bp의 BN115 유전자의 PCR 산물을 확인하였다. 부가적으로 이렇게 확인된 PCR 산물이 도입하고자 하는 binary vector°1 pBin/BM/5 gene인지를 확인 하고자 PCR DIG labelling mix kit (Boehringer Mannheim)를 이용하여 BN115 gene의 probe 를 제조하고 이를 이용하여 Southern analysis를 실시하였으며, 도입된 유전자의 발현여부를 확인하기 위해 plant total RNA miniprep system (VIOGENE) 을 이용하여 대조식물체와 형질전환체의 total RNA를 추출한 후 (주) Bioneer의 PreMixTM.
- 저온관련 유전자인 BN115 gene과 표지유전자인 npt Ⅱ gene을 함유하고 있는 Agrobacterium tumifacience GV 3101균주를 이용하여 겨울상추품종인 청치마의 잎절편과 공동배양하는 방법으로 형질전환 시켰다. 상추의 잎절편을 Agrobacterium과공동배양 후 MS 기본배지에 100 mg/L kanamycin, 500 mg/L carbenicillin, 0.
- 25-2 mg/L)을 혼용 처리한 MS기본배지에 상추 잎절편체를 치상하여 상기 조건에서 배양하며 재분화 조건을 조사하였다. 절편체는 상추본엽을 직경 1.5 cm 크기로 절단하여 치상 후 4주 동안 신초의 생성을 관찰, 조사하였다.
- 청치마) 종자를 70% ethanol로 30초간 처리한 뒤 1% NaOCl에 Tween 20을 넣고 15분간 표면살균하였다. 처리된 종자는 멸균수로 3~5번 수세하여 무기염류농도가 1/2로 조절된 MS배지에 (1/2 MS) 호르몬이 무첨가된 고체배지에 치상하였다. 발아는 광조건에서 실시하였고 16시간 일장, 광도 40 PPF (pmol .
- PCR 반응이 끝난 뒤 생성된 PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동 후 EtBr염색을 하여 UV하에서 확인하였다. 한편, PCR 반응 시 Agrobacterinn의 오염에 의한 일어날 수 있는 잘못된 밴드생성을 확인하기 위해 식물형질전환시 식물체내에 도입되지 않는 vir G 유전자를 증폭하여 965 bp의 PCR 산물을 만드는 5, - TTATCTGAGTGAAGTCGTCTCAGG - 3, 과 5, - CGTCGCCTGAGATTAAGTGTC - 3' primer를 제조하여 오염여부를 검증하고자 하였다. 또한.
- 선발배지에서 살아남은 선발체들은 1/2 MS배지에 100 mg/L kanamycin, 250 mg/L carbenicillin이 첨가된 발근배지로 옮겨졌다. 한편, 선발된 shoot들은 PCR 반응을 이용하여 도입유전자의 삽입여부를 확인하였다. PCR 반응은 표지유전자인 nptU 와 저온관련 유전자인 BN115 및 식물에 도입되지 않는 v;'r G 유전자를 각각 특이적으로 증폭하는 primer를 가지고 실시하였다.
- tumefacience GV 3101 과 공동배양 한 후 항생제 kanamycin이 첨가된 선발배지에 치상하여 선발하였다. 항생제 선발조건은 잎절편을 항생제 kanamycin 이 농도별 (0, 25, 50, 75, 100mg/L)로 첨가된 재분화배지에 치상 후 4주가 되는 시기에 생존여 부를 조사하였는데 , 25 mg/L kanamycin 농도에서부터 절편체가 고사되었다. 따라서 25 mg/L kanamycin 농도를 선발조건으로 할 수 있으나 보다 강력히 발현되는 형질전환체를 선발하고자 100 mg/L kanamycin 농도를 선발조건으로 하여 kanamycin에 저항성을 가지는 shoot를 선발하였다 (Figure 2).
- 형질전환체로 추정되는 식물체의 유전자 도입 여부를 확인하기 위해 PCR 반응을 수행하였다. 식물체 DNA 추출은 식물체의 잎을 이용하여 Edwards 등 (1991)의 방법에 따라 수행하였으며, 먼저 표지유전자인 nptD gene을 확인하고자 500 bp의 PCR 산물을 증폭하는 5'-GTGGAGAGGC TATTCGGCTA - 3, 과 5' - CCACCATG ATATTCGGCAAG -3' primer를 제작하여 수행하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 BN115 유전자는 Agriculture Canada의 Dr. Singh로부터 분양받은 것으로써 겨울철 Brassica napus 에서 transcript된 저온관련유전자를 cloning한 것이다(Weretilnyk et al. 1993). Cloning된 유전자는 binary vector (An 1987)인 pBinl9에 재조합하여 disarmed Ti-plasmid를 가지는 A.
- 본 실험에 사용된 BN115 유전자는 겨울유채 품종인 Jet neuf 식물체를 2℃조건에서 저온처리한 후 발현되는 유전자를cloning한 것으로 저온처리 후 24시간 안에 잎에서 발현되는 것으로 보고되고 있다 (Weretilnyk et al. 1993).
- 상추 잎절편은 저온 관련 유전자인 BN115 gene과 표지유전자로써 kanamycin에 저항성이 있는 nptⅡ gene을 가지는 식물발현용 binary vector pBinl9/BN115를 가지고 있는 A. tumefacience GV 3101 과 공동배양 한 후 항생제 kanamycin이 첨가된 선발배지에 치상하여 선발하였다. 항생제 선발조건은 잎절편을 항생제 kanamycin 이 농도별 (0, 25, 50, 75, 100mg/L)로 첨가된 재분화배지에 치상 후 4주가 되는 시기에 생존여 부를 조사하였는데 , 25 mg/L kanamycin 농도에서부터 절편체가 고사되었다.
- sec-1), 온도 25±2℃, 습도 70%의 생장상에서 모든 배양을 실시하였다. 절편체는 발아 후 본엽이 2~3매 전개된 시기의 잎절편을 1.0 crrp 크기로 절단하여 Agrobacterium3\S} 공동배양에 사용하였다.
이론/모형
- 위해 PCR 반응을 수행하였다. 식물체 DNA 추출은 식물체의 잎을 이용하여 Edwards 등 (1991)의 방법에 따라 수행하였으며, 먼저 표지유전자인 nptD gene을 확인하고자 500 bp의 PCR 산물을 증폭하는 5'-GTGGAGAGGC TATTCGGCTA - 3, 과 5' - CCACCATG ATATTCGGCAAG -3' primer를 제작하여 수행하였다. PCR 반응은 Perkin Elmer PCR 기기를 사용하였으며, 반응조건은 96℃에서 3분간 pre-denaturation 반응을 거친 후 96℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 1분간 반응을 36회 반복하였으며, 최종 72℃에서 15분간 신장반응을 실시하였다.
성능/효과
- PCR 반응은 표지유전자인 nptU 와 저온관련 유전자인 BN115 및 식물에 도입되지 않는 v;'r G 유전자를 각각 특이적으로 증폭하는 primer를 가지고 실시하였다. PCR 반응 결과 대조구로 쓰인 정상 상추식물체에서는 nptll 와 BN115 유전자의 증폭을 볼 수 없는 반면에 형질전환체에서는 두 유전자 모두 PCR 증폭산물을 확인할 수 있었다 또한 확인된 식물체의 DNA에서는 vir G 유전자가 발견되지 않아 이는 Agrobacterium의 혼입에 의한 결과가 아님을 다시 한번 증명하였다. 또한 선발된 형질전환체를 이용하여 Southern analysis와 RT-PCR을 실시한 결과 내한성 유전자가 상추식물에 안정적으로 도입되어 발현됨을 확인하였다.
- 한편, BA 첨가구에서는 복수의 신초 (multiple shoot)가 유도되는 경향을 보였으며, 생성된 shoot는 유리화되는 현상을 보였으며, BA의 농도가 높아질수록 조직이 캘러스화되어 재분화가 어려운 경향을 보였다 (결과 미제시). 그러나 kinetin 처리구에서는 0.5 mg/L kinetin 첨가배지에서 왕성한 신초의 생성을 볼 수 있었으며, 특히 생성된 신초는 정상적인 형태를 보였으며 뿌리의 생성도 양호하여 정상적으로 성장하였다. 따라서 상추의 재분화 조건을 NAA 0.
- 도입된 BN115 유전자의 발현여부의 확인을 위한 RT-PCR 반응 결과 대조식물체의 cDNA에는 BN115 유전자의 증폭을 볼 수 없었으나 형질전환체에서는 BN115 primer에 의한 454bp의 PCR산물을 확인 할 수 있어 상추식물체에 도입된 BN115 유전자가 안정적으로 발현됨을 확인하였다 (Figure 5).
- 이는 PCR 반응결과가 Agro bacterium 기인한 DNA의 증폭이 아님을 확인시켜 주는 결과이다. 따라서 kanamycin 선발에 의해 생존한 식물체에는 표지유전자인 npt Ⅱ gene이 도입되었음을 확인 할 수 있었다.
- PCR 반응 결과 대조구로 쓰인 정상 상추식물체에서는 nptll 와 BN115 유전자의 증폭을 볼 수 없는 반면에 형질전환체에서는 두 유전자 모두 PCR 증폭산물을 확인할 수 있었다 또한 확인된 식물체의 DNA에서는 vir G 유전자가 발견되지 않아 이는 Agrobacterium의 혼입에 의한 결과가 아님을 다시 한번 증명하였다. 또한 선발된 형질전환체를 이용하여 Southern analysis와 RT-PCR을 실시한 결과 내한성 유전자가 상추식물에 안정적으로 도입되어 발현됨을 확인하였다.
- 또한, 최근에는 분자생물학적 방법을 이용하여 저온 stress가 어떠한 방법으로 세포 내로 인식되는지에 대한 연구가 진행되고 있는데, Los 등 (1994)은 catalytic hydrogenation 방법을 이용하여 Cyanobacterium synechocystis PCC6803의 plasma membrane의 불포화도를 변화시킴으로 저온 처리시 발현되는 유전자인 desA유전자의 발현을 조절 할 수 있었음을 보고하여 desA. 유전자의 발현이 저온 stress로 인한 것이 아니라 저온조건에 의한 원형질막의 유동성의 감소에 따른것임을 증명하였다. 또한, Uemura와 Steponkus (1994)는 귀리와 호밀 잎의 원형질막의 지질구성을 비교함으로써 각 식물의 내한성을 비교하였는데, 이들 식물의 원형질막의 지질구성차이가 내한성과 관계 있음을 보고하였다.
- 그 결과 형질전환이 확인된 식물체에서 나타난 PCR 밴드와 동일한 위치에서 밴드의 형성을 확인 할 수 있었다 (Figure 4B). 이와 같은 결과는 선발된 상추식물체에서 도입하고자 하는 저온관련유전자인 BN115 gene이 성공적으로 도입되었음을 나타내 주는 결과이다
- 5, 1, 2 mg/L)를 농도별로 혼용처리한 배지에 잎절편을 치상하여 조사한 결과 치상 후 7일부터 조직이 비대되며 절단면에서부터 캘러스의 생성을 관찰할 수 있었으며, 3주 후부터는 신초의 재분화가 이루어졌다. 한편, BA 첨가구에서는 복수의 신초 (multiple shoot)가 유도되는 경향을 보였으며, 생성된 shoot는 유리화되는 현상을 보였으며, BA의 농도가 높아질수록 조직이 캘러스화되어 재분화가 어려운 경향을 보였다 (결과 미제시). 그러나 kinetin 처리구에서는 0.
- 한편, PCR반응에 의해 npt Ⅱ gene이 확인된 식물체들로부터 저온관련 유전자의 도입여부를 확인하고자 gene의 단편을 증폭하도록 제조된 primer를 이용하여 PCR 반응을 실시한 결과 대조식물체로 사용한 정상적인 상추식물에서는 특이밴드가 형성되지 않았으나, 형질전환체에서는 454 bp의 유전자 증폭밴드를 확인 할 수 있었다 (Figure 4A). 또한 이러한 454 bp의 PCR 산물이 진정 형질전환시 사용한 binary vector 내에 있는 BN115 유전자의 일부분인지를 증명하기 위해 PCR 산물을 전기영동한 후 이를 nylon membrane으로 옮기고 DIG으로 labelling된 BN115 probe를 이용하여 Southern analysis를 실시하였다.
후속연구
- 품종에 도입하였으며, 유전자의 도입과 발현여부는 PCR과 Southern analysis 그리고 RT-PCR analysis를 이용하여 확인하였다. 그러나 이렇게 도입된 저온 유도성 유전자인 8N115 gene이 형질전환체에 어느 정도의 내한성을 부여하는지는 계속적으로 연구되어져야 할 것으로 사료된다.
- 반응을 재 실시하였다. 이 primer를 이용하여 PCR 반응을 실시한다면 Agrobacterium이 식물체 내에 존재하여 DNA추출과정에서 섞이게 되었는지를 판단할 수 있을 것이다.
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