연구배경 : 만성기도질환에서 객담내 세포의 성상이 변화가 있다는 것은 이미 알려져 있으며 mucin의 분비가 증가한다는 것은 잘 알려진 사실이나 임상적인 이용이 제한되어 왔다. 만성기도질환 환자의 객담내 세포성상과 임상적 특성을 단클론항체($HMO_2$)를 이용하여 측정 된 mucin이 상관관계가 있는지를 알아보고자 하였다. 방법 : 최근 개발된 mucin에 대한 단클론항체를 사용하여 만성기도질환환자를 대상으로 객담의 세포분석과 mucin의 양을 측정하였다. 자발적 배출된 객당과 고장성 생리식염수를 이용한 유도객담으로 얻은 검체를 처리하여 전체 세포수와 생존률을 측정하였으며 분별 검사를 하였다. 단클론항체 $HMO_2$가 객담내의 당단백인 mucin과 반응함을 확인하기 위하여 Western blot과 PAS 영색으로 검증하였다. 검증된 단클론항체를 이용하여 면역효소측정으로 mucin을 정량하였다. 또한 연구결과와 환자의 입상적인 특성과 상관관계를 규명하였다. 결과 : 기관지확장증에서 전체세포수가 천식과 만성기관지염에 비하여 유의한 증가를 보였으며 분별검사에서 천식 환자에서는 호산구외 증가를, 기관지확장증과 만성기관지염 환자에서는 호중구의 증가를 확인하였다. 환자의 임상적인 특징과 객담에서 측정된 전체 세포수와 생존률 그리고 세포분획과 비교에서 상관관계를 발견 할 수 없었다. 측정된 mucin은 질환별 차이는 발견할 수 없었으며 세포의 생존률과 mucin의 양과의 역상관관계를 확인할 수 있었으나, 그 밖의 다른 지표사이의 관련은 없었다. 결론 : 만성기도질환의 객담의 분석은 객관적인 질환별 감별 평가에 이용될 수 있는 가능성올 보여주고 있으며 객담내 mucin의 분비는 세포의 생존률이 영향을 주는 것으로 판단된다.
연구배경 : 만성기도질환에서 객담내 세포의 성상이 변화가 있다는 것은 이미 알려져 있으며 mucin의 분비가 증가한다는 것은 잘 알려진 사실이나 임상적인 이용이 제한되어 왔다. 만성기도질환 환자의 객담내 세포성상과 임상적 특성을 단클론항체($HMO_2$)를 이용하여 측정 된 mucin이 상관관계가 있는지를 알아보고자 하였다. 방법 : 최근 개발된 mucin에 대한 단클론항체를 사용하여 만성기도질환환자를 대상으로 객담의 세포분석과 mucin의 양을 측정하였다. 자발적 배출된 객당과 고장성 생리식염수를 이용한 유도객담으로 얻은 검체를 처리하여 전체 세포수와 생존률을 측정하였으며 분별 검사를 하였다. 단클론항체 $HMO_2$가 객담내의 당단백인 mucin과 반응함을 확인하기 위하여 Western blot과 PAS 영색으로 검증하였다. 검증된 단클론항체를 이용하여 면역효소측정으로 mucin을 정량하였다. 또한 연구결과와 환자의 입상적인 특성과 상관관계를 규명하였다. 결과 : 기관지확장증에서 전체세포수가 천식과 만성기관지염에 비하여 유의한 증가를 보였으며 분별검사에서 천식 환자에서는 호산구외 증가를, 기관지확장증과 만성기관지염 환자에서는 호중구의 증가를 확인하였다. 환자의 임상적인 특징과 객담에서 측정된 전체 세포수와 생존률 그리고 세포분획과 비교에서 상관관계를 발견 할 수 없었다. 측정된 mucin은 질환별 차이는 발견할 수 없었으며 세포의 생존률과 mucin의 양과의 역상관관계를 확인할 수 있었으나, 그 밖의 다른 지표사이의 관련은 없었다. 결론 : 만성기도질환의 객담의 분석은 객관적인 질환별 감별 평가에 이용될 수 있는 가능성올 보여주고 있으며 객담내 mucin의 분비는 세포의 생존률이 영향을 주는 것으로 판단된다.
Background : In chronic airway disease, mucus secretion is increased, but extraction of mucin, which is the main component of mucus secretion, is a very complicated and limited in clinical use. Recently, monoclonal antibody for mucin was developed for possible clinical use. In this study, cellular a...
Background : In chronic airway disease, mucus secretion is increased, but extraction of mucin, which is the main component of mucus secretion, is a very complicated and limited in clinical use. Recently, monoclonal antibody for mucin was developed for possible clinical use. In this study, cellular analysis and quantification of respiratory mucin in sputum of patients with chronic airway diseases were performed. Method : Sputum was collected from patients with asthma(n=33), bronchiectasis(n=8) or chronic bronchitis (n=13) by spontaneous expectoration or by hypertonic saline induction. Collected sputums was treated by 0.1% dithiotreitol to dissociate the disulfide bond of the mucus and filtered through a nylon gauze. Total cell count, viability and differential count were measured. For detection of mucin, collected samples were treated with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and then with monoclonal antibody(HMO2), as the primary antibody, and PAS stain. The amount of mucin was measured with ELISA by HMO2. Correlation with clinical information, cellular analysis, and amount of measured mucin were analyzed. Results : Total cell counts of sputum were significantly increased in patients with bronchiectasis but viability remained the same. Eosinophils were significantly increased in patients with asthma, neutrophils in bronchiectasis chronic bronchitis, respectively (p<0.05). The results of Western blotting and PAS staining confirmed the presence of glycoproteins and matched? with mucin. The amounts of mucin measured by ELISA were not significantly different among the disease groups. Significant correlation was identified between the amount of mucin and viability(r=-0.482, p<0.05). Conclusion : Inflammatory cells in the sputum of those with chronic airway disease were different for each disease type. Measurement of mucin by ELISA via monoclonal antibodies may be a simple method for the evaluation of chronic airway disease.
Background : In chronic airway disease, mucus secretion is increased, but extraction of mucin, which is the main component of mucus secretion, is a very complicated and limited in clinical use. Recently, monoclonal antibody for mucin was developed for possible clinical use. In this study, cellular analysis and quantification of respiratory mucin in sputum of patients with chronic airway diseases were performed. Method : Sputum was collected from patients with asthma(n=33), bronchiectasis(n=8) or chronic bronchitis (n=13) by spontaneous expectoration or by hypertonic saline induction. Collected sputums was treated by 0.1% dithiotreitol to dissociate the disulfide bond of the mucus and filtered through a nylon gauze. Total cell count, viability and differential count were measured. For detection of mucin, collected samples were treated with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and then with monoclonal antibody(HMO2), as the primary antibody, and PAS stain. The amount of mucin was measured with ELISA by HMO2. Correlation with clinical information, cellular analysis, and amount of measured mucin were analyzed. Results : Total cell counts of sputum were significantly increased in patients with bronchiectasis but viability remained the same. Eosinophils were significantly increased in patients with asthma, neutrophils in bronchiectasis chronic bronchitis, respectively (p<0.05). The results of Western blotting and PAS staining confirmed the presence of glycoproteins and matched? with mucin. The amounts of mucin measured by ELISA were not significantly different among the disease groups. Significant correlation was identified between the amount of mucin and viability(r=-0.482, p<0.05). Conclusion : Inflammatory cells in the sputum of those with chronic airway disease were different for each disease type. Measurement of mucin by ELISA via monoclonal antibodies may be a simple method for the evaluation of chronic airway disease.
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문제 정의
만성기도질환에서 객담내 세포의 성상이 변화가 있다 는 것은 이미 알려져 있으며 mucin의 분비가 증가한다는 것은 잘 알려진 사실이나 임상적인 이용이 제한되어 왔다. 만성기도질환 환자의 객담내 세포성상과 임상적 특성을 단클론항체 (HMO2)를 이용하여 측정된 mucin이 상관관계가 있는지를 알아보고자 하였 다.
제안 방법
이러한 방어기 전에 중요한 역할을 하는 기도점액은 중요한 구성성분 으로 mucin이 있으며 이 mucin은 매우 다양한 구조 를 지니고 있는 거대분자로서 각종 유해자극들이나, 만성 기관지염, 천식 등의 질환에서 분비세포수가 증 가하고, 분비량이 증가되며 증가된 점액은 객담의 형 태로 배출된다有. 기도 mucin에 대한 정량을 위해서 는 단세포군항체 (Monoclonal antibodyX 이용한 면역정량법이 매우 간편하며 또한 임상적인 이용의 어 느 정도 현실화되고 있다"I 이에 저자들은 만성기도 질환 환자의 객담을 채취하여 객담세포의 성상이 질환 별 차이가 있는지를 알아보았고, 객담세포의 성상과 환자의 임상적 특성이 단클론항체를 이용한 mucin의 양과 연관이 있는지를 비교 분석하였다.
Mucin의 면역효소측정을 위한 검체의 처리는 전체 용액의 1/10의 용량에 해당하는 0.5 M sodium acetate와 20% sodium dodecyl sulfide (SDS)를 넣어 최종 농도가 50 mM sodium cetate, 0.1% SDS가 되도록 하였다. 이것을 100℃ 에서 중탕으로 3분간 처리한 후 용액 중 100µ를 분리하여 증류수 900µ 에 넣어 전체 용량을 1 ml로 하여 단백 농도를 Lowry 법으로 측정하고 남은 검체는 -70℃에 저장 하였다.
Peroxidase labeled goat anti-mouse immunoglobulin을 1 : 5000으로 희석하여 동량을 넣어 32℃에서 1시간 배양하고 5회 세척하였다. TMB (tetramethyl benzidine)로 발색시킨 후 650 nm에서 optical density를 분석하고 stop solution 투여 후 450 nm에서 optical density를 측정하였다. 이 값을 standard curve의 값과 비교하여 검체의 mucin 농도를 측정하였다.
이는 3%, 4%, 5%의 고장성 생리식염수를 ultrasonic nebulizer 사용하여 단계적으로 7분간 흡입하고 큰 호흡을 한 후 기침을 유도하여 하부 기도의 분비물을 얻는 방법을 사용하였다. 객담에서 타액성분을 포함한 수분을 탈지면에 흡수시킨 후 점액성분만을 겸자를 사용하여 선택적으로 얻어낸 후 무게를 측정하였다. 객담성분의 균등한 분포를 위하여 0.
단클론항체 HMO2가 객담내의 당단백인 mucin과 반응함을 확인하기 위하여 Western blot과 PAS 염색으로 검증하였다. 검증된 단클론항체 를 이용하여 면역효소측정으로 mucin을 정량하였다. 또한 연구결과와 환자의 임상적인 특성과 상관관계를 규명하였다.
여 전체 세포수와 생존률을 측정하였으며 분별 검사를 하였다. 단클론항체 HMO2가 객담내의 당단백인 mucin과 반응함을 확인하기 위하여 Western blot과 PAS 염색으로 검증하였다. 검증된 단클론항체 를 이용하여 면역효소측정으로 mucin을 정량하였다.
검증된 단클론항체 를 이용하여 면역효소측정으로 mucin을 정량하였다. 또한 연구결과와 환자의 임상적인 특성과 상관관계를 규명하였다.
41μm격자 의 Nylon gauze(Fisher, USA)에 부어서 불순물을 제거하고 전체세포수cell cgnL)와 Trypan blue exclusion method를 사용하여 세포의 생존률(viability)을 측정하였다. 또한105/ml의 세포 60 M를 450 rpm, 6분간 cytospin (Shandon, USA)에서 회전시켜 세포룰 고정시킨 후 Diff- Quick 염색을 하여 전체 400개의 세포를 분별검사 를 실시하였다. 이때 편평상피세포가 20%이상이면 불충분한 검체로 판정하여 검사에서 제외하였다.
자발적 배출된 객담과 고장성 생리식염수를 이용한 유도객담으로 얻은 검체를 처리히.여 전체 세포수와 생존률을 측정하였으며 분별 검사를 하였다. 단클론항체 HMO2가 객담내의 당단백인 mucin과 반응함을 확인하기 위하여 Western blot과 PAS 염색으로 검증하였다.
이때 DTT는 객담의 뮤신 성분의 disulfide bond를 끊어 뮤신 성분을 환원형으로 변화시켜준다고 알려져 있다. 육안적으로 보아 개담내의 고형 성분 즉 객담이 완전히 녹은 것을 확인한 후 검체 내의 DTT 성분을 희석시켜 없애기 위하여 5배의 PBS를 넣어, 객담을 10배 용량으로 희석하였다. 41μm격자 의 Nylon gauze(Fisher, USA)에 부어서 불순물을 제거하고 전체세포수cell cgnL)와 Trypan blue exclusion method를 사용하여 세포의 생존률(viability)을 측정하였다.
TMB (tetramethyl benzidine)로 발색시킨 후 650 nm에서 optical density를 분석하고 stop solution 투여 후 450 nm에서 optical density를 측정하였다. 이 값을 standard curve의 값과 비교하여 검체의 mucin 농도를 측정하였다.
자연 객담 배출이 적어 객담을 얻기 힘든 환자와 호흡기계 질환이 없는 경우 객담을 얻는 방법으로서 고장성 생리식염수를 흡인하여 얻는 유도객담방법을 이용하였다. 이는 3%, 4%, 5%의 고장성 생리식염수를 ultrasonic nebulizer 사용하여 단계적으로 7분간 흡입하고 큰 호흡을 한 후 기침을 유도하여 하부 기도의 분비물을 얻는 방법을 사용하였다. 객담에서 타액성분을 포함한 수분을 탈지면에 흡수시킨 후 점액성분만을 겸자를 사용하여 선택적으로 얻어낸 후 무게를 측정하였다.
Membrane을 TBS-Tween으로 세척한 후, 1 : 3000의 농도로 회석한 2차 항체 (HRP-la-belled goat anti-mouse Immunoglobulin) S 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어 TBS-Tween으로 세척하여, detection solution (enhanced chemilu minescence detection system : ECL)으로 처리 후 film에 감작시켜 autoradiogram을 얻었다.
최근 개발된 mucin에 대한 단클론항체를 사용하여 만성기도질환환자를 대상으로 객담의 세포분석과 mucin의 양을 측정하였다. 자발적 배출된 객담과 고장성 생리식염수를 이용한 유도객담으로 얻은 검체를 처리히.여 전체 세포수와 생존률을 측정하였으며 분별 검사를 하였다.
최근 개발된 mucin에 대한 단클론항체를 사용하여 만성기도질환환자를 대상으로 객담의 세포분석과 mucin의 양을 측정하였다. 자발적 배출된 객담과 고장성 생리식염수를 이용한 유도객담으로 얻은 검체를 처리히.
대상 데이터
1998년 1월부터 1998년 12월까지 순천향대학병원 에 내원한 임상증상과 질환별 특이검사로서 확진된 기관지천식 , 만성기관지염 , 기관지확장증의 만성기도질 환 환자 54명을 대상으로 하였다. 질환별 분포를 보면 기관지천식 33명, 기관지확장증 8명, 만성기관지염 13명이었다.
서울대학교 약학대학교실에서 제공한 인체 기도에서 추출한 mucin을 Ca2+과 #이 들어있지 않은 pH 7.4의 PBS로 희석하여 0, 0.1, 0.25, 1, 2.5, 10 ng/ ml의 농도로 준비하였다.
데이터처리
3. 통계분석
통계적인 분석은 statistical package for the social sciences (SPSS) 를 이용하여 ANOVA 와 MannWhitney U test, Pearson Correlation를 이용하였으며 중앙값과 평균 및 표준오차로 표시하였으며, p값이 0.05 미만인 경우를 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
육안적으로 보아 개담내의 고형 성분 즉 객담이 완전히 녹은 것을 확인한 후 검체 내의 DTT 성분을 희석시켜 없애기 위하여 5배의 PBS를 넣어, 객담을 10배 용량으로 희석하였다. 41μm격자 의 Nylon gauze(Fisher, USA)에 부어서 불순물을 제거하고 전체세포수cell cgnL)와 Trypan blue exclusion method를 사용하여 세포의 생존률(viability)을 측정하였다. 또한105/ml의 세포 60 M를 450 rpm, 6분간 cytospin (Shandon, USA)에서 회전시켜 세포룰 고정시킨 후 Diff- Quick 염색을 하여 전체 400개의 세포를 분별검사 를 실시하였다.
단클론항체가 기도 분비물 내 muciri의 단백과 반응하는 가를 Western blot을 이용하여 측정하였다. 환자의 처리된 기도 검체에 5 Laemli buffer (pH 6.
1% SDS가 되도록 하였다. 이것을 100℃ 에서 중탕으로 3분간 처리한 후 용액 중 100µ를 분리하여 증류수 900µ 에 넣어 전체 용량을 1 ml로 하여 단백 농도를 Lowry 법으로 측정하고 남은 검체는 -70℃에 저장 하였다.
객담이 있는 만성 호흡기 질환환자는 구강을 깨끗한 물로 헹군 후 큰 기침을 하여 하부 기도의 분비물을 얻었다. 자연 객담 배출이 적어 객담을 얻기 힘든 환자와 호흡기계 질환이 없는 경우 객담을 얻는 방법으로서 고장성 생리식염수를 흡인하여 얻는 유도객담방법을 이용하였다. 이는 3%, 4%, 5%의 고장성 생리식염수를 ultrasonic nebulizer 사용하여 단계적으로 7분간 흡입하고 큰 호흡을 한 후 기침을 유도하여 하부 기도의 분비물을 얻는 방법을 사용하였다.
성능/효과
04)(그림 1), 세포 생존률에서는 각 군간의 차이를 볼 수 없었다(그림 2). Cytospin으로 400개의 세포를 분별검사하여 세포의 분획을 비교하였을 때 기관지천식에서 호산구가 16.86 ±3.99 %로 유의하게 증가되어 있었으며(p = 0.01), 만성기관지염과 기관지확장증에서는 호중구의 증가가 유의하였다(p<0.05) (그림 3).
기관지확장증에서 전체세포수가 천식과 만성기관지염 에 비하여 유의한 증가를 보였으며 분별검사에서 천식 환자에서는 호산구의 증가를, 기관지확장증과 만성기관지염 환자에서는 호중구의 증가를 확인하였다. 환자의 임상적인 특징과 객담에서 측정된 전체 세포수와 생존률 그리고 세포분획과 비교에서 상관관계를 발견할 수 없었다.
본 연구에서 이용한 단클론항체 HMO2는 서울대학교 약학대학31에서 제공된 사람의 객담의 mucin에 대한 항체로 향후 임상적 이용의 가 능성이 높다. 기도 내 mucin 단백과 반응하는지를 검증하는 과정으로서 HMQ;를 1차 항체로 반응시켜 western blot과 PAS 염색으로 확인하였을 때, 4%의 stacking gel에서 주로 반응함을 알 수 있었으며 이는 표식자로 사용된 220,000 dalton의 띠보다 상부 에 위치하여 HMOz가 고분자의 단백과 반응함을 확인 할 수 있었고, 또한 탄수화물이 부착되어있는 당단백 여부를 확인하기 위하여 PAS염색을 하였을 때 stacking gel과 separating gel 모두에서 반응하였으 나 그 중 stacking gel에서 진한 염색을 확인하여 이는 HMO2와 반응하는 epitope가 단백과 당이 포함된 물질, mucin임을 알 수 있었다.
만성기도질환의 객담의 분석은 객관적인 질환별 감별 평가에 이용될 수 있는 가능성을 보여주고 있으며 객담 내 mucin의 분비는 세포의 생존률이 영향을 주는 것으로 판단된다.
객담에서 주로 연구되는 분야는 천식이며 만성기관 지염이나 기관지확장증에서 객담을 분석한 보고는 아직 많지 않다. 본 연구에서 만성기도질환의 전체세포의 수를 비교하였을 때 기관지확장증에서 유의한 증가를 확인하였는데 이는 세균감염에 의한 것으로 추정되었다. 세포분별검사에서는 천식에서 호산구가 타 질환 에 비하여 유의하게 증가하였고 이는 기존의 보고들과 일치하는 소견이었으며 만성기관지염과 기관지확장증 에서는 천식에 비하여 호중구가 유의하게 증가한 것을 확인하였다.
분별검사를 하여 얻은 백혈구 분획과 기도내의 상피 세포가 mucin에 영향을 주는지 알아보고자 상관관계 를 비교하였을 때 특정 백혈구나 상피세포가 mucin 의 분비에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다. 즉 백혈구 비, 전체세포와 백혈구 분획을 곱하여 얻은 세 포수, 그리고 전체세포수 ×생존률 × 백혈구 분획을 계산하여 얻은 수치와도 상관관계를 발견할 수 없었다.
본 연구에서 만성기도질환의 전체세포의 수를 비교하였을 때 기관지확장증에서 유의한 증가를 확인하였는데 이는 세균감염에 의한 것으로 추정되었다. 세포분별검사에서는 천식에서 호산구가 타 질환 에 비하여 유의하게 증가하였고 이는 기존의 보고들과 일치하는 소견이었으며 만성기관지염과 기관지확장증 에서는 천식에 비하여 호중구가 유의하게 증가한 것을 확인하였다. 일부 연구에서는 천식의 급성 발작시 객담분석을 하였을 때 호중구가 증가한다고 보고되었는데, 본 연구에서도 호산구 보다는 호중구의 급격한 증가를 보인 예가 있었다.
를 1차 항체로 하여 Western blot으로 검증하였을 때 주로 stacking gel 에서 진한 band를 보였으며 이는 반응하는 단백의 분자량이 수십만 dalton임을 확인할 수 있었다(그림 4). 이 membrane을 탄수화물의 염색에 사용되는 PAS염색을 하였을 때 western blot에서 보였던 부위와 같은 부위에서 붉게 염색됨을 확인하여 1차 항체 HMO2에 반응하는 단백과 탄수화물임을 확인할 수 있었다 (그 림 5).
이러한 실험의 결과로 볼 때 만성기도질환에서 분비되는 객담의 세포검사가 질환별 분류에 도움을 줄 것으로 판단되며, mucin의 분비는 임상적인 특성이나 객담세포의 분획이 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었으며 세포의 생존률에 의하여 영향을 받는 것으로 판단된다. 향후 세포의 자연사에서 분비되는 매개체와 mucin의 분비에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
기관지천식, 기관지확장증, 만성기관지염에서 얻은 객담을 점액성 객담, 점액과 농성이 흔재된 객담, 그리고 농성객담으로 분류하여 비교하였을 때, 질환별 차이를 발견할 수 없었다. 전체 54례 중 편평상피세포의 비가 20%를 초과하여 효과적인 객담이라고 인정하기 어려운 객담은 없었다. 질환별로 전체세포수의 비교는 기관지확장증에서 타 질환에 비하여 유의한 세포의 증가를 볼 수 있었으며(p=0.
분별검사를 하여 얻은 백혈구 분획과 기도내의 상피 세포가 mucin에 영향을 주는지 알아보고자 상관관계 를 비교하였을 때 특정 백혈구나 상피세포가 mucin 의 분비에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다. 즉 백혈구 비, 전체세포와 백혈구 분획을 곱하여 얻은 세 포수, 그리고 전체세포수 ×생존률 × 백혈구 분획을 계산하여 얻은 수치와도 상관관계를 발견할 수 없었다. 얻어진 결과를 바탕으로 다량의 mucin이 분비되는 환자군과 소량의 mucin 이 분비되는 환자군으로 분류하여 임상적 특성과 객담의 특성을 비교하였으나 차이를 얻지 못하였다.
전체 54례 중 편평상피세포의 비가 20%를 초과하여 효과적인 객담이라고 인정하기 어려운 객담은 없었다. 질환별로 전체세포수의 비교는 기관지확장증에서 타 질환에 비하여 유의한 세포의 증가를 볼 수 있었으며(p=0.04)(그림 1), 세포 생존률에서는 각 군간의 차이를 볼 수 없었다(그림 2). Cytospin으로 400개의 세포를 분별검사하여 세포의 분획을 비교하였을 때 기관지천식에서 호산구가 16.
환자의 임상적인 특징과 객담에서 측정된 전체 세포수와 생존률 그리고 세포분획과 비교에서 상관관계를 발견할 수 없었다. 측정된 mucin은 질환별 차이는 발견할 수 없었으며 세포의 생존률과 mucin의 양과의 역상관관계를 확인할 수 있었으나, 그 밖의 다른 지표사이의 관련은 없었다.
전 체 대상환자에서 각 질환별 mucin의 양을 비교하였을 때 통계적으로 유의한 차이는 없었다(그림 7). 환 자에서 채취한 객담을 분석하여 얻은 전체 세포수와 생존률이 mucin분비에 영향을 주는지를 알아보기 위하여 비교하였을 때 생존률이 측정된 뮤신과 역상관관계를 보여주었다(그림 8). 이는 살아있는 세포보다는 죽은 세포에서 뮤신의 분비에 영향을 주는 것으로 추정할 수 있다.
환자의 임상적인 특성과 면역효소측정으로 얻어진 mucin과의 상관관계를 비교하였을 때, , 환자의 나이, 흡연, 성별, 그리고 객담내의 단백량과의 비교에서 유의한 상관관계를 발견할 수 없었고(그림 6), 또한 객담이 점액성과 농성으로 분류한 비교에서도 상관관계를 발견할 수 없었다. 이는 임상적인 특성이 기도 내 mucin의 분비에 영향을 주지 않는다는 의미한다.
후속연구
그러므로 mucin에 대한 단클론항체를 사용한다면 객담내의 mucin에 대한 검사가 간편하고 빠른 결과를 얻을 수 있음이 최근에 여러 연구에서 발 표되고있다. 본 연구에서 이용한 단클론항체 HMO2는 서울대학교 약학대학31에서 제공된 사람의 객담의 mucin에 대한 항체로 향후 임상적 이용의 가 능성이 높다. 기도 내 mucin 단백과 반응하는지를 검증하는 과정으로서 HMQ;를 1차 항체로 반응시켜 western blot과 PAS 염색으로 확인하였을 때, 4%의 stacking gel에서 주로 반응함을 알 수 있었으며 이는 표식자로 사용된 220,000 dalton의 띠보다 상부 에 위치하여 HMOz가 고분자의 단백과 반응함을 확인 할 수 있었고, 또한 탄수화물이 부착되어있는 당단백 여부를 확인하기 위하여 PAS염색을 하였을 때 stacking gel과 separating gel 모두에서 반응하였으 나 그 중 stacking gel에서 진한 염색을 확인하여 이는 HMO2와 반응하는 epitope가 단백과 당이 포함된 물질, mucin임을 알 수 있었다.
즉 백혈구 비, 전체세포와 백혈구 분획을 곱하여 얻은 세 포수, 그리고 전체세포수 ×생존률 × 백혈구 분획을 계산하여 얻은 수치와도 상관관계를 발견할 수 없었다. 얻어진 결과를 바탕으로 다량의 mucin이 분비되는 환자군과 소량의 mucin 이 분비되는 환자군으로 분류하여 임상적 특성과 객담의 특성을 비교하였으나 차이를 얻지 못하였다.
이러한 실험의 결과로 볼 때 만성기도질환에서 분비되는 객담의 세포검사가 질환별 분류에 도움을 줄 것으로 판단되며, mucin의 분비는 임상적인 특성이나 객담세포의 분획이 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었으며 세포의 생존률에 의하여 영향을 받는 것으로 판단된다. 향후 세포의 자연사에서 분비되는 매개체와 mucin의 분비에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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