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문제 정의
- html). 따라서 본 연구에서는 오염되어 있는 정상 미생물 총의 수가 각각 다른 우유, 훈제연어, 두부, 샐러드와 같은 식품에 존재하는 L. monocytogenese- 검출하는데 있어 과연 24시간 증균 배양이 충분한지 검증해보고 이에 덧붙여 국내에서 가장 많이 사용되는 2종류의 신속검출 키트와 배지 법을 비교해서 유효성을 평가해보고자 한다.
- 00으로 음성이 나왔으며, Reveal®에서는 대조선의한 라인만 나타났다. 따라서 실험 결과의 신뢰성을 입증하였다.
- monocytogenes균을 검출하는 것은 매우 중요하다. 본 연구의 목적은 현재 사용되고 있는 배지법에서 배양시간에 따른 검출능력을 비교해보고, 상용화된 L. monocytogenes 신속검출 키트의 유효성을 검증하는 것이다. 다양한 식품 샘플(훈제연어, 생식용 두부, 우유, 샐러드)에 총 20개의 샘플에서 일부분의 양성 결과가 나오도록 L.
제안 방법
- 6%yeast extract가 포함된 tryptic soy broth(TSB, Difco)인 TSBYE에서 37℃, 18시간 증균배양 하였다. TSBYE에서 2번 계대 배양한 균액을 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.2)에 10배수로 희석하여 TSAYE에 100 |1L를 도말하고 37℃에 18시간 배양하여 집락수를 확인하였다. 균수는 위와 같은 방법으로 필요할 때마다 확인하였다.
- 테스트 키트는 미리 상온에 꺼내두었다. 가열한 균액은 상온에서 식힌 다음 이물질 없는 상층액으로만 135 μL를 취하여 키트의 주입구에 떨어뜨려 15-20분 후 결과를 판정하였다. 대조선 (control line) 외에 test선이 나타나 총 2줄의 선이 생기면 양성으로 판정하였다.
- 신속검출 키트 검증에는 24시간 및 48시간 배지법과 48간 및 72시간 신속 검출키트를 수행하여 얻은 양성 샘플 수 결과를 바탕으로 두 검출법 간의 양성 결과 수를 비교하였다. 각 검출법간의 배양시간의 변화에 따른 결과도 비교하였다. 아울러 각 방법 간의 통계학적 유의차(P 값)을 비교하였다.
- 균질하게 섞은 후, 100 gL를 취하여 10배수로 희석하였다. 각각 우유, 두부, 훈제 연어는 1, 2번 희석한 배지를, 샐러드는 3, 4, 5번 희석한 배지를 nutrient agar(Difco) 에 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 집락 수를 세어 평균 총 세균수를 측정하였다.
- 그리고 BLEB에서 24시간을 추가배양하여 앞서 제시된 과정을 다시 한번 시행, 총 48시간 배양결과와 72시간 배양 결과를 비교하였다.
- monocytogenes 신속검출 키트의 유효성을 검증하는 것이다. 다양한 식품 샘플(훈제연어, 생식용 두부, 우유, 샐러드)에 총 20개의 샘플에서 일부분의 양성 결과가 나오도록 L. monocytogenes를 접종하였다. 이를 예비 증균과 배지에서의 배양을 거쳐 마지막으로 Microgen™ Listeria-ID를 이용하여 균을 확인하였다.
- or g 이상) 샐러드에서는 500 CFU/500 g 이상으로 굉장히 높았다는 것이다(결과 미제시). 따라서 본 연구에 사용된 접종량은 본 실험에 앞서 실행된 예비 실험 및 비가열 식품에 존재하는 세균총을 고려하여 산출하였다. 이러한 사실들을 종합해볼 때 식품의 정상 세균총 수가 식중독세균의 성장에 많은 영향을 미치는 것을 알 수 있다.
- 있다. 배지법은 식품공전에서 규정된 24시간법과 24시간 추가 배양한 48시간 배양법을 사용하였고 신속검출 키트는 사용법에 따른 48시간법과 24시간 추가 배양한 72 시간법을 사용하여 비교하였다. 양성 대조군의 경우 VIDAS® 에서 test value가 0.
- 하나의 샘플에 각각 한 개의 VIDAS "LM02" strip과 VIDAS "LMO2"SPR® (the solid phase receptacle)을 사용하였다. 샘플을 분석하기 전에 먼저 calibrating을 하고 준비가 다 되었으면 SPR 과 strip을 장치에 끼운 다음 각각의 strip에 500 pL의 배 양된 Fraser broth를 넣고 분석을 시작하였다. 결과는 test value로 확인하였으며 0.
- 이렇게 균질화된 20개의 식품 샘플과 각각 한 개씩 설 정한 대조군(양성, 음성)을 30℃의 배양기에서 24시간 배 양하였다. 식품 샘플은 총 48시간 배양하였으며 그동안 24시간, 48시간에 각각 샘플을 채취하여 실험을 진행하였다.
- 이를 예비 증균과 배지에서의 배양을 거쳐 마지막으로 Microgen™ Listeria-ID를 이용하여 균을 확인하였다. 신속검줄 키트인 VIDAS® Listeria monocytogenes H(LMO2)와 REVEAL® for Listeria 도 시행하여 배지법과 검출능력을 비교하였다. 배지법에서 배양시간을 24시간에서 48시간으로 늘리면 훈제연어는 0개에서 9개, 두부는 0개에서 10개로, 우유는 2개에서 17개로, 샐러드는 4개에서 16개로 모든 식품 샘플에서 양성결과가 눈에 띄게 증가하였다.
- San Diego, CA, USA)을 사용하여 95%의 신뢰한계를 갖고 통계학적인 유의차(p 값)를 분석하고 배지법에서는 24 시간과 48시간의 예비 증균시간에 따라 양성인 샘플 개수 차이를 비교해 보았다. 신속검출 키트 검증에는 24시간 및 48시간 배지법과 48간 및 72시간 신속 검출키트를 수행하여 얻은 양성 샘플 수 결과를 바탕으로 두 검출법 간의 양성 결과 수를 비교하였다. 각 검출법간의 배양시간의 변화에 따른 결과도 비교하였다.
- 1). 앞서 서술한 대로 총 22개의 샘플을 half-Fraser broth와 30℃의 환경에서 예비 증균 후, 분리배양을 위해 선택배지인 Oxford agar (Neogen)에 접종하였다. 접종된 Oxford agar를 30℃의 배 양기에서 48시간 동안 배양하여 L.
- 접종된 샘플 500 g을 각각 25 g(혹은 25 mL)으로 나누어 20개의 stomach bag에 half-Fraser broth(Difco) 225 mL와 함께 넣은 다음 stomacher를 이용해 30초간 균질하게 섞었 다. 이렇게 균질화된 20개의 식품 샘플과 각각 한 개씩 설 정한 대조군(양성, 음성)을 30℃의 배양기에서 24시간 배 양하였다. 식품 샘플은 총 48시간 배양하였으며 그동안 24시간, 48시간에 각각 샘플을 채취하여 실험을 진행하였다.
- monocytogenes를 접종하였다. 이를 예비 증균과 배지에서의 배양을 거쳐 마지막으로 Microgen™ Listeria-ID를 이용하여 균을 확인하였다. 신속검줄 키트인 VIDAS® Listeria monocytogenes H(LMO2)와 REVEAL® for Listeria 도 시행하여 배지법과 검출능력을 비교하였다.
- 선정된 샘플은 우유(시유), 생식용 두부, 훈제연어, 샐러드이고 이 식품 샘플은 모두 서울시 광진구 소재의 대형마트에서 구입하였다. 접종 전 각 식품에 존재하는 총 세균수를 측정하기 위해 각 식품 샘플 25 g 또는25 mL에 buffered peptone water(BPW, BioMeriex) 225mL를 첨가하여 stomacher를 이용하여 30초간 균질화하였다. 균질하게 섞은 후, 100 gL를 취하여 10배수로 희석하였다.
- monocytogenese를 접종하였다. 준비된 균은 각 식품에 원래 존재하는 미생물 균총에 따라 일부 양성-일부 음성 샘플을 얻을 수 있는 접종량이 달라짐을 실험적 으로 고려하여 생식용 두부에 43CFU/500g와 31 CFU/ 500 g, 훈제 연어 에 27 CFU/500 g, 샐러드에 664 CFU/ 500 g, 우유에 59 CFU/500g을 각각 접종하였다. 대조군은 음성과 양성 각각 하나씩 준비하였다.
- 1 mL 균액을 10mL의 Fraser broth(BioM&iex)에 접종하여 3VC에서 24시간을 배양하였다. 총 48 시간 배양한 후 추가적으로 24시간을 더 배양하여 48시간 배양샘플과 72시간 배양 샘플을 비교하였다.
대상 데이터
- VIDAS®를 시행하기 위해 4℃에 보관되어 있던 시약 및 키트를 미리 꺼내어 실온에 놓고 automated VIDAS instrument(BioM&iex)도 미리 켜놓았다. 하나의 샘플에 각각 한 개의 VIDAS "LM02" strip과 VIDAS "LMO2"SPR® (the solid phase receptacle)을 사용하였다. 샘플을 분석하기 전에 먼저 calibrating을 하고 준비가 다 되었으면 SPR 과 strip을 장치에 끼운 다음 각각의 strip에 500 pL의 배 양된 Fraser broth를 넣고 분석을 시작하였다.
- Listeria monocytogenese: 미국 FDA(MD, USA)에서 분양 받아 실험실에서 보유하고 있던 균주를 사용하였다. 얼려있던(-70℃) 균주를 녹여 0.
- 준비된 균은 각 식품에 원래 존재하는 미생물 균총에 따라 일부 양성-일부 음성 샘플을 얻을 수 있는 접종량이 달라짐을 실험적 으로 고려하여 생식용 두부에 43CFU/500g와 31 CFU/ 500 g, 훈제 연어 에 27 CFU/500 g, 샐러드에 664 CFU/ 500 g, 우유에 59 CFU/500g을 각각 접종하였다. 대조군은 음성과 양성 각각 하나씩 준비하였다. 음성 대조군의 경우에는 식품 25 g에 멸균된 PBS를 100 pL 접종하고, 양성 대조군에는 식품 25 g에 L.
- , 2006) 현재 국내에서 소비가 많이 되고 교차오염을 일으킬 빈도가 높은 식품을 선정하였다. 선정된 샘플은 우유(시유), 생식용 두부, 훈제연어, 샐러드이고 이 식품 샘플은 모두 서울시 광진구 소재의 대형마트에서 구입하였다. 접종 전 각 식품에 존재하는 총 세균수를 측정하기 위해 각 식품 샘플 25 g 또는25 mL에 buffered peptone water(BPW, BioMeriex) 225mL를 첨가하여 stomacher를 이용하여 30초간 균질화하였다.
- 식품 샘플은 그 동안의 리스테리아증 발생 기록을 참고하였고, 본 연구실에서 확립한 식중독균 시험법 검증 방법 가이드라인에 따라(Seo et al., 2006) 현재 국내에서 소비가 많이 되고 교차오염을 일으킬 빈도가 높은 식품을 선정하였다. 선정된 샘플은 우유(시유), 생식용 두부, 훈제연어, 샐러드이고 이 식품 샘플은 모두 서울시 광진구 소재의 대형마트에서 구입하였다.
- 배양 후 집락 수를 세어 평균 총 세균수를 측정하였다. 통계학적 분석을 위해 총 20개(25 g/샘플)로 나눠진 식품 샘플 500 g에준비된 L. monocytogenese를 접종하였다. 준비된 균은 각 식품에 원래 존재하는 미생물 균총에 따라 일부 양성-일부 음성 샘플을 얻을 수 있는 접종량이 달라짐을 실험적 으로 고려하여 생식용 두부에 43CFU/500g와 31 CFU/ 500 g, 훈제 연어 에 27 CFU/500 g, 샐러드에 664 CFU/ 500 g, 우유에 59 CFU/500g을 각각 접종하였다.
데이터처리
- 각각 우유, 두부, 훈제 연어는 1, 2번 희석한 배지를, 샐러드는 3, 4, 5번 희석한 배지를 nutrient agar(Difco) 에 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 집락 수를 세어 평균 총 세균수를 측정하였다. 통계학적 분석을 위해 총 20개(25 g/샘플)로 나눠진 식품 샘플 500 g에준비된 L.
- 각 검출법간의 배양시간의 변화에 따른 결과도 비교하였다. 아울러 각 방법 간의 통계학적 유의차(P 값)을 비교하였다. p 값이 0.
- 통계프로그램인 GraphPad Instat(GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA)을 사용하여 95%의 신뢰한계를 갖고 통계학적인 유의차(p 값)를 분석하고 배지법에서는 24 시간과 48시간의 예비 증균시간에 따라 양성인 샘플 개수 차이를 비교해 보았다. 신속검출 키트 검증에는 24시간 및 48시간 배지법과 48간 및 72시간 신속 검출키트를 수행하여 얻은 양성 샘플 수 결과를 바탕으로 두 검출법 간의 양성 결과 수를 비교하였다.
이론/모형
- monocytogene료 의심되는 검은 색의 집락만을 TSAYE에 접종하였다. 이를 다시 3VC에서 48시간 배양한 후 흰색의 작은 원형 집락을 확인하고 의심되는 단일 집락은 최종확인을 위하여 Microgen™ Listeria ID system(Microgen Bioproducts Ltd., Camberley, Surrey, England)을 제조사에서 제공한 설명서 의 방법에 따라 시행하였다. 이 모든 과정은 각각의 예비 증균 시간(24, 48시간)에 따라 진행하였다.
성능/효과
- 2) The statistical difference between KOBAM method (48 hr) and Reveal is considered extremely significant. The p value is < 0.
- 3) The statistical difference between enriched for 48 hr and 72 hr in Reveal is considered extremely significant. The p value is < 0.
- 3) The statistical difference between the number of positive samples when enriched for 24 hr and 48 hr is significant.
- 샐러드에서는 배지법의 24시간 배양 결과와 비교했을 때 통계학적 유의차가 없었다. 48 시간 배양 샘플에서 배지법과 VIDAS®의 양성샘플 수 간의 통계학적 유의차가 없었지만, Reveal®과는 통계학적 유의차를 보였다(p<0.05). 다만 VIDAS®에서는 기존 48시간 배양법과 72시간 배양 시 양성 결과를 비교해 봤을 때 p value가 0.
- 결론적으로 본 실험의 결과에 비추어 보면 배지 법에서 예비 증균 시간이 24시간일 때는 검출 감도가 낮지만, 다른 신속 검출 키트나 배양법과 같이 증균 시간을 48시간으로 늘리면 오히려 더 뛰어난 검출 결과를 보이는 것을 알 수 있다. 따라서 앞서 언급한 것처럼 현재 국내공인법에 명시되어 있는 예비 증균 시간을 24시간에서 48시간으로 늘린다면 보다 더 효과적으로 L.
- 05). 다만 VIDAS®에서는 기존 48시간 배양법과 72시간 배양 시 양성 결과를 비교해 봤을 때 p value가 0.0958S- 유의차가 없는 것으로 나타났으나 Reveal 에서는 유의차가 큰 것으로 나타났다(p<0.05). 두 신속검출 키트를 72시간 배양했을 때는 양성 결과가 각각 16개로 배지법에서 48시간 배양했을 때와 동일한 결과가 나타났다.
- 05). 두 신속검출 키트를 72시간 배양했을 때는 양성 결과가 각각 16개로 배지법에서 48시간 배양했을 때와 동일한 결과가 나타났다.
- , 1997). 따라서 본 연구의결과도 증균배양시간을 48시간으로 동일하게 했을 경우 식품공전 법과 같은 배지법이 신속검출 키트법보다 통계학적인 유의차는 없지만 많은 양성 샘플 수를 보였으므로 Beumer(1997)의 연구와 일치함을 알 수 있다.
- momcy/ogegs균의 특성에 적합하지 않은 방법이다. 또한 FDA, USDA, International Standard Organization(ISO) 등과 같은 다른 선진국의 식품안전 담당 기관의 검출 과정에 예비 증균 시간이 48시간 이상으로 명시되어있는 것으로 보아 L. monocytogenese] 효율적인 검출을 위해서는 48시간 증균이 반드시 필요하다.
- 이 결과에서 볼 수 있듯이 VIDAS® 등의 신속검출 키트는 검출 과정이 보다 더 간단하고 신속한 검출이 가능하다는 장점이 있다. 또한 전통적인 배지 법을 이용한 검출법보다는 양성 샘플의 수가 줄어들지만 통계학적 유의차는 없다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 Beumer(1997)의 연구에서도 확인할 수 있다.
- 본 실험에 사용된 네 가지의 식품 샘플에서 모두 기존 식품공전에 제시된 24시간보다 하루 더 늘린 48시간 배양 시 L. monocytogenes 양성 샘플의 수가 눈에 띄게 증가하였다(Table 1). 훈제연어의 경우 24시간 배양했을 때는 양성이 검출되지 않았지만 48시간으로 배양 시간을 늘렸을 때는 L.
- 샐러드에서는 배지법을 이용했을 경우 24시간 배양 시 4개, 48시간 배양 시 16개의 L. monocytogenes 양성 결과를 얻었고, VIDAS®와 Reveal®에서는 각각 본래 증 균과 정인 48시간 배양을 실시했을 때 각각 0개, 1개의 양성 결과가 보여주었고 72시간으로 늘린 경우 두 방법 모두 16 개의 L. monocytogenes 양성 샘플을 얻을 수 있었다(Table 2). 신속검출 키트에서 예비 증균시간을 본래 48시간보다 24시간 늘려 72시간 배양시의 양성 결과 수를 관찰한 결과 증균시간이 증가함에 따라 양성 샘플 수가 각각 10개에서 16개, 1개에서 16개로 증가하는 것을 알 수 있다.
- 생식용 두부에서는 배지법에서 24시간 배양 시 0개, 48 시간 배양 시 2개의 양성 샘플이 나왔고, VIDAS®와 Re veal® 에서 모두 본래 증균과정인 48시간 배양을 실시했을 때 0개의 양성 결과가 나왔고 72시간으로 늘린 경우 2 개가 나왔다(Table 2). 이는 접종량이 상대적으로 적었던 (0.
- monocytogenes 양성 샘플을 얻을 수 있었다(Table 2). 신속검출 키트에서 예비 증균시간을 본래 48시간보다 24시간 늘려 72시간 배양시의 양성 결과 수를 관찰한 결과 증균시간이 증가함에 따라 양성 샘플 수가 각각 10개에서 16개, 1개에서 16개로 증가하는 것을 알 수 있다.
- 배지법은 식품공전에서 규정된 24시간법과 24시간 추가 배양한 48시간 배양법을 사용하였고 신속검출 키트는 사용법에 따른 48시간법과 24시간 추가 배양한 72 시간법을 사용하여 비교하였다. 양성 대조군의 경우 VIDAS® 에서 test value가 0.05 이상으로 양성판정이 나왔으며, Reveal®에서는 선명한 두 줄의 라인이 나타났다. 음성 대조군은 VIDAS®에서 test value가 0.
- 이 결과를 볼 때 24시간과 48시간의 배양시간 차이가 L. monocytogenes 검출에 상당히 영향을 미치는 것을 알 수 있다. 이는 현재 우리나라 공인방법 중 24시간 예비 증 균 법은 L.
- 이러한 결과를 종합해 볼 때, VIDAS®는 종(species) 수준에서 검줄 가능한 방법으로 L. monocytogenes를 검줄하는 데에 매우 효과적인 것으로 보이고 배지법의 대체 방법으로 사용하기에 큰 무리가 없을 것으로 보인다. Reveal® 키트는 추가적인 기계 사용 없이 매우 신속하고 간편하게 검출할 수 있는 장점이 있는 반면, Listeria 속(genus) 수준에서 검줄하는 방법으로 샘플 내에 본래 L.
- 062 CFU/g) 관계로 양성 샘플의 수가 다른 실험에서보다 적게 나온 것으로 보인다. 이러한 결과에 비춰봤을 때,신속키트의 권장 배양시간인 48시간으로는 매우 적은 수준으로 오염된 L. monocytogenese] 검줄이 중분하지 못하다는 사실을 알 수 있다.
- 따라서 본 연구에 사용된 접종량은 본 실험에 앞서 실행된 예비 실험 및 비가열 식품에 존재하는 세균총을 고려하여 산출하였다. 이러한 사실들을 종합해볼 때 식품의 정상 세균총 수가 식중독세균의 성장에 많은 영향을 미치는 것을 알 수 있다. 본래 세균총이 많이 존재하는 비가열 식품과 축산물 등의 가공식품을 함께 조리할 경우 식품의 교차 오염 위험이 증가할 수 있다.
- , 2000). 자연적으로 오염된 훈제 생선류와 가공환경의 샘플 총 295개 중 mini-VIDAS LMO에서는 양성 8개, 음성 273개, 위양성 11개, 위 음성 3개의 결과가 나왔다. 배지법인 ISO 11290- 1로 검출했을 때는 양성 11개, 음성 284개, 위양성과 위음성은 각각 0개였다.
- 그 외에 우유에서는 2개에서 17개로, 샐러드에서는 4개에서 16개로 양성 샘플수가 증가한 결과를 얻을 수 있었다(Table 1). 훈제연어, 생식용 두부, 우유, 샐러드 모두 배양시간 간의 결과 차이에 있어서 통계학적인 유의차가 현저한 것으로 나타났다(p<0.05).
- 흥미로운 사실은 정상미생물총이 g 또는 mL당 100 이하인 시유, 두부, 훈제연어와 같은 가공식품에서는 20개의 샘플 중 일부분 양성 샘플을 얻기 위한 접종량이 100 CFU/ 500 g 이하로 매우 적었으나 정상미생물총이 높은(105 CFU /mL or g 이상) 샐러드에서는 500 CFU/500 g 이상으로 굉장히 높았다는 것이다(결과 미제시). 따라서 본 연구에 사용된 접종량은 본 실험에 앞서 실행된 예비 실험 및 비가열 식품에 존재하는 세균총을 고려하여 산출하였다.
후속연구
- 본래 세균총이 많이 존재하는 비가열 식품과 축산물 등의 가공식품을 함께 조리할 경우 식품의 교차 오염 위험이 증가할 수 있다. 따라서 세균총 수가 많은 비가열 식품에서 L. monocytogenes를 검출할 경우에 특히 적합한 배양 시간이 중요할 것으로 사료된다.
- , 2007). 따라서 신속검출 키트의 사용은 검출 단계가 간단하고 속 혹은 종 수준까지 확신을 가지고 신속하게 양성 및 음성 결과를 판정할 수 있기 때문에 실제 식품 검사에서 많이 나오게 되는 음성 샘플을 신속하게 배제하기 위한presumptive screening에 효과적으로 이용될 것으로 사료된다. 그러나 목표균의 종류와 식품군에 따라서 권장 배양 시간이 충분하지 않은 경우가 있기 때문에 신속키트 사용 전에 반드시 검증과정을 거쳐 유효성을 입증한 후 사용해야 한다.
- 수 있다. 따라서 앞서 언급한 것처럼 현재 국내공인법에 명시되어 있는 예비 증균 시간을 24시간에서 48시간으로 늘린다면 보다 더 효과적으로 L. monocytogene를 검출할 수 있을 것으로 보인다. 그러나 배지법을 기초로 하는 검출법은 확인에서 동정 과정까지 포함해서 기본적으로 시간이 많이 소요되고, 독소를 생성할 경우에는 살아있는 균에서 만 검출이 가능하다는 단점이 있다(Choi et al.
- 그러나 목표균의 종류와 식품군에 따라서 권장 배양 시간이 충분하지 않은 경우가 있기 때문에 신속키트 사용 전에 반드시 검증과정을 거쳐 유효성을 입증한 후 사용해야 한다. 또한 식중독의 예방과 원인체의 신속한 검출을 위하여 앞으로 검출법에 보다 더 효과적으로 적용할 수 있는 예비 증균법 개발에 집중연구가 요구된다.
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