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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 오이의 경단 및 하배축 배양시 2, 4-D 첨가 및 배양환경에 따른 캘러스 분화특성을 조사하고, 캘러스의 형태 특성 차이에 따른 단백질 함량 등을 구명하여 효율적인 오이 재분화 시스템을 확립하고자 수행하였다.
- 본 연구는 농림수산특정 연구과제 (AG 420 M)의 연구 결과이며, 단백질 분석에 도움을 주었던 장준택 박사님께 사의를 표한다.
제안 방법
- m 2 . s"1 (형광등, 16 h photoperiod)하에 Hyponex 500배 희석액을 공급하면서 20일간 기내순화를 시켰다. 순화된 식물체는 훈탄 : 펄라이트 (7 : 3, v/v)가 혼합된 고형배지경에 식재하고 오이전용 Yamazaki용액을 주기적으로 공급하면서 F-clean 하우스에서 재배하여 과실도 정상적으로 수확하였다.
- 배양 50일 후 배발생캘러스 및 배상체는 MS 기본 배지로 이식하여 유식물체를 유도하였으며 정상적인 개체는 순화 과정을 거쳐 비닐하우스에서 재배하였다. 같은 조건에서 분화된 비배발생캘러스는 백색 및 노랑색 캘러스로 구분하여발근 정도를 조사하였다.
- h/day) 및 암조건에서 배양하였다. 발아 5일째 '조생낙합' 유묘의 하배축을 petridish 당 10개 절편체 (길이 약 5 mm) 를 치상하여 5반복으로 수행하였다. 배지는 MS 기본배지에 30 g/L 설탕과 1 mg/L 2, 4-D를 첨가하였으며, 배양은 23±1 ℃ 온도조건 하에서 광조건 및 암조건에서 50일간 각각 배양하였다.
- 발아기 및 하배축 배양시 광 조사 유무가 캘러스 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 광조건 (60 nmol - m-2 - s-1, 16 h/day) 및 암조건에서 배양하였다. 발아 5일째 '조생낙합' 유묘의 하배축을 petridish 당 10개 절편체 (길이 약 5 mm) 를 치상하여 5반복으로 수행하였다.
- 배지는 MS 기본배지에 30 g/L 설탕과 1 mg/L 2, 4-D를 첨가하였으며, 배양은 23±1 ℃ 온도조건 하에서 광조건 및 암조건에서 50일간 각각 배양하였다. 배양 50일 후 배발생캘러스 및 배상체는 MS 기본 배지로 이식하여 유식물체를 유도하였으며 정상적인 개체는 순화 과정을 거쳐 비닐하우스에서 재배하였다. 같은 조건에서 분화된 비배발생캘러스는 백색 및 노랑색 캘러스로 구분하여발근 정도를 조사하였다.
- 유묘를 이용하여 엽원기 1매를 포함한 경단을 배양하였다. 배지는 MS 기본배지에 30 g/L 설탕과 0, 0.5, 1, 2 mg/L 2, 4- D를 각각 첨가하였으며, pH 5.8로 조정하고 0.8% agar를 첨가하여 고압습윤멸균 (121C, 15분)한 후, 클린벤치 내에서 petridish (0 90 mm x 12 mm) 에 30 mL씩 분주하여 실험에 이용하였다. petridish 당 8개 경단을 치상하여 5 반복하였으며, 배양은 온도 23±1℃, 광도 60 nmol .
- 발아 5일째 '조생낙합' 유묘의 하배축을 petridish 당 10개 절편체 (길이 약 5 mm) 를 치상하여 5반복으로 수행하였다. 배지는 MS 기본배지에 30 g/L 설탕과 1 mg/L 2, 4-D를 첨가하였으며, 배양은 23±1 ℃ 온도조건 하에서 광조건 및 암조건에서 50일간 각각 배양하였다. 배양 50일 후 배발생캘러스 및 배상체는 MS 기본 배지로 이식하여 유식물체를 유도하였으며 정상적인 개체는 순화 과정을 거쳐 비닐하우스에서 재배하였다.
- 비배발생캘러스의 단백질 함량을 조사하기 위하여, '조생낙합 종자를 암조건에서 7일간 배양하여 육성한 유묘를 1 mg/L 2, 4-D, 30 g/L 설탕이 첨가된 MS 배지에 하배축 및 자엽을 배양하였다. 배양은 23±1℃, 60 nmol .
- 오이 종자를 70% 알콜로 30 초, 2% 차아염소산나트륨에 15분간 표면살균 후 멸균수로 3 회 세척하였다. 소독한 종자는 생장조절물질이 첨가하지 않은 MS (Murashige and Skoog 1962) 고체배지에 파^하였다. 배지는 pH 5.
대상 데이터
- s'의 명배양 (16 h/day) 또는 암배양을 하였다. 발아 5 ~7일 된 유묘를 실험에 사용하였다.
- 시판하는 오이 (Ckcidis sativus L.) 2개 품종 '은성 백 다다기', 조생낙합을 사용하였다. 오이 종자를 70% 알콜로 30 초, 2% 차아염소산나트륨에 15분간 표면살균 후 멸균수로 3 회 세척하였다.
이론/모형
- s'1 광조건에서 1일 16시간 조사하여 40일간 배양하였다. 배양 후 캘러스 색깔형태별로 구분하여 Lowry 법 (1951)으로 단백질을 정량분석하였다.
성능/효과
- 또한 MS 기본배지에서는 캘러스는 전혀 분화되지 않고 생존 개체 모두 신초로 분화하였으며 배양 50일 후는 약 3 cm 정도 신장하였다. 그러나 2, 4-D를 0.5~2 mg/L 첨가한 배지에서는 배 발생 캘러스는 분화되지 않았으나 비배발생캘러스 및 점액성 캘러스로 분화되었고, 특히 2, 4-D 1 mg/L 첨가배지에서는점액성캘러스가 65%로 가장 많이 분화되었다.
- 5 mg/L2, 4-D를 첨가한 배지에서는 95%로 가장 높게 생존하였다 (Table 1). 또한 MS 기본배지에서는 캘러스는 전혀 분화되지 않고 생존 개체 모두 신초로 분화하였으며 배양 50일 후는 약 3 cm 정도 신장하였다. 그러나 2, 4-D를 0.
- 하배축 배양 50일후 다양한 형태의 캘러스가 분화되었는데, 배발생캘러스는 노랗고 단단하며 표면이 둥글둥글한 형태로 분화되는 반면에, 비 배 발생 캘러스는 반투명의 백색으로 부드럽고 물기가 많으며 표면이 거친 모양이었다 (Figure 1). 또한 배발생캘러스의 상단에서 구상의 배상체가 발달되는 것을 관찰할 수 있었다. 이렇게 다양한 형태의 캘러스는 광조건에 따라 달라, 광조건에서 발아된 유묘의 하배축 배양시 광조건과 암조건 모두 배 발생 캘러스의 분화는 없었고, 배양절편체 모두 비배발생캘러스로 분화하였다.
- 또한 자엽 및 하배축을 배양하여 분화된 캘러스를 백색 및노랑색 캘러스로 구분하여 조단백질의 함량을 측정한 결과, 캘러스의 생체중 100 g 당 자엽 또는 하배축 유래 백색 캘러스는 각각 116 mg 이었으나, 노랑색캘러스는 자엽 유래 캘러스 250 mg, 하배축 유래 캘러스는 225 mg으로 백색 캘러스보다 약 2배 정도 함량이 높았다 (Figure 2).
- 배양절편체로부터 기관분화는 배양조건뿐만 아니라 배양 절편체의 내생생장조절물질도 관여하는데 본 시험에서 백색 캘러스에서 발근이 양호한 결과를 볼 때 노랑색캘러스보다 백색 캘러스에서 오옥신계통의 생장조절물질이 많이 존재하여 발근에 촉진적으로 작용한 것으로 사료된다. 또한 figure 2에서 보는 바와 같이 자엽 및 하배축 유래 캘러스 모두 노랑색캘러스에서 조단백질의 함량이 높고 발근정도가 낮은 것으로 볼 때 단백질 함량이 높은 노랑색캘러스가 발근에 억제적으로 작용하는 것으로 사료된다.
- 오이 경단배양시 shoot 분화는 2, 4-D 무첨가 배지에서만 관찰되는데 이러한 결과는 고구마 경단배양시 2, 4-D는 shoot 분화 및 발근은 억제하나 비배발생캘러스 및 배 발생 캘러스의 분화에 2, 4-D가 촉진적으로 작용한다는 보고와 유사한 경향이었다. 본 실험에서는 배발생캘러스는 전혀 분화되지 않고 비배발생캘러스 및 점액성 캘러스 만이 분화되었다. 이런 결과는 조직절편체로부터 캘러스 분화시 오옥신특히 2, 4-D가 중요한 역할을 하는데, 2, 4-D는 DNA의 전사, mRNA의 번역에 영향을 주어 세포를 배발생 방향으로 변성시킨다.
- 양상은 table 3과 같다. 비배발생캘러스 중 백색 캘러스는 부드럽고 투명하며 unorganized된 형태로 shoot 재분화는 거의 안되고 발근된 캘러스의 뿌리분화율은 약 45% 였다. 그러나 노랑색캘러스는 발근정도가 0.
- 식물생장조정제가 첨가되지 않은 MS 고체배지에서 경단의 생존율은 76%로 다소 저조하였으나, 2, 4-D를 첨가한 배지에서는 87% 이상 생존하였으며, 특히 0.5 mg/L2, 4-D를 첨가한 배지에서는 95%로 가장 높게 생존하였다 (Table 1). 또한 MS 기본배지에서는 캘러스는 전혀 분화되지 않고 생존 개체 모두 신초로 분화하였으며 배양 50일 후는 약 3 cm 정도 신장하였다.
후속연구
- 본 실험에서는 캘러스의 색깔에 따라서 조단백질의 함량을 다루었으나, 배 발생 세포계통은 비배발생 세포계통보다 단백질의 농도가 상당히 높았다는 보고가 있으며 (Filipecki and Prezybecki 1994),배발생 세포와 비배발생 세포간 핵산이나 단백질의 차이를 보면 세포가 분열하고 배가 되는데 따라 고분자물질의 조성에 변화가 일어난다. 이렇게 형성된 단백질은 식물의 분화과정 중 기관형성에 필요한 효소적 활성을 증가시키는 데 이용될 것이다.
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