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문제 정의
- 따라서 이 연구의 목적은 FMR-1 유전자내의 p(CGG) n의 크기나 promotor의 메칠화 유무를 밝히는데 가장 신뢰도가 높은 것으로 알려져 있는 분자생물학적 방법을 이용하여, 자폐장애 환자에서 fragile X 염색체의 빈도와 양상을 확인함으로써 자폐장애 환자와 fragile X 증후군 사이의 연관성에 대해 규명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 fragile X 증후군의 원인으로 알려져 있는 FMR-1 유전자의 5'에서 CGG 반복정도를 확인하기 위한 방법으로 DNA marker를 이용하였다. 과거에 사용되어온 전통적인 진단방법인 세포유전학적 방법은 배지에 methotrexate/thymidine 또는 methotrexate/bromodeoxyuridine을 첨가하거나 저엽산 농도의 배지를 이용하여 Xq27.
- 자폐장애의 유전적 요인에 대한 연구 중에서 염색체의 이상과 연관된 자폐장애가 보고된 이후로 자폐 장애의 원인을 염색체 이상에서 찾기 위한 연구가 진행되어왔다。35). 자폐장애와 fragile X 증후군은 서로 비슷한 임상 양상을 나타내므로 이들 사이의 연관성에 대한 연구가 관심을 모으기 시작했다. 즉 남자에서 여자보다 그 빈도가 3~5배 높고, 정신지체, 언어성 및 비언어성 의사소통의 장애, 상동적 행동, 대인관계 기피 등의 임상 양상이 서로 비슷한 점이다.
제안 방법
- 2(5' -GCC TAA GCT TCG GCG CTA GCA GGG CTG AAG AGA-3') primer 쌍을 이용하여 다음과 같은 조건으로 PCR로 증폭 합성하였다. 50“l의 PCR 반응액에 50mM KCL, 100mM Tris-HCl(pH 9.0), 1% Triton X-100, 1.5mM MgC" 각 0.32mM의 dNTPs, 0.1“M의 sense와 antisense 시발체, 2.5 단위의 AmpliTaq DNA polymerase(Roche사, 미국) 및 50ng의 표적 DNA가 되게 하였다.
- Nylon membrane올 DNA면이 위를 향하도록 hybridization bag에 넣고 CSPD ready-to- use를 가하여 37℃에서 10분간 배양하여 효소발광반응을 증가시 켰다. 15 ~ 25C상에서 Hyper film ECL (Amersham사, 미국) X-ray film에 15~25분간 노출시키고 현상하였다(Fig. 2).
- 1에서와 같이 sense primer(5' -CGG TGA CGG AGG CGC CCG TGC CAG GG-3')와 antisense primer(5' -CTT CTC TTC AGC CCT GCT AGC GCC G-3')를 이용하여 아래와 같은 조건으로 PCR을 실시하였다. 50“l의 PCR 반응액에 50mM KCl, 100mM Tris-HCl(pH 9.0), 1% Triton X-100, 1.5mM MgCl2, 각 0.32mM의 dNTPs, 0.5“M의 sense와 antisense primer, 2.5단위의 Gold Taq DNA polymerase(Roche사, 미국) 및 50ng의 표적(target) DNA가 되게 하였으며, GC-rich region을 효과적으로 증폭하기 위해 betadine (N, N, N-trimethylglycine)을 최종농도가 2M이 되게 첨가하였다14). PCR의 온도 조건은 Gene - Amp 9600® (Perkin Elmer사, 미국) thermocycler에서 predenaturation을 94℃에서 10분간 실시하고, 98℃에서 20초간의 denaturation, 55℃에서 60초간의 annealing, 72℃에서 60초간 elongation을 실시하고 마지막으로 72℃에서 10분간 postelongation을 실시하였다.
- Resin/PCR 산물 혼합액을 microcolumn으로 옮겨 2ml의 80이6 isopropan이로 세척한 다음 2분간 spin down하여 resin을 건조시켰다. 50“l의 증류수를 micro-column에 가하고 20초간 spin down하여 DNA를 추출하여 분광광도계로 DNA 농도 및 순도를 측정하고 최종농도를 0.5“g/“l이 되게 조정하였다
- 5“g의 genomic DNA를 50 unit의 제한효소 EcoRI (BioLabs Inc.사, 미국) 혹은 EcoRI와 EagI(BioLabs Inc.사, 미국) 100mM NaCl, 50mM tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT가 함유된 NEbuffer3(BioLabs Inc.사, 미국)로 37℃에서 12시간 처리하였다.
- 6% native polyacrylamide gel에서 전기영동은 Econo Sequencer® 전기영동기[바이오니아(주), 한국]를 이용하여 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 접착용액으로는 실리콘 용액을 전면 유리판에 각각 처리한 후 0.
- 6% native polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 DNA band는 Silver Stain Kit® [바이오니아(주), 한국] 로 은염색하여 다음과 같은 방법으로 가시화 하였다. 먼저 겔(gel)이 접착되어 있는 전면유리판을 조심스럽게 분리한 다음 10% acetic acid 용액으로 30분간 고정시키고 4차 증류수로 2분간 수세하였다.
- 발색용액에서 띠 (band)가 원하는 농도가 될 때까지 흔들어 준 다음 정지용액 10% acetic acid를 2분간 가하여 흐르는 물로 유리판을 잘 씻은 후 실온에서 gel을 건조시켰다. CGG 삼염기 반복서열의 분석은 viewbox에서 육안으로 관찰하였으며, 원하는 DNA band가 관찰되면 scan하여 size marker의 거리와 증폭 띠의 위치를 log-plot으로 분석하여 증폭된 FMR-1 유전자의 CGG 염기의 크기를 분석하였다15).
- CR의 온도조건은 GeneAmp 9600® (Perkin Elmer사, 미국) thermocycler에서 predenaturation올 94℃에서 30초간 실시하고, 94℃에서 20초간의 denaturation, 55℃에서 40초간의 annealing, 72℃에서 60초간 elongation하는 주기를 40회 반복한 다음 postelongation을 72℃에서 5분간 실시하였다. 증폭산물 10 “1를 취하여 0.
- FMR- 1 유전자의 genomic DNA의 Southern blot hybridizatione Fig. 1에서와 같이 FMR-1 유전자의 promotor, CpG island와 CGG 삼염기 반복서열을 포함하는 exon 1을 포함하는 EcoRI 절편을 StB12.3 혹은 Pfxa3 probe를 이용하여 분석하였다.
- FMR-1 유전자 CGG 반복서열 부위의 증폭은 Fig. 1에서와 같이 sense primer(5' -CGG TGA CGG AGG CGC CCG TGC CAG GG-3')와 antisense primer(5' -CTT CTC TTC AGC CCT GCT AGC GCC G-3')를 이용하여 아래와 같은 조건으로 PCR을 실시하였다. 50“l의 PCR 반응액에 50mM KCl, 100mM Tris-HCl(pH 9.
- Fig. 3-A에서와 같이 Pfxa3 probe가 FMR-1 유전자의 EcoRI 절편내에 위치하면 Fig. 2의 genomic sequence를 이용하여 Pfxa3.1(5' -CGT AGC ATG CCC CGG ATC CCG TGG GAG ATG ATG-3')과 Pfx3.2(5' -GCC TAA GCT TCG GCG CTA GCA GGG CTG AAG AGA-3') primer 쌍을 이용하여 다음과 같은 조건으로 PCR로 증폭 합성하였다. 50“l의 PCR 반응액에 50mM KCL, 100mM Tris-HCl(pH 9.
- 1ml를 넣고 24시간을 더 배양한 후 표준방법19)에 의하여 세포를 수확하고 슬라이드를 제작하였다. G-분염을 한 후 중기세포를 50개 계수하여 fragile X 염색체를 확인하였다. 제작한 슬라이드는 1,000배 배율의 현미경으로 검경하였고, fragile site 등의 이상은 최소 50개의 중기세포를 검경하여 fragile X 부위는 4%이상에서 확인될 때 양성으로 판정하였고 기타의 fragile site는 6% 이상인 경우 양성으로 판정하였다20).
- PCR 산물의 분석은 증폭 산물 10“l를 취하여 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 ethidium bromide 염색 후 증류수로 탈색시켜 UV-transilluminator로 관찰하거나, 더욱 더 자세한 분석을 위하여 6% native polyacrylamide gel에서 전기영동한 다음 은 염색하여 분석하였다.
- 5단위의 Gold Taq DNA polymerase(Roche사, 미국) 및 50ng의 표적(target) DNA가 되게 하였으며, GC-rich region을 효과적으로 증폭하기 위해 betadine (N, N, N-trimethylglycine)을 최종농도가 2M이 되게 첨가하였다14). PCR의 온도 조건은 Gene - Amp 9600® (Perkin Elmer사, 미국) thermocycler에서 predenaturation을 94℃에서 10분간 실시하고, 98℃에서 20초간의 denaturation, 55℃에서 60초간의 annealing, 72℃에서 60초간 elongation을 실시하고 마지막으로 72℃에서 10분간 postelongation을 실시하였다.
- 3-B). Pfxa3 probe의 digoxigenin 표지 및 산물, control assay는 StB12.3 probe와 동일한 방법으로 실시하였다(Fig. 4).
- Probe DNA 정제는 이를 Wizard® PCR Preps DNA Purification System(promega사, 미국)을 이용하여 DNA를 정제하였는데, 먼저 분리한 DNA 200“l, direct purification buffer 100“l와 1ml의 resin을 1.5 ml 소시험관에 가해 vortex mixer로 강하게 혼합하였다. Resin/PCR 산물 혼합액을 microcolumn으로 옮겨 2ml의 80이6 isopropan이로 세척한 다음 2분간 spin down하여 resin을 건조시켰다.
- 3 “m spacer를 사용하여 6% native polyacrylamide gel(19: 1 acrylamide/bisacrylamide)로 casting 하였다. Sample loadinge PCR 산물 5 “l에 4차 증류수 5 “l 와 6Xgel loading buffer(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll type 400) 5“ l를 혼합한 용액 3“l를 가한 후 1 XTBE 완충액(100 mM tris, 90mM boric acid, 1mM EDTA) 으로 300 volt에서 5시간 혹은 200volt에서 12시간 수직 상태에서 전기영동하였다.
- 본 연구에서는 99명의 자폐장애 환자군과 8명의 정상 대조군을 대상으로 먼저 PCR을 실시하였다. 그 결과 양군간 유의한 차이가 없었고 남자 환자와 여자 환자 사이에도 유의한 차이가 없었다.
- 이 중 8ml는 DNA를 추출하여 PCR 및 Southern blot analysis에 이용하였으며 나머지 2ml는 배양하여 세포유전학적 검사를 실시하였다.
- 접착용액으로는 실리콘 용액을 전면 유리판에 각각 처리한 후 0.3 “m spacer를 사용하여 6% native polyacrylamide gel(19: 1 acrylamide/bisacrylamide)로 casting 하였다. Sample loadinge PCR 산물 5 “l에 4차 증류수 5 “l 와 6Xgel loading buffer(0.
- G-분염을 한 후 중기세포를 50개 계수하여 fragile X 염색체를 확인하였다. 제작한 슬라이드는 1,000배 배율의 현미경으로 검경하였고, fragile site 등의 이상은 최소 50개의 중기세포를 검경하여 fragile X 부위는 4%이상에서 확인될 때 양성으로 판정하였고 기타의 fragile site는 6% 이상인 경우 양성으로 판정하였다20).
대상 데이터
- 1997년 1월부터 1998년 1월까지 계명대학교 동산의료원 정신과에 내원한 횐아들 중 DSM-W 진단기준에 의해 자폐장애로 진단된 환아 37명과, 1999년 6월 대구 소재 특수학교에 재학 중인 아동들 중에서 자폐 장애로 진단된 62명을 합쳐 모두 99명을 연구 대상으로 하였고, 대조군은 자폐장애가 아닌 아동 8명을 대상으로 하였다. 자폐장애 환자군은 남자 83명, 여자 16명이었으며 평균연령은 107.
- 하였다. 자폐장애 환자군은 남자 83명, 여자 16명이었으며 평균연령은 107.03±49.13개월이었다(Table 1). 정상 대조군은 남자 4명, 여자 4명이고 평균연령은 115.
데이터처리
- 0판을 이용하였다. 환자군과 정상대조군 사이의 연령과 PCR 반응의 결과 및 CGG 삼염기의 반복배열의 수 남자 환자와 여자 환자 사이의 PCR 결과 및 CGG 삼염기의 반복 배열의 수는 독립표본에 대한 Student’s t-검증으로 비교하였다. 통계적 유의수준은 p<0.
이론/모형
- Ficoll - Hypaque를 이용한 밀도구배 원심분리법(density gradient centrifugation)으로 단핵구층을 분리한 후 멸균 인산완충 생리적 식염수액으로 3회 세척하고 proteinase K(10mg/ml) 20"l, SDS (10%) 25“l를 가하여 37℃에서 16시간 반응시켰다. 이것을 phenol/chloroform법으로 처리하여 DNA를 추출하고 70% cold ethan이로 DNA를 침전시킨 후 건조시켰으며, 멸균증류수에 용해한 후 분광광도계로 DNA량을 측정하여 100 ng/“l의 농도로 조정하여 -20℃에 보관하였다13).
- 1mg/ml)를 첨가한 후 RPMI 1640배지에서 72시간 배양하였다. FudR(10 “M) 0.1ml를 넣고 24시간을 더 배양한 후 표준방법19)에 의하여 세포를 수확하고 슬라이드를 제작하였다. G-분염을 한 후 중기세포를 50개 계수하여 fragile X 염색체를 확인하였다.
- StB12.3 probe는 전술한 FMR-1 유전자 절편을 다시 제한효소 RstI로 자른 절편으로서 Oostra 등16)과, Warren과 Nelson17)의 방법에 준하여 DNA를 분리하여 아래와 같은 방법으로 정제한 다음 digoxigenin으로 표지하였다.
성능/효과
- 30bp이었으며, 자폐장애 환자군과 정상 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었고, 자폐장애 환자군에서 남자 환자와 여자 환자 사이에도 유의한 차이가 없었다. CGG 삼염기의 반복배열의 수에 있어서도 199bp인 경우 30repeats에 해당하므로 이를 기준으로 계산한 결과 자폐장애 환자군은 32.01±4.10repeats 이었으며 남자 환자는 32.02±4.40repeats, 여자 환자는 31.96±2.60repeats로 나타났다. 정상대조군은 34.
- 대상으로 먼저 PCR을 실시하였다. 그 결과 양군간 유의한 차이가 없었고 남자 환자와 여자 환자 사이에도 유의한 차이가 없었다. 반복배열의 수에 있어서도 정상대조군의 결과와 비교해서 남자 환자와 여자환자 모두에서 유의한 차이가 없었다.
- Southern blot hybridization 결과 완전변이나 불완전변이로 판정할 수 있는 환자는 한 명도 없었다. 병행한 세포유전학적 검사에서 환자군 모두에서 정상 핵형을 나타냈으며 fragile X 염색체는 확인되지 않았다.
- 이 연구의 결과에서 자폐장애 환자군과 정상대조군을 대상으로 FMR-1 유전자의 CGG 삼염기 반복의 분자생물학적 분석 결과 유의한 차이가 없었으며 fragile X 염색체가 확인되지 않았다는 것은 자폐장애와 fragile X 증후군과의 사이에 연관성이 없을 가능성도 있으므로 fragile X 증후군이 자폐장애의 직접적인 원인이라고 생각하기 어려울 수도 있겠다. 더욱이 세포 유전학적검사보다 더 객관적이고 정밀한 기술인 분자생물학적 방법을 이용해서 검사한 Crowe 등10)의 연구 결과는 20명 중 2명에서 양성으로 나타났으나, Hallmayer 등36), Klauck 등44), 강경미45)의 연구들에서 총 286명 모두 fragile X를 발견치 못했다는 결과는 두 질환의 관련성이 희박하다고 할 수 있겠다.
- 자폐장애 환자군 중 PCR 증폭 band가 정상보다 훨씬 증가된 것으로 나타난 13번(52repeats), 11번(51 repeats) 환자와 정상범위이지만 PCR 증폭 band가 증가된 환자 9명 등 총 11명을 대상으로 Southern blot hybridization을 시행한 결과 11명 모두 5.2kb에서 절단 band를 보여주었으며, PCR 검사상 불완전변이가 의심되었던 14번, 25번 환자도 정상 repeats를 갖는 기타 환자군에 비하여 부가적인 절단 band를 볼 수 없었다. Southern blot hybridization의 결과상 완전변이나 불완전변이로 판정할 수 있는 환자는 한 예도 없었다(Fig.
- 자폐장애 환자군을 대상으로 한 FMR-1 유전자의 CGG 삼염기 반복서열 부위를 sense와 antsense primer로 분석한 결과(Fig. 5, 6), 자폐장애 환자군은 206.24 ±12.2bp이었으며 남자 환자는 206.12±13.00bp, 여자 환자는 206.82±7.60bp로 나타났다. 정상대조군은 211.
- 60bp로 나타났다. 정상대조군은 211.88±10.30bp이었으며, 자폐장애 환자군과 정상 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었고, 자폐장애 환자군에서 남자 환자와 여자 환자 사이에도 유의한 차이가 없었다. CGG 삼염기의 반복배열의 수에 있어서도 199bp인 경우 30repeats에 해당하므로 이를 기준으로 계산한 결과 자폐장애 환자군은 32.
- 72℃에서 5분간 실시하였다. 증폭산물 10 “1를 취하여 0.5“g/ml의 ethidium bromide가 함유된 1.5% agarose gel에서 전기영동한 결과 462bp 크기의 PCR product가 확인되었다(Fig. 3-B). Pfxa3 probe의 digoxigenin 표지 및 산물, control assay는 StB12.
- 반복배열의 수에 있어서도 정상대조군의 결과와 비교해서 남자 환자와 여자환자 모두에서 유의한 차이가 없었다. 환자군 중 PCR 증폭 band가 정상범위이거나 정상보다 훨씬 증가된 것으로 나타난 11명을 대상으로 Southern blot hybridization을 시행한 결과 모두 정상 범위를 보여주었으며, 불완전변이가 의심되었던 환자들도 부가적인 절단 band를 볼 수 없었다. Southern blot hybridization 결과 완전변이나 불완전변이로 판정할 수 있는 환자는 한 명도 없었다.
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