폐결핵진단에서 결핵균 혼합항원을 이용한 혈청학적 검사의 유용성에 관한연구 Evaluation of an ELISA kit for the Serodiagnosis of Pulmonary Tuberculosis by Using Mixed Antigens of Mycobacterium Tuberculosis원문보기
배경 : 현행 도말 및 배양 등의 미생물학적 검사법의 제한점을 보완할 수 있는 신속하고 간편한 결핵진단 방법의 하나로서 가장 많이 연구되어 온 분야가 혈청학적인 방법이다. 이 중 현재까지 결핵의 혈청학적 진단에 유용성이 높은 것을 평가되는 항원의 하나가 38-kDa으로 대표되는 결핵균 분비항원이다. 이 38-kDa을 주항원 성분으로 하여, 간편하게 실험할 수 있도록 kit화된 수입제품이 국내에서 널리 시판되고 있는 실정에서 국내의 회사에서 개발한 ELISA kit(Erum Biotech Co.)를 이용하여 폐결핵의 혈청학적 진단이 얼마나 유용한 지를 평가하고자 하였다. 방법 : 도말 및 배양검사장 균양성으로 진단된 후 항결핵치료를 받고 있는 폐결핵환자 333명(검사당시 균양성 환자 212명, 균음전된 환자 121명), 건강 성인 80명, 그리고 국립마산결핵병원에서 1년 이상 근무하며 환자와 접촉을 자주 하게되는 접촉군 61명 등 총 474명을 대상으로 하여 결핵의 혈청학적 진단용 ELISA kit를 이용하여 시험하였다. 결과 : 1) 균양성 활동성 폐결핵환자 212명에 대한 ELISA kit의 양성반응률은 82.1%, 균음성 활동성 폐결핵환자 121명에 대한 양성반응률은 73.6%로 이 두 군 사이에는 통계학적으로 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 2) 접촉 대조군 61명에 대한 양성반응률은 14.8%, 건강 대조군 80명에 대한 양성반응률은 2.5%로 이 두 군 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다(plt;0.001). 3) 활동성 폐결핵환자 333명 모두에 대한 양성반응률은 78.90%, 대조군 141명 모두에 대한 양성반응률은 7.8%로 이 두 군 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.001). 4) ELISA kit의 민감도는 78.9%, 특이도는 97.5%였으며, 유병율이 60.1% 수준일 때의 양성예측율은 96.1%, 음성예측율은 65.0%였다. 결론 : ELISA kit는 민감도나 특이도 면에서 수입시판되고 있는 ICT와 비교할 때 비슷한 결과를 보이며, 전통적으로 결핵을 진단하는 데 사용하던 흉부 X-선 사진, 항산균 염색 및 배양 등과 함께 보조적인 도구로 사용 할 수 있을 것으로 생각된다.
배경 : 현행 도말 및 배양 등의 미생물학적 검사법의 제한점을 보완할 수 있는 신속하고 간편한 결핵진단 방법의 하나로서 가장 많이 연구되어 온 분야가 혈청학적인 방법이다. 이 중 현재까지 결핵의 혈청학적 진단에 유용성이 높은 것을 평가되는 항원의 하나가 38-kDa으로 대표되는 결핵균 분비항원이다. 이 38-kDa을 주항원 성분으로 하여, 간편하게 실험할 수 있도록 kit화된 수입제품이 국내에서 널리 시판되고 있는 실정에서 국내의 회사에서 개발한 ELISA kit(Erum Biotech Co.)를 이용하여 폐결핵의 혈청학적 진단이 얼마나 유용한 지를 평가하고자 하였다. 방법 : 도말 및 배양검사장 균양성으로 진단된 후 항결핵치료를 받고 있는 폐결핵환자 333명(검사당시 균양성 환자 212명, 균음전된 환자 121명), 건강 성인 80명, 그리고 국립마산결핵병원에서 1년 이상 근무하며 환자와 접촉을 자주 하게되는 접촉군 61명 등 총 474명을 대상으로 하여 결핵의 혈청학적 진단용 ELISA kit를 이용하여 시험하였다. 결과 : 1) 균양성 활동성 폐결핵환자 212명에 대한 ELISA kit의 양성반응률은 82.1%, 균음성 활동성 폐결핵환자 121명에 대한 양성반응률은 73.6%로 이 두 군 사이에는 통계학적으로 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 2) 접촉 대조군 61명에 대한 양성반응률은 14.8%, 건강 대조군 80명에 대한 양성반응률은 2.5%로 이 두 군 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다(plt;0.001). 3) 활동성 폐결핵환자 333명 모두에 대한 양성반응률은 78.90%, 대조군 141명 모두에 대한 양성반응률은 7.8%로 이 두 군 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.001). 4) ELISA kit의 민감도는 78.9%, 특이도는 97.5%였으며, 유병율이 60.1% 수준일 때의 양성예측율은 96.1%, 음성예측율은 65.0%였다. 결론 : ELISA kit는 민감도나 특이도 면에서 수입시판되고 있는 ICT와 비교할 때 비슷한 결과를 보이며, 전통적으로 결핵을 진단하는 데 사용하던 흉부 X-선 사진, 항산균 염색 및 배양 등과 함께 보조적인 도구로 사용 할 수 있을 것으로 생각된다.
Background : Recently, serologic techniques for tuberculosis have been developed and some of them, which are focusing on detection of serum antibodies mainly directed against specific 38-kDa Mycobacterium tuberculosis, have already been introduced into the markel. In this study, diagnostic significa...
Background : Recently, serologic techniques for tuberculosis have been developed and some of them, which are focusing on detection of serum antibodies mainly directed against specific 38-kDa Mycobacterium tuberculosis, have already been introduced into the markel. In this study, diagnostic significance of a new serologic test(ELISA kit) for pulmonary tuberculosis was evaluated. Method : Serologic test with newly developed ELISA kit was performed upon 474 individuals, who include 333 active pulmonary tuberculosis patients, 80 healthy cases, and 61 tuberculosis contact cases. This serologic test was based on the ELISA technique and designed to detect antibodies to mixed complex antigens including 38-kDa, which were developed by Erume Biotech Co., Seoul. Active pulmonary tuberculosis was diagnosed by sputum AFB smear and culture methods. Results : The seropositivities using this ELISA kit were 82.1% and 73.6% in smear-positive and negative groups among active pulmonary tuberculosis, respectively. And, it also showed that seronegativities were 97.5% and 85.2% in healthy and contact groups, respectively. As a whole, the results of our study using the ELISA kit as a diagnostic method for pulmonary tuberculosis showed 80.0% sensitivity for active pulmonary tuberculosis, 97.5% specificity, 96.1% positive predictive value, and 65.0% negative predictive value when the prevalence of tuberuclosis in the samples was 60.1%. Conclusion : Our results reveal that the detection of antibody its reaction with 38-kDa antigen of M. tuberculosis is not sufficient to be accepted as single diagnostic method for pulmonary tuberculosis. However, they suggest that ELISA kit may be considered as an adjunctive test to standard diagnostic techniques of pulmonary tuberculosis.
Background : Recently, serologic techniques for tuberculosis have been developed and some of them, which are focusing on detection of serum antibodies mainly directed against specific 38-kDa Mycobacterium tuberculosis, have already been introduced into the markel. In this study, diagnostic significance of a new serologic test(ELISA kit) for pulmonary tuberculosis was evaluated. Method : Serologic test with newly developed ELISA kit was performed upon 474 individuals, who include 333 active pulmonary tuberculosis patients, 80 healthy cases, and 61 tuberculosis contact cases. This serologic test was based on the ELISA technique and designed to detect antibodies to mixed complex antigens including 38-kDa, which were developed by Erume Biotech Co., Seoul. Active pulmonary tuberculosis was diagnosed by sputum AFB smear and culture methods. Results : The seropositivities using this ELISA kit were 82.1% and 73.6% in smear-positive and negative groups among active pulmonary tuberculosis, respectively. And, it also showed that seronegativities were 97.5% and 85.2% in healthy and contact groups, respectively. As a whole, the results of our study using the ELISA kit as a diagnostic method for pulmonary tuberculosis showed 80.0% sensitivity for active pulmonary tuberculosis, 97.5% specificity, 96.1% positive predictive value, and 65.0% negative predictive value when the prevalence of tuberuclosis in the samples was 60.1%. Conclusion : Our results reveal that the detection of antibody its reaction with 38-kDa antigen of M. tuberculosis is not sufficient to be accepted as single diagnostic method for pulmonary tuberculosis. However, they suggest that ELISA kit may be considered as an adjunctive test to standard diagnostic techniques of pulmonary tuberculosis.
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문제 정의
본 연구는 아직 상용화되지는 않았지만 38-kDa 항 원을 포함한 혼합항원으로 구성된 ELISA kit(Erume Biotech Co.)를 이용하여 객담검사에서 항산균 양성으로 진단된 결핵환자 중 계속해서 균양성인 환자, 치료경과 중 균음전화된 환자, 건강군, 그리고 결핵병원에서 1년 이상 근무하며 환자와 접촉을 자주하 게 되는 직원 등을 대상으로 혈청 항체의 존재 유무를 조사하여 이러한 kit가 폐결핵의 진단에 유용하게 이용될 수 있는 지를 알아보고자 하였다.
본 연구에서는 검사 kit의 민감도나 특이도를 판정 하는 데, 정확성을 높이기 위하여 치료개시 전에 객담 도말 양성이었던 활동성 폐결핵환자와 과거 결핵병력이 없으면서 폐병변이 없는 대조군을 대상으로 비교하고자 하였으며, 장기간 활동성 폐결핵환자와 접촉하는 건강 접촉군과의 비교를 통하여 감염가능성이 있는 경우와 활동성 폐결핵환자와의 감별진단의 유용성에 대한 평가를 시도하였다. 객담도말 염색은 가장 쉽고, 빨리 결과를 얻을 수 있어서 결핵의 초기진단에 큰 도움을 주는 검사이지만 검체내에 포함되어 있는 결핵균의 수, 검사자와 검체의 종류 등에 따라서 민감도가 다양하여 이에 저자들은 검체선정 과정에서 객담도말 염색법의 한계를 최소화하기 위하여 3회 이상 연속적으로 도말검사를 실시하였으며, 하나의 검체에서라도 도말양성이면 도말양성군에 포함시켰다.
이 중 현재까지 결핵의 혈청학적 진단에 유용성이 높은 것을 평가되는 항원의 하나가 38-kDa으로 대표되는 결핵균 분비항원이다. 이 38-kDa을 주항원 성분으로 하여, 간편하게 실험할 수 있도록 kit화된 수입제품이 국내에서 널리 시판되고 있는 실정에서 국내의 회사에서 개발한 ELISA kit(Erum Biotech Co.)를 이용하여 폐결핵의 혈청학적 진단이 얼마나 유용한지를 평가하고자 하였다.
제안 방법
ELISA kit(Erume Biotech Co., Seoul, Korea)를 이용한 항체검사는 연구대상의 말초정맥에서 5ml의 전혈을 채취하여 3000rpm에서 원심분리한 후 혈청을 분리하여 설명서의 내용에 따라서 즉시 검사를 시행하였거나, 여의치 않은 경우에는 냉동보관(-20℃) 하였다가 3일 이내에 검사를 시행하였다. 혈청 5μl에 혈청 희석액 495μl을 섞어 혈청을 1 : 100으로 희석하였다.
본 연구에서는 검사 kit의 민감도나 특이도를 판정 하는 데, 정확성을 높이기 위하여 치료개시 전에 객담 도말 양성이었던 활동성 폐결핵환자와 과거 결핵병력이 없으면서 폐병변이 없는 대조군을 대상으로 비교하고자 하였으며, 장기간 활동성 폐결핵환자와 접촉하는 건강 접촉군과의 비교를 통하여 감염가능성이 있는 경우와 활동성 폐결핵환자와의 감별진단의 유용성에 대한 평가를 시도하였다. 객담도말 염색은 가장 쉽고, 빨리 결과를 얻을 수 있어서 결핵의 초기진단에 큰 도움을 주는 검사이지만 검체내에 포함되어 있는 결핵균의 수, 검사자와 검체의 종류 등에 따라서 민감도가 다양하여 이에 저자들은 검체선정 과정에서 객담도말 염색법의 한계를 최소화하기 위하여 3회 이상 연속적으로 도말검사를 실시하였으며, 하나의 검체에서라도 도말양성이면 도말양성군에 포함시켰다. 또한 도말검 사가 배양검사에 비해 정확성이 부족한 것은 사실이지만 3회 이상 연속적으로 객담도말검사를 실시한 경우에는 배양검사와의 일치율이 95%정도이므로20 결핵의 진단 및 경과관찰에는 큰 문제가 되지 않을 것으로 생각되었다.
001). 환자군의 경우에는 객담도말 검사상 양성과 음성으로 나누어 검사결과를 비교하였다. 도말양성의 경우 212명의 환자 중 82%에서 양성반응을 보였으며, 음성의 경우 121명의 환자 중 74%에서 양성반응을 보여 객담 도말검사 상 양성과 음성군 사이에 통계적 유의성은 없었다.
대상 데이터
이 중 212명은 검사시점에 객담 도말검사상 양성이며 121명은 항결핵제 복용 중에 3회 연속으로 실시한 객담 도말검사상 균음전된 상태였다. 건강대조군은 마산시에 소재하는 모 종합병원의 건강검진센터를 방문하여 종합건강검진을 받은 사람들로 과거력상 결핵의 병력이 없고, 흉부 X-선 소견에서도 결핵을 앓은 흔적이 없는 80명을 대상으로 하였다. 병원의 결핵균 노출지역 근무자는 조사 당시 국립마산결핵병원에서 1년 이상 근무한 의사, 간호사 그리고 일반직 직원 가운데 과거력상 결핵병력이 없고 1999년 10월 직장신체검사에서 임상적으로 결핵의 증거가 없다고 판단된 61명을 대상으로 하였다.
결핵환자는 1999년 4월 1일부터 1999년 11월 30일 사이에 국립마산결핵병원에서 입원치료를 받고 있는 활동성 폐결핵환자 333명을 대상으로 하였으며 이들은 모두 입원당시 객담도말 및 배양검사상 양성이었다. 이 중 212명은 검사시점에 객담 도말검사상 양성이며 121명은 항결핵제 복용 중에 3회 연속으로 실시한 객담 도말검사상 균음전된 상태였다.
도말 및 배양검사상 균양성으로 진단된 후 항결핵치료를 받고 있는 폐결핵환자 333명(검사당시 균양성 환자 212명, 균음전된 환자 121명), 건강 성인 80명, 그리고 국립마산결핵병원에서 1년 이상 근무하며 환자와 접촉을 자주 하게되는 접촉군 61명 등 총 474명을 대상으로 하여 결핵의 혈청학적 진단용 ELISA kit를 이용하여 시험하였다.
건강대조군은 마산시에 소재하는 모 종합병원의 건강검진센터를 방문하여 종합건강검진을 받은 사람들로 과거력상 결핵의 병력이 없고, 흉부 X-선 소견에서도 결핵을 앓은 흔적이 없는 80명을 대상으로 하였다. 병원의 결핵균 노출지역 근무자는 조사 당시 국립마산결핵병원에서 1년 이상 근무한 의사, 간호사 그리고 일반직 직원 가운데 과거력상 결핵병력이 없고 1999년 10월 직장신체검사에서 임상적으로 결핵의 증거가 없다고 판단된 61명을 대상으로 하였다.
환자군의 성별, 나이, 결핵 이환기간 및 과거 치료력은 Table 1과 같다. 환자군은 전국의 의료기관에서 균양성인 상태로 본원에 전원되어 입원치료를 받고 있던 환자로 검사시점에 객담 도말검사에서 양성인 환자군 212명, 균음전에 성공한 환자군 121명을 대상으로 하였으며, 환자군의 남녀 성별분포는 남자가 4배 많았지만 건강군과 결핵환자 접촉군의 경우에는 여자가 1.7-3.3배 많았다. 연령분포는 환자군이 평균 45세, 건강군과 접촉군은 37세로 환자군이 평균 8세 정도 많았다.
데이터처리
0 ; SPSS Inc, Chicago, IL, USA)통계 프로그램을 사용하였다. ELISA로 측정된 흡광도는 평균과 표준편차로 표시하였고, 각 군간의 비교는 student t-test를 이용하여 p값을 구하여 p값이 0.05미만인 경우에 통계적 유의성을 인정하였다.
성능/효과
1) 균양성 활동성 폐결핵환자 212명에 대한 ELISA kit의 양성반응률은 82.1%, 균음성 활동성 폐결핵환자 121명에 대한 양성반응률은 73.6%로 이 두 군 사이에는 통계학적으로 유의한 차이가 없었다 (p>0.05).
2) 접촉 대조군 61명에 대한 양성반응률은 14.8 %, 건강 대조군 80명에 대한 양성반응률은 2.5%로 이 두 군 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (p<0.001).
3) 활동성 폐결핵환자 333명 모두에 대한 양성반 응률은 78.90%, 대조군 141명 모두에 대한 양성반응률은 7.8%로 이 두 군 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.001).
4) ELISA kit의 민감도는 78.9%, 특이도는 97.5 %였으며, 유병율이 60.1%,수준일 때의 양성예측율 은 96.1%, 음성예측율은 65.0%였다.
의 보고와 비교할 때 비슷한 양상을 보였다. IgG항체가 치료시 작 첫 3개월 동안 증가하다가 12-16개월 후 서서히 감소21하는 점을 고려하면 치료중인 활동성 폐결핵환자의 경우에는 균상태와 관계없이 비슷한 항체 반응율을 보이는 것으로 생각되었다. 그러나 Jakett 등13은 객담도말양성인 경우 38-kDa에 대한 항체가가 높아 지나 객담도말음성인 활동성 폐결핵환자에서는 23%만이 양성반응을 보였으며, Chan 등22은 객담 도말음성인 경우 38-kDa 항원의 민감도는 16%였다고 보고를 하였다.
객담 도말양성인 폐결핵환자가 치료경과 중 균음전 된 경우와 계속해서 양성인 경우를 비교한 결과 균양성인 경우 항체 양성률은 각각 74%와 82%로 통계적 차이는 보이지 않았지만 균양성 환자에서 다소 높은 항체 양성률을 보였는데 이는 Cole 등14의 보고와 비교할 때 비슷한 양상을 보였다. IgG항체가 치료시 작 첫 3개월 동안 증가하다가 12-16개월 후 서서히 감소21하는 점을 고려하면 치료중인 활동성 폐결핵환자의 경우에는 균상태와 관계없이 비슷한 항체 반응율을 보이는 것으로 생각되었다.
건강 대조군과 결핵환자와 장기간 접촉한 군 사이에는 항체 반응률에 어느 정도 차이가 예상되었으나 본 연구결과 건강대조군의 항체 반응률 2.5%, 접촉자 군 14.8%로 접촉자 군에서 상당히 높은 결과를 보여 (p <0.001) ELISA kit가 결핵발병의 위험요인이 많은 사람들을 찾아내는데 유용한 보조진단법으로 사용될 가능성이 있을 것으로 생각되었다. ICT tuberculosis test를 이용한 장 등19의 보고에서 건강 대조군의 경우 3%의 항체반응률을, 접촉자(병원 종사자)군에서는 2%의 결과를 보여 본 연구결과와는 상당한 차이를 나타내었으며, 김 등24은 과거 결핵치료력이 있었던 경우 항체반응률이 5.
반응이 끝난 microwell plate를 세척액으로 세척을 실시한 후, 결핵균 특이 항원과 결합되어 microwell에 붙어 있는 결핵균 특이 면역글로불린에 대해 특이적인 효소가 부착된 conjugate를 각 well당 200μl씩 넣고 37℃ 에서 1시간 동안 교잡반응시킨 뒤 기질을 넣어 발색시켰다. 검체내의 결핵균 존재 여부는 ELISA로 측정된 흡광도와 양성기춘치를 비교하여 결정하였는데 본 검사에서는 0.30을 양성기준 값으로 결정하여 검체의 흡광도가 0.30이상이면 양성으로, 0.30미만이면 음성으로 판단하였다.
2 %를 보였다. 따라서 전체적으로 감수성 78.9%, 특이도 97.5%, 양성예측도 96.1%, 그리고 음성예측도 65.0% 등을 나타내었다.
, 이들 중 일부는 환경의 오염균일 것으로 추정되기 때문에 대략 10%이하일 것으로 추정된다. 본 연구에서 진단 당시 항산균 염색 및 도말검사에서 양성인 환자의 검체 가운데 21%가 ELISA kit검사에서 음성을 보인 것은 그 중 일부가 NTM에 의한 감염증일 가능성이 있을 것으로 생각되지만 위음성의 가능성도 적지 않음을 고려할 때 본 검사가 폐결핵의 신속 진단방법으로 흉부 X-선 검사나 항산균 염색 및 배양검사 등과 함께 사용할 수는 있어도 이들을 대신할 수는 없을 것으로 생각된다.
후속연구
9%, 폐질환이 없는 건강군에서 항체반응을 보이는 경우는 아무도 없었다고 보고하였 다. 그러나 이러한 비교는 향후 동일한 환자에서 결과를 직접 측정할 수 있어야 임상적 유용성을 객관적으로 평가할 수 있을 것으로 생각된다.
5%를 보여서 폐결핵의 진단방법으로 유용할 것으로 생각되지만 Bayes의 정리에 의하면28 이러한 혈청학적 진단방법의 진단능률은 유병률에 따라서 크게 달라질 수 있으므로 배 등31의 지적처럼 ELISA kit를 포함한 기존의 혈청학적 결핵진단 방법들이 현재 사용중인 도말 및 배양 등의 균검사 방법을 대체할 수 있는 수준이 아님을 간과해서는 안될 것으로 생각된다. 따라서 기존의 전통적으로 결핵을 진단하는데 사용하던 흉부 X-선 사진, 객담 도말 및 배양 검사 등과 함께 보조적인 도구로 사용하면 기존의 방법으로 진단이 불확실하게 판단되는 경우를 포함한 폐결핵의 진단에 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
그러나 Jakett 등13은 객담도말양성인 경우 38-kDa에 대한 항체가가 높아 지나 객담도말음성인 활동성 폐결핵환자에서는 23%만이 양성반응을 보였으며, Chan 등22은 객담 도말음성인 경우 38-kDa 항원의 민감도는 16%였다고 보고를 하였다. 따라서 지역적 혹은 미세한 방법적 차이에 의해서 민감도가 크게 변할 수 있음을 시사하며 이는 혈청학적 검사를 진단에 이용하려면 각 지역마다 혈청학적 검사의 유용성에 대한 검증이 필요할 것으로 여겨진다.
본 연구에서는 검사를 시행한 후 동일한 환자에게서 추구검사를 시행하지 않았기 때문에 치료경과에 따른 항체반응이 어떻게 변해가는지는 알 수 없었다. 향후 이에 대한 연구도 필요할 것으로 생각되며 이러한 연구를 통해서 혈청학적 방법을 통하여 치료경과의 판정에 도움이 될 수 있는 지표를 개발할 가능성도 있을 것으로 기대된다.
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