보고서 정보
주관연구기관 |
(주)프로테옴텍 |
연구책임자 |
김유삼
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2003-05 |
과제시작연도 |
2002 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201300001384 |
과제고유번호 |
1460004560 |
사업명 |
보건의료기술개발사업 |
DB 구축일자 |
2013-05-20
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키워드 |
결핵.진단.프로테오믹스.2차원 전기영동.항원.tuberculosis.diagnosis.proteomics.2D PAGE.antigen.
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초록
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결핵은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의하여 유발되는 만성 감염성 질환으로 전 세계적으로 주요한 질병중의 하나이다. 우리나라의 결핵 유병률은 1995년 전국 실태조사에서 1.0%로 약 40만명의 흉부 X-선 검사상 활동성 결핵 환자가 있는 것으로 보고 되었으며 또한 결핵환자가 매년 증가하는 원인중의 하나는 한국형 결핵균 (K strain)의 출현이라고 보고되었다. 최근 여러 나라에서 다제내성 결핵균주의 출현이 증가함에 따라 결핵에 대한 효과적인 백신 개발의 중요성이 부각되고 있다. 효과적인 백신 및 치료
결핵은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의하여 유발되는 만성 감염성 질환으로 전 세계적으로 주요한 질병중의 하나이다. 우리나라의 결핵 유병률은 1995년 전국 실태조사에서 1.0%로 약 40만명의 흉부 X-선 검사상 활동성 결핵 환자가 있는 것으로 보고 되었으며 또한 결핵환자가 매년 증가하는 원인중의 하나는 한국형 결핵균 (K strain)의 출현이라고 보고되었다. 최근 여러 나라에서 다제내성 결핵균주의 출현이 증가함에 따라 결핵에 대한 효과적인 백신 개발의 중요성이 부각되고 있다. 효과적인 백신 및 치료제의 개발이 결핵 퇴치 전략의 주요 요인으로 자리 잡고 있으며, 특히 현재 사용되는 방법보다 더 신속하고 정확하며 효과적인 새로운 검진 방법의 개발이 필요한 실정이다. 또한, 표준 결핵균 H37Rv 의 3924개의 ORF 유전자 지도 (Sanger Center 의 유전자 분류법)가 밝혀진 이후로, 병원성 결핵의 면역진단 및 백신에 유용한 단백질 항원을 탐색하는 연구가 활발히 진행 되고 있다. 본 연구에서는 현재 상용화되고 있는 혈청진단 검사보다 우월한 검사법을 개발하는데 필요한 결핵균 항원을 탐색하고자 결핵균의 분비성 항원의 프로테옴 분석을 통하여 아직 유용성이 알려지지 않은 단백질을 유전자재조합 기법으로 생산하여 재조합단백질 항원의 혈청진단 유용성을 조사하고자 하였다.
이를 위하여 비병원성 실험용 결핵균 H37Rv strain (H37Rv), 병원성 한국형 결핵균 K strain (K strain), 병원성 미국형 결핵균 CDC1551 strain (CDC1551)의 배양 배지에서 분비되는 항원들의 프로테옴을 이차원전기영동법으로 분석하여 질량분석기(MS)로 동정하였다. 그 결과 K strain에 많이 나타난 항원 (Rv0652, Rv1636, Rv2818c, Rv3369, Rv3865, Rv0566c, MT3304, Rv3160c), K와 H37Rv에 나타난 항원 (Rv3845), K와 CDC1551에 나타난 항원 (Rv0830) 병원성 균주에서 증가하여 발현된 항원 (Rv3874, Rv0560c, Rv3648c)등 총 13종의 항원을 발굴하여 이들의 유전자를 핵산연쇄증폭법으로 K strain의 지놈으로부터 분리하였다. 클로닝된 각각의 유전자를 유전자재조합 기법으로 생산, 정제하여 이들의 유전자 재조합 단백질 항원을 얻었다.
이들을 유전자재조합 단백질로 생산하여 이 중 rRv3369, rRv0566c, rRv3874 (CFP-10)와 외부 기관에서 정제한 rRv0469 (UmaA1), rRv3606 (Folk), rRv2534c(Efp) 단백질과 상품화되어 구입이 가능한 rRv3019c (ESAT-6), rRv2031 (14kDa), rRv0934 (38kDa)등 6개의 유전자 재조합단백질을 본 연구에 이용하였다.
이들 유전자재조합 단백질들을 대상으로 결핵환자 150여명과 건강대조군 100여명의 혈청에서 ELISA를 이용하여 IgG 항체를 검출하였다. 150명의 결핵 환자 중 148명 (98.6%)의 결핵 환자에서 최소 한 개 이상의 유전자재조합 항원에 대한 항체가 검출되었다. 본 연구를 통하여 탐색한 대부분의 유전자재조합 단백질 항원은 공교롭게도 결핵 환자의 혈청에서 항체반응이 상대적으로 낮아 민감도 면에서 사용할 수 없는 항원들과, 높은 양성 반응을 보였으나, 건강대조군의 혈청에서도 역시 높은 양성반응을 보여 특이도면에서 혈청진단 항원으로서 유용성을 기대하기 어려웠다.
다만 rRv3874 (CFP10)과 rRv3369만이 이전에 알려진 항원들과 조합을 이루어 검사를 할 경우 혈청진단검사의 민감도와 특이도를 유의성 있게 향상 시킬 수 있어 향후 산업화에 활용할 수 있음을 확인하였다. 즉 rRv3874 (CFP10) 단백질은 단독으로 사용하였을 때는 민감도 64%, 특이도 97%였으며, rRv3369 단백질은 민감도 66%, 특이도 94%였다. 그러나 rRv3874 (CFP10)항원을 rRv0469(UmaA1)단백질과 동시에 사용할 경우 민감도가 81.3%로 높아졌으며, 특이도는 97%를 유지하였다.
이러한 결과는 rRv0469 (UmaA1)항원 단독으로 사용하였을 때 민감도 71.3%, 특이도 99%와 비교하여 본 연구에서 발굴한 rRv3874(CFP10)를 함께 사용할 경우 특이도면에서는 2%가 감소하지만 민감도에서 10%가량이나 향상되기 때문에 rRv3874의 역할이 그만큼 중요함을 확인할 수 있었다. 한편, 본 연구에서 발굴한 rRv3369항원을 rRv0469항원과 함께 사용할 경우 민감도 88.0%, 특이도 95.0%로 rRv0469를 단독으로 사용할 때보다 특이도면에서 4%가 감소하였으나, 민감도에서 16%이상 높아지기 때문에 rRv3369항원이 매우 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
본 연구결과는 결핵균항원 중 분비성 항원들의 프로테옴 연구를 통하여 발굴한 13개의 유전자재조합 단백질 항원 가운데 rRv3369와 rRv3874 (CFP10) 단백질이 결핵균의 단백질 항원에 대한 항체를 찾아내는데 유용하다는 것을 제시하고 있으며, 현재 상용화되고 있는 주요항원과 함께 조합하여 사용할 경우, 민감도를 향상시킬 수 있다는 것을 말해준다. 따라서 본 연구에서 보여준 다양한 결핵균 특이항원의 조합을 통해 ELISA방법을 사용하여 결핵검진을 시행한다면 신속하고 저렴하게 환자의 건강진단에 매우 유용할 것으로 기대된다.
Abstract
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Tuberculosis (TB), caused by mycobacteria of the tuberculosis complex, mostly Mycobacterium tuberculosis, is a major infectious disease of the respiratory system worldwide. In South Korea, a nationwide survey of TB prevalence in 1995 by chest radiography revealed that 1 % of korean population (about
Tuberculosis (TB), caused by mycobacteria of the tuberculosis complex, mostly Mycobacterium tuberculosis, is a major infectious disease of the respiratory system worldwide. In South Korea, a nationwide survey of TB prevalence in 1995 by chest radiography revealed that 1 % of korean population (about 0.4 million people) infected active TB and infection with K strain, a clinical isolate from korean TB patients, led to increase number of TB patients every year. The appearance of multi-drug resistant TB strains highly demands for the development of effective and novel vaccine against TB, and the diagnostic methods capable of rapidly detecting TB with high accuracy. Upon completion of the entire DNA sequence of standard M. tuberculosis strain H37Rv with a total of 3924 ORFs (according to the gene classification of the Sanger Center), many studies have been focused on screening for the immunodominant antigens useful for immuno diagnostics of TB or vaccines against TB. For development of an improved serological immuno-diagnostic method of TB, relative to that commercially available, this study applied proteomics technology in order to discover antigens aqpplicable to diagnostic reagents.
For this purpose, the invirulent strain of M. bacterium H37Rv, the virulent strains of M. bacteria CDC155 and K, were cultured in vitro and their secretory proteins analyzed by two dimensional electroporesis. Thirteen Proteins were selected and identified by mass spectrometry whose expressions were clearly observed in K strain (Rv0652, Rv1636, Rv2818c, Rv3369, Rv3865, Rv0566c, MT3304, Rv3160c), in both K and H37Rv (Rv3845), in both K and CDC1551(Rv0830), and highly up-regulated in virulent strains(Rv3874, Rv0560c, Rv3648c).
Genes encoding their proteins were cloned, over-expressed in E. coli and purified to homogeniety. Amongst them were rRv3369, rRv0566c, and rRv3874 tested by ELISA for their potential as serological diagnostic reagents, and compared the test results with those obtained from well-known antigens; rRv0469 (UmaA1), rRv3606 (Folk), rRv2534c (Efp) rRv3019c (ESAT-6), rRv2031 (14kDa), rRv0934 (38kDa).
The sensitivities and specificities of these antigens on recognizing TB IgG antibodies were evaluated with serum samples from TB patients (positives; n=150) and healthy group (negatives; n=100), respectively. One hundred forty eight out of 150 positives were detected by at least one of these antigens. The sensitivity and specificity of the individual CFP10 and Rv3369 were not as good as those of UmaA1.
However, addition of CFP10 or rRv3369 antigen to UmaA1 antigen in 1:1 ratio dramatically improved sensitivity of UmaA1 antigen up to 88 % without significantly compromising its specificity, i.e. from 99 % to 97%. These results implicated that the combinatorial mixture of UmaA1 antigen with CFP10 or rRv3369, which were selected in this study, can be used as the improved alternatives to the known serological TB dignostic kits.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 1
- 목차 ... 3
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 4
- Project Summery ... 6
- 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 11
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 21
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 44
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 45
- 6. 첨부서류 ... 46
- 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 47
- 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 48
- 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 48
- 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 48
- 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 48
- 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 49
- 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 50
- 7. 참고문헌 ... 51
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