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문제 정의
- 만성기도질환에서 객담내 세포의 성상이 변화가 있다 는 것은 이미 알려져 있으며 mucin의 분비가 증가한다는 것은 잘 알려진 사실이나 임상적인 이용이 제한되어 왔다. 만성기도질환 환자의 객담내 세포성상과 임상적 특성을 단클론항체 (HMO2)를 이용하여 측정된 mucin이 상관관계가 있는지를 알아보고자 하였 다.
제안 방법
- 이러한 방어기 전에 중요한 역할을 하는 기도점액은 중요한 구성성분 으로 mucin이 있으며 이 mucin은 매우 다양한 구조 를 지니고 있는 거대분자로서 각종 유해자극들이나, 만성 기관지염, 천식 등의 질환에서 분비세포수가 증 가하고, 분비량이 증가되며 증가된 점액은 객담의 형 태로 배출된다有. 기도 mucin에 대한 정량을 위해서 는 단세포군항체 (Monoclonal antibodyX 이용한 면역정량법이 매우 간편하며 또한 임상적인 이용의 어 느 정도 현실화되고 있다"I 이에 저자들은 만성기도 질환 환자의 객담을 채취하여 객담세포의 성상이 질환 별 차이가 있는지를 알아보았고, 객담세포의 성상과 환자의 임상적 특성이 단클론항체를 이용한 mucin의 양과 연관이 있는지를 비교 분석하였다.
- Mucin의 면역효소측정을 위한 검체의 처리는 전체 용액의 1/10의 용량에 해당하는 0.5 M sodium acetate와 20% sodium dodecyl sulfide (SDS)를 넣어 최종 농도가 50 mM sodium cetate, 0.1% SDS가 되도록 하였다. 이것을 100℃ 에서 중탕으로 3분간 처리한 후 용액 중 100µ를 분리하여 증류수 900µ 에 넣어 전체 용량을 1 ml로 하여 단백 농도를 Lowry 법으로 측정하고 남은 검체는 -70℃에 저장 하였다.
- Peroxidase labeled goat anti-mouse immunoglobulin을 1 : 5000으로 희석하여 동량을 넣어 32℃에서 1시간 배양하고 5회 세척하였다. TMB (tetramethyl benzidine)로 발색시킨 후 650 nm에서 optical density를 분석하고 stop solution 투여 후 450 nm에서 optical density를 측정하였다. 이 값을 standard curve의 값과 비교하여 검체의 mucin 농도를 측정하였다.
- 이는 3%, 4%, 5%의 고장성 생리식염수를 ultrasonic nebulizer 사용하여 단계적으로 7분간 흡입하고 큰 호흡을 한 후 기침을 유도하여 하부 기도의 분비물을 얻는 방법을 사용하였다. 객담에서 타액성분을 포함한 수분을 탈지면에 흡수시킨 후 점액성분만을 겸자를 사용하여 선택적으로 얻어낸 후 무게를 측정하였다. 객담성분의 균등한 분포를 위하여 0.
- 단클론항체 HMO2가 객담내의 당단백인 mucin과 반응함을 확인하기 위하여 Western blot과 PAS 염색으로 검증하였다. 검증된 단클론항체 를 이용하여 면역효소측정으로 mucin을 정량하였다. 또한 연구결과와 환자의 임상적인 특성과 상관관계를 규명하였다.
- 여 전체 세포수와 생존률을 측정하였으며 분별 검사를 하였다. 단클론항체 HMO2가 객담내의 당단백인 mucin과 반응함을 확인하기 위하여 Western blot과 PAS 염색으로 검증하였다. 검증된 단클론항체 를 이용하여 면역효소측정으로 mucin을 정량하였다.
- 검증된 단클론항체 를 이용하여 면역효소측정으로 mucin을 정량하였다. 또한 연구결과와 환자의 임상적인 특성과 상관관계를 규명하였다.
- 41μm격자 의 Nylon gauze(Fisher, USA)에 부어서 불순물을 제거하고 전체세포수cell cgnL)와 Trypan blue exclusion method를 사용하여 세포의 생존률(viability)을 측정하였다. 또한105/ml의 세포 60 M를 450 rpm, 6분간 cytospin (Shandon, USA)에서 회전시켜 세포룰 고정시킨 후 Diff- Quick 염색을 하여 전체 400개의 세포를 분별검사 를 실시하였다. 이때 편평상피세포가 20%이상이면 불충분한 검체로 판정하여 검사에서 제외하였다.
- 자발적 배출된 객담과 고장성 생리식염수를 이용한 유도객담으로 얻은 검체를 처리히.여 전체 세포수와 생존률을 측정하였으며 분별 검사를 하였다. 단클론항체 HMO2가 객담내의 당단백인 mucin과 반응함을 확인하기 위하여 Western blot과 PAS 염색으로 검증하였다.
- 이때 DTT는 객담의 뮤신 성분의 disulfide bond를 끊어 뮤신 성분을 환원형으로 변화시켜준다고 알려져 있다. 육안적으로 보아 개담내의 고형 성분 즉 객담이 완전히 녹은 것을 확인한 후 검체 내의 DTT 성분을 희석시켜 없애기 위하여 5배의 PBS를 넣어, 객담을 10배 용량으로 희석하였다. 41μm격자 의 Nylon gauze(Fisher, USA)에 부어서 불순물을 제거하고 전체세포수cell cgnL)와 Trypan blue exclusion method를 사용하여 세포의 생존률(viability)을 측정하였다.
- TMB (tetramethyl benzidine)로 발색시킨 후 650 nm에서 optical density를 분석하고 stop solution 투여 후 450 nm에서 optical density를 측정하였다. 이 값을 standard curve의 값과 비교하여 검체의 mucin 농도를 측정하였다.
- 자연 객담 배출이 적어 객담을 얻기 힘든 환자와 호흡기계 질환이 없는 경우 객담을 얻는 방법으로서 고장성 생리식염수를 흡인하여 얻는 유도객담방법을 이용하였다. 이는 3%, 4%, 5%의 고장성 생리식염수를 ultrasonic nebulizer 사용하여 단계적으로 7분간 흡입하고 큰 호흡을 한 후 기침을 유도하여 하부 기도의 분비물을 얻는 방법을 사용하였다. 객담에서 타액성분을 포함한 수분을 탈지면에 흡수시킨 후 점액성분만을 겸자를 사용하여 선택적으로 얻어낸 후 무게를 측정하였다.
- Membrane을 TBS-Tween으로 세척한 후, 1 : 3000의 농도로 회석한 2차 항체 (HRP-la-belled goat anti-mouse Immunoglobulin) S 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어 TBS-Tween으로 세척하여, detection solution (enhanced chemilu minescence detection system : ECL)으로 처리 후 film에 감작시켜 autoradiogram을 얻었다.
- 최근 개발된 mucin에 대한 단클론항체를 사용하여 만성기도질환환자를 대상으로 객담의 세포분석과 mucin의 양을 측정하였다. 자발적 배출된 객담과 고장성 생리식염수를 이용한 유도객담으로 얻은 검체를 처리히.여 전체 세포수와 생존률을 측정하였으며 분별 검사를 하였다.
- 최근 개발된 mucin에 대한 단클론항체를 사용하여 만성기도질환환자를 대상으로 객담의 세포분석과 mucin의 양을 측정하였다. 자발적 배출된 객담과 고장성 생리식염수를 이용한 유도객담으로 얻은 검체를 처리히.
대상 데이터
- 1998년 1월부터 1998년 12월까지 순천향대학병원 에 내원한 임상증상과 질환별 특이검사로서 확진된 기관지천식 , 만성기관지염 , 기관지확장증의 만성기도질 환 환자 54명을 대상으로 하였다. 질환별 분포를 보면 기관지천식 33명, 기관지확장증 8명, 만성기관지염 13명이었다.
- 서울대학교 약학대학교실에서 제공한 인체 기도에서 추출한 mucin을 Ca2+과 #이 들어있지 않은 pH 7.4의 PBS로 희석하여 0, 0.1, 0.25, 1, 2.5, 10 ng/ ml의 농도로 준비하였다.
데이터처리
-
3. 통계분석
통계적인 분석은 statistical package for the social sciences (SPSS) 를 이용하여 ANOVA 와 MannWhitney U test, Pearson Correlation를 이용하였으며 중앙값과 평균 및 표준오차로 표시하였으며, p값이 0.05 미만인 경우를 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 육안적으로 보아 개담내의 고형 성분 즉 객담이 완전히 녹은 것을 확인한 후 검체 내의 DTT 성분을 희석시켜 없애기 위하여 5배의 PBS를 넣어, 객담을 10배 용량으로 희석하였다. 41μm격자 의 Nylon gauze(Fisher, USA)에 부어서 불순물을 제거하고 전체세포수cell cgnL)와 Trypan blue exclusion method를 사용하여 세포의 생존률(viability)을 측정하였다. 또한105/ml의 세포 60 M를 450 rpm, 6분간 cytospin (Shandon, USA)에서 회전시켜 세포룰 고정시킨 후 Diff- Quick 염색을 하여 전체 400개의 세포를 분별검사 를 실시하였다.
- 단클론항체가 기도 분비물 내 muciri의 단백과 반응하는 가를 Western blot을 이용하여 측정하였다. 환자의 처리된 기도 검체에 5 Laemli buffer (pH 6.
- 1% SDS가 되도록 하였다. 이것을 100℃ 에서 중탕으로 3분간 처리한 후 용액 중 100µ를 분리하여 증류수 900µ 에 넣어 전체 용량을 1 ml로 하여 단백 농도를 Lowry 법으로 측정하고 남은 검체는 -70℃에 저장 하였다.
- 객담이 있는 만성 호흡기 질환환자는 구강을 깨끗한 물로 헹군 후 큰 기침을 하여 하부 기도의 분비물을 얻었다. 자연 객담 배출이 적어 객담을 얻기 힘든 환자와 호흡기계 질환이 없는 경우 객담을 얻는 방법으로서 고장성 생리식염수를 흡인하여 얻는 유도객담방법을 이용하였다. 이는 3%, 4%, 5%의 고장성 생리식염수를 ultrasonic nebulizer 사용하여 단계적으로 7분간 흡입하고 큰 호흡을 한 후 기침을 유도하여 하부 기도의 분비물을 얻는 방법을 사용하였다.
성능/효과
- 04)(그림 1), 세포 생존률에서는 각 군간의 차이를 볼 수 없었다(그림 2). Cytospin으로 400개의 세포를 분별검사하여 세포의 분획을 비교하였을 때 기관지천식에서 호산구가 16.86 ±3.99 %로 유의하게 증가되어 있었으며(p = 0.01), 만성기관지염과 기관지확장증에서는 호중구의 증가가 유의하였다(p<0.05) (그림 3).
- 기관지확장증에서 전체세포수가 천식과 만성기관지염 에 비하여 유의한 증가를 보였으며 분별검사에서 천식 환자에서는 호산구의 증가를, 기관지확장증과 만성기관지염 환자에서는 호중구의 증가를 확인하였다. 환자의 임상적인 특징과 객담에서 측정된 전체 세포수와 생존률 그리고 세포분획과 비교에서 상관관계를 발견할 수 없었다.
- 본 연구에서 이용한 단클론항체 HMO2는 서울대학교 약학대학31에서 제공된 사람의 객담의 mucin에 대한 항체로 향후 임상적 이용의 가 능성이 높다. 기도 내 mucin 단백과 반응하는지를 검증하는 과정으로서 HMQ;를 1차 항체로 반응시켜 western blot과 PAS 염색으로 확인하였을 때, 4%의 stacking gel에서 주로 반응함을 알 수 있었으며 이는 표식자로 사용된 220,000 dalton의 띠보다 상부 에 위치하여 HMOz가 고분자의 단백과 반응함을 확인 할 수 있었고, 또한 탄수화물이 부착되어있는 당단백 여부를 확인하기 위하여 PAS염색을 하였을 때 stacking gel과 separating gel 모두에서 반응하였으 나 그 중 stacking gel에서 진한 염색을 확인하여 이는 HMO2와 반응하는 epitope가 단백과 당이 포함된 물질, mucin임을 알 수 있었다.
- 만성기도질환의 객담의 분석은 객관적인 질환별 감별 평가에 이용될 수 있는 가능성을 보여주고 있으며 객담 내 mucin의 분비는 세포의 생존률이 영향을 주는 것으로 판단된다.
- 객담에서 주로 연구되는 분야는 천식이며 만성기관 지염이나 기관지확장증에서 객담을 분석한 보고는 아직 많지 않다. 본 연구에서 만성기도질환의 전체세포의 수를 비교하였을 때 기관지확장증에서 유의한 증가를 확인하였는데 이는 세균감염에 의한 것으로 추정되었다. 세포분별검사에서는 천식에서 호산구가 타 질환 에 비하여 유의하게 증가하였고 이는 기존의 보고들과 일치하는 소견이었으며 만성기관지염과 기관지확장증 에서는 천식에 비하여 호중구가 유의하게 증가한 것을 확인하였다.
- 분별검사를 하여 얻은 백혈구 분획과 기도내의 상피 세포가 mucin에 영향을 주는지 알아보고자 상관관계 를 비교하였을 때 특정 백혈구나 상피세포가 mucin 의 분비에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다. 즉 백혈구 비, 전체세포와 백혈구 분획을 곱하여 얻은 세 포수, 그리고 전체세포수 ×생존률 × 백혈구 분획을 계산하여 얻은 수치와도 상관관계를 발견할 수 없었다.
- 본 연구에서 만성기도질환의 전체세포의 수를 비교하였을 때 기관지확장증에서 유의한 증가를 확인하였는데 이는 세균감염에 의한 것으로 추정되었다. 세포분별검사에서는 천식에서 호산구가 타 질환 에 비하여 유의하게 증가하였고 이는 기존의 보고들과 일치하는 소견이었으며 만성기관지염과 기관지확장증 에서는 천식에 비하여 호중구가 유의하게 증가한 것을 확인하였다. 일부 연구에서는 천식의 급성 발작시 객담분석을 하였을 때 호중구가 증가한다고 보고되었는데, 본 연구에서도 호산구 보다는 호중구의 급격한 증가를 보인 예가 있었다.
- 를 1차 항체로 하여 Western blot으로 검증하였을 때 주로 stacking gel 에서 진한 band를 보였으며 이는 반응하는 단백의 분자량이 수십만 dalton임을 확인할 수 있었다(그림 4). 이 membrane을 탄수화물의 염색에 사용되는 PAS염색을 하였을 때 western blot에서 보였던 부위와 같은 부위에서 붉게 염색됨을 확인하여 1차 항체 HMO2에 반응하는 단백과 탄수화물임을 확인할 수 있었다 (그 림 5).
- 이러한 실험의 결과로 볼 때 만성기도질환에서 분비되는 객담의 세포검사가 질환별 분류에 도움을 줄 것으로 판단되며, mucin의 분비는 임상적인 특성이나 객담세포의 분획이 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었으며 세포의 생존률에 의하여 영향을 받는 것으로 판단된다. 향후 세포의 자연사에서 분비되는 매개체와 mucin의 분비에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 기관지천식, 기관지확장증, 만성기관지염에서 얻은 객담을 점액성 객담, 점액과 농성이 흔재된 객담, 그리고 농성객담으로 분류하여 비교하였을 때, 질환별 차이를 발견할 수 없었다. 전체 54례 중 편평상피세포의 비가 20%를 초과하여 효과적인 객담이라고 인정하기 어려운 객담은 없었다. 질환별로 전체세포수의 비교는 기관지확장증에서 타 질환에 비하여 유의한 세포의 증가를 볼 수 있었으며(p=0.
- 분별검사를 하여 얻은 백혈구 분획과 기도내의 상피 세포가 mucin에 영향을 주는지 알아보고자 상관관계 를 비교하였을 때 특정 백혈구나 상피세포가 mucin 의 분비에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다. 즉 백혈구 비, 전체세포와 백혈구 분획을 곱하여 얻은 세 포수, 그리고 전체세포수 ×생존률 × 백혈구 분획을 계산하여 얻은 수치와도 상관관계를 발견할 수 없었다. 얻어진 결과를 바탕으로 다량의 mucin이 분비되는 환자군과 소량의 mucin 이 분비되는 환자군으로 분류하여 임상적 특성과 객담의 특성을 비교하였으나 차이를 얻지 못하였다.
- 전체 54례 중 편평상피세포의 비가 20%를 초과하여 효과적인 객담이라고 인정하기 어려운 객담은 없었다. 질환별로 전체세포수의 비교는 기관지확장증에서 타 질환에 비하여 유의한 세포의 증가를 볼 수 있었으며(p=0.04)(그림 1), 세포 생존률에서는 각 군간의 차이를 볼 수 없었다(그림 2). Cytospin으로 400개의 세포를 분별검사하여 세포의 분획을 비교하였을 때 기관지천식에서 호산구가 16.
- 환자의 임상적인 특징과 객담에서 측정된 전체 세포수와 생존률 그리고 세포분획과 비교에서 상관관계를 발견할 수 없었다. 측정된 mucin은 질환별 차이는 발견할 수 없었으며 세포의 생존률과 mucin의 양과의 역상관관계를 확인할 수 있었으나, 그 밖의 다른 지표사이의 관련은 없었다.
- 전 체 대상환자에서 각 질환별 mucin의 양을 비교하였을 때 통계적으로 유의한 차이는 없었다(그림 7). 환 자에서 채취한 객담을 분석하여 얻은 전체 세포수와 생존률이 mucin분비에 영향을 주는지를 알아보기 위하여 비교하였을 때 생존률이 측정된 뮤신과 역상관관계를 보여주었다(그림 8). 이는 살아있는 세포보다는 죽은 세포에서 뮤신의 분비에 영향을 주는 것으로 추정할 수 있다.
- 환자의 임상적인 특성과 면역효소측정으로 얻어진 mucin과의 상관관계를 비교하였을 때, , 환자의 나이, 흡연, 성별, 그리고 객담내의 단백량과의 비교에서 유의한 상관관계를 발견할 수 없었고(그림 6), 또한 객담이 점액성과 농성으로 분류한 비교에서도 상관관계를 발견할 수 없었다. 이는 임상적인 특성이 기도 내 mucin의 분비에 영향을 주지 않는다는 의미한다.
후속연구
- 그러므로 mucin에 대한 단클론항체를 사용한다면 객담내의 mucin에 대한 검사가 간편하고 빠른 결과를 얻을 수 있음이 최근에 여러 연구에서 발 표되고있다. 본 연구에서 이용한 단클론항체 HMO2는 서울대학교 약학대학31에서 제공된 사람의 객담의 mucin에 대한 항체로 향후 임상적 이용의 가 능성이 높다. 기도 내 mucin 단백과 반응하는지를 검증하는 과정으로서 HMQ;를 1차 항체로 반응시켜 western blot과 PAS 염색으로 확인하였을 때, 4%의 stacking gel에서 주로 반응함을 알 수 있었으며 이는 표식자로 사용된 220,000 dalton의 띠보다 상부 에 위치하여 HMOz가 고분자의 단백과 반응함을 확인 할 수 있었고, 또한 탄수화물이 부착되어있는 당단백 여부를 확인하기 위하여 PAS염색을 하였을 때 stacking gel과 separating gel 모두에서 반응하였으 나 그 중 stacking gel에서 진한 염색을 확인하여 이는 HMO2와 반응하는 epitope가 단백과 당이 포함된 물질, mucin임을 알 수 있었다.
- 즉 백혈구 비, 전체세포와 백혈구 분획을 곱하여 얻은 세 포수, 그리고 전체세포수 ×생존률 × 백혈구 분획을 계산하여 얻은 수치와도 상관관계를 발견할 수 없었다. 얻어진 결과를 바탕으로 다량의 mucin이 분비되는 환자군과 소량의 mucin 이 분비되는 환자군으로 분류하여 임상적 특성과 객담의 특성을 비교하였으나 차이를 얻지 못하였다.
- 이러한 실험의 결과로 볼 때 만성기도질환에서 분비되는 객담의 세포검사가 질환별 분류에 도움을 줄 것으로 판단되며, mucin의 분비는 임상적인 특성이나 객담세포의 분획이 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었으며 세포의 생존률에 의하여 영향을 받는 것으로 판단된다. 향후 세포의 자연사에서 분비되는 매개체와 mucin의 분비에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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