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문제 정의
- 010M에서는 모든 색소가 양호하게 분리되었다. TBA-Br을 첨가한 이동상은 TBA-Br의 농도가 높아질수록 색소의 용출시간이 길어 분석에 장시간이 걸리는 단점이 있으므로 분리능에 영향을 미치지 않으면서도 분석시간을 단축시키기 위해 TBA-Bi과 함께 초산암모늄을 혼합하여 pH를 조절함으로서 해결하고자 하였다(25). 즉, 이동상에 첨가되는 초산암모늄의 농도에 따른 분리능을 비교한 결과 Fig.
- 타르색소를 HPLC로 분석하는 방법은 동시분석과 최 대흡수파장에 따른 계통분석으로 구분할 수 있는데 시료에 따라 이 두 가지 방법을 상호 보완하여야 한다(21). 본 연구에서는 우리나라에서 허용된 8종(알루미늄레이크 포함 15종)과 일본, EU, 미국 등에서 허용되어 있으나 우리나라에서 허용되어 있지 않고 수입식품에서 검출사례들이 있는 11종 등 총 19종의 색소들을 대상으로 하여 그 HPLC 분석조건 및 정제방법을 검토· 확립하고자 하였다.
- 용매의 조성과 이온쌍 시약 및 염의 농도가 분리능에 미치는 영향을 검토하였다. 대부분의 타르색소는 이온성 물질이므로 역상컬럼에서의 선택적 분리를 위해서는 이온쌍 시약을 사용하여 비극성 이온쌍을 형성하여 머무름 시간을 지연시킬 필요가 있다(12).
제안 방법
- 19종의 색소를 분리하기 위한 용매의 조성을 검토한 바 이동상으로 물과 메탄올 또는 물과 아세토니트릴의 혼합액을 이용한 경우 용매의 비극성도를 적절히 조절하기가 어려워서 분리가 효율적이지 못하였으므로 물과 아세토니트릴, 메탄올의 세 가지 용매를 혼합하여 검토하였다. 물-아세토니트릴-메탄올 혼합액의 경우 메탄올의 비율이 증가하면 색소들의 머무름 시간에 차이가 없이 일제히 빨라져서 각 색소의 분리가 어려우므로 메탄올의 비율을 10%로 고정하였다.
- 한편 설정된 각 색소 종류별 gradient 조건은 Table 2에 나타내었다. Lawrence 등(15)은 12종류의 타르색소 정량을 위해 메탄올과 물의 비율을 60:40과 45: 55로 조정하고 0.005 M의 이온쌍 시약을 첨가하여 구배용매조성법으로 계통분석한 결과를 보고하였는데 색소별 최대 흡수파장은 본 연구 결과와 일치하였으나 계통분석임에도 불구하고 머무름 시간이 긴 색소들이 있어 본 연구에서는 이를 보완하였다.
- 03M로 변화시키면서 컬럼의 분리능(capacity factor, K)에 미치는 영향을 검토하였다. 또한 이에 따른 이동상의 조성(초산암모늄 : 아세토니트릴 : 메탄올)을 일정용매조성법 (isocratic mode) 및 구배 용매조성법 (gradient mode) 조건과 상호 비교 검토하였다.
- 분석에 사용한 HPLC는 Waters사(USA)의 M510 solvent delivery system과 717 Autosampler, 486 UV detector 및 996 Photodiode array detector로 구성된 것으로 Columne Carbon loading량 및 길이에 따라 Nova-Pak C18(3.9 mm i.d. X 300 mm, 4 m, Waters, USA), Zorbax ODS(4.6 mm i.d. X 250 mm, 7 m, HP, USA), μ-Bondapak C18(3.9 mm i.d.X 300 mm, 10 m, Waters, USA) 및 Symmetry C18(3.9 mm i.d. X 150 mm, 5 m, Waters, USA) 등의 역상컬럼들을 비교검토 하였다.
- 색소의 용출액으로는 0.1% 염산-메탄올과 1% 초산-메탄올, 1% 인산-메탄올을 사용하여 산의 종류에 따른 용출정도를 비교하였다. Sep-pak C18을 통과하여 용출된 액은 물 2 mL를 가하여 증발농축하고 1% 암모니아수 1 mL로 수기를 세척하여 넣고 물을 가하여 정확히 10 mL로 한 후 HPLC용 시험용액으로 하였다.
- 색소표준용액을 0, 2, 5, 10, 20 및 50μg/mL의 농도로 조제하고 그 20μL를 HPLC에 주입하여 얻은 크로마토그램으로부터 검정곡선을 작성하였으며 , 모두 양호한 직선성을 나타내었다(Fig. 4). 동일 농도에서 검출기에 대한 감도는 적색색소의 경우 R3와 R106이 다른 적색계통 색소들에 비하여 높았고 황색색소의 경우는 Y4, QY ORⅡ, Y5의 순서로, 청색 및 녹색색소의 경우는 G3가 가장 높았고 BBN이 가장 낮았다.
- 이동상에 첨가되는 이온쌍 시약인 TBA-Br의 농도 범위는 0.00-0.02M, 초산암모늄의 농도 범위는 0.00~0.03M로 변화시키면서 컬럼의 분리능(capacity factor, K)에 미치는 영향을 검토하였다. 또한 이에 따른 이동상의 조성(초산암모늄 : 아세토니트릴 : 메탄올)을 일정용매조성법 (isocratic mode) 및 구배 용매조성법 (gradient mode) 조건과 상호 비교 검토하였다.
- 이동상의 유속은 1.0mL/min으로 하고 시료용액은 20μL를 주입하였으며 HPLC/PDA로 각 색소의 동시 및 계통분석을 위한 최대흡수파장을 결정하였으며 선택된 파장에서의 각 색소 종류별 검출한계를 측정하였다.
- B2, G3, R2, Y5의 경우는 알칼리 pH에서 변색되고 R3, R104, R105는 산에 의해 침전되어 색소산이 형성되었다. 이온쌍 시약인 TBA-Br 농도를 0.00~0.04%로 달리하여 검토한 바 0.03%이상에서 색소들이 비극성 이온쌍을 형성함으로써 C18 카트리지에 모두 보유되었으나(Table 3) 식품에 포함된 색소의 경우 식품 시료의 종류에 따라 카트리지의 보유능력이 저하되는 경우도 있었으므로 0.1 %로 결정하였다. 카트리지에 보유된 색소의 용출 용매로 메탄올만을 사용하였을 경우 극성도과 pH 조건이 맞지 않아 청색과 적색계통 색소들 중 일부가 용출되지 않고 카트리지에 잔존하였으므로 0.
- 물-아세토니트릴-메탄올 혼합액의 경우 메탄올의 비율이 증가하면 색소들의 머무름 시간에 차이가 없이 일제히 빨라져서 각 색소의 분리가 어려우므로 메탄올의 비율을 10%로 고정하였다. 즉, 메탄올의 비율은 10%로 하고 0.01 M TBA-Br을 함유한 0.025M 초산암모늄 용액과 아세토니트릴의 비율을 65 : 25(용매 A) 와 40:50(용매 B)의 두 가지로 조정하여 구배용매조성법으로 동시분석 및 색소종류별 계통분석을 실시하였다. 일정용매조성법을 적용하는 경우 분석에 장시간이 소요되었고 R3 등 크산틴계 색소는 이온쌍 시약과 반응하여 비극성 이온쌍을 형성하는 정도가 다른 색소에 비해 매우 커서 머무름시간이 지나치게 늦어졌으며 넓은 형태의 피크를 나타내어 정확한 정성 및 정량이 곤란하였다.
- 초산과 암모니아 수용액으로 Sep-pak C18 카트리지를 통과시키는 혼합색소 표준용액의 pH 범위를 3~9로 조정하여 보유 정도를 비교하였고, 색소 보유를 위해 TBA-Br의 농도 범위를 0.00~0.04%로 변화시켜 검토하였다.
- 1 %로 결정하였다. 카트리지에 보유된 색소의 용출 용매로 메탄올만을 사용하였을 경우 극성도과 pH 조건이 맞지 않아 청색과 적색계통 색소들 중 일부가 용출되지 않고 카트리지에 잔존하였으므로 0.1% 염산과 1.0% 초산, 1.0% 인산과 메탄올의 혼합액을 사용하여 용출율을 비교하였다(Table4). 1.
대상 데이터
- 0% 인산과 메탄올의 혼합액을 사용하여 용출율을 비교하였다(Table4). 1.0% 인산-메탄올로 용출하였을 때는 R3와 R104, R105 가, 1% 초산-메탄올로 용출하였을 때는 R105의 용출율이 각각 60%와 80% 미만으로 떨어졌으므로 모든 색소가 고르게용출되는 0.1% 염산-메탄올을 사용하였다. Puttermans 등(16,21)은 이온쌍 시약을 이용한 타르색소의 추출과 정제 방법을 검토하여 색소의 회수율에 영향을 미치는 요인들로 이온쌍 시약의 농도와 시료용액의 pH, 추출용매의 조성 등을 제시하였다.
- HPLC-PDA에 의해 색소표준용액을 분석한 결과 Fig. 1과 같이 황색과 적색, 청색 및 녹색계통 색소의 분석을 위한 검출파장은 각각 420, 520, 620 nm 로, 동시분석을 위해서는 모든 색소가 비교적 높은 흡광도를 보인 파장인 254 nm로 결정하였다. 각 타르색소마다 최대 흡수파장은 모두 다르나 식품에 사용되는 타르색소는 혼합색소 상태인 것이 많으므로 모든 색소의 검출이 가능한 254 nm와 황색과 적색, 청색 계통별로 한 파장씩을 선택하는 것이 바람직하다고 본다.
- Methanol과 acetonitrilee Merck 사(Germany)의 HPLC 급을, tetrabutylammonium bromide(TBA-Br)는 Junsei chemical 사(Japan)의 제품을 사용하였고 그 외 시약은 Wako사(Japan)의 특급시약을 사용하였다. 실험에 사용한 색소들은 TCI사 (Japan)의 제품으로 Table 1에 정리하였다.
- Methanol과 acetonitrilee Merck 사(Germany)의 HPLC 급을, tetrabutylammonium bromide(TBA-Br)는 Junsei chemical 사(Japan)의 제품을 사용하였고 그 외 시약은 Wako사(Japan)의 특급시약을 사용하였다. 실험에 사용한 색소들은 TCI사 (Japan)의 제품으로 Table 1에 정리하였다. 정제용 카트리지는 Sep-pak C18(1 g, Waters Co.
성능/효과
- 2에 나타내었다. TBA-Br의 농도가 높아질수록 비극성 이온쌍이 증가되어 비극성 컬럼에서의 색소들의 머무름 시간이 대체적으로 증가하였으나 각 색소별로 이온쌍 시약 농도에 따른 머무름 시간 증가 정도에 차이가 있어 0.005M에서는 Y5와 Y4, R40 과 R2의 분리가 어려웠으며 0.015M에서는 Y4와 R40의 분리가 되지 않았지만 0.010M에서는 모든 색소가 양호하게 분리되었다. TBA-Br을 첨가한 이동상은 TBA-Br의 농도가 높아질수록 색소의 용출시간이 길어 분석에 장시간이 걸리는 단점이 있으므로 분리능에 영향을 미치지 않으면서도 분석시간을 단축시키기 위해 TBA-Bi과 함께 초산암모늄을 혼합하여 pH를 조절함으로서 해결하고자 하였다(25).
- 일정용매조성법을 적용하는 경우 분석에 장시간이 소요되었고 R3 등 크산틴계 색소는 이온쌍 시약과 반응하여 비극성 이온쌍을 형성하는 정도가 다른 색소에 비해 매우 커서 머무름시간이 지나치게 늦어졌으며 넓은 형태의 피크를 나타내어 정확한 정성 및 정량이 곤란하였다. 그러나 극성도의 차이가 있는 두 가지 용매의 비율 변화를 이용한 구배용매조성법을 사용한 결과 분석 후반부에 용매의 비극성이 증가되어 비극성도가 높은 색소들의 머무름 시간이 짧게 나타났다. 한편 설정된 각 색소 종류별 gradient 조건은 Table 2에 나타내었다.
- 4). 동일 농도에서 검출기에 대한 감도는 적색색소의 경우 R3와 R106이 다른 적색계통 색소들에 비하여 높았고 황색색소의 경우는 Y4, QY ORⅡ, Y5의 순서로, 청색 및 녹색색소의 경우는 G3가 가장 높았고 BBN이 가장 낮았다. 계통별 식용색소의 검출한계는 적색계통이 0.
- Sep-pak C18 카트리지는 색소의 보유와 세척, 용출과정에 물이나 메탄올 등의 용매를 사용하는데(27,28) 색소의 보유와 용출에 적합한 용매의 조성 및 pH를 찾을 필요가 있다. 따라서 초산과 암모니아수로 혼합색소 표준용액의 pH를 3~9로 조정하여 색소들의 카트리지 보유 정도를 검토한 결과, pH 5~6의 범위에서 모든 색소가 보유되었다. B2, G3, R2, Y5의 경우는 알칼리 pH에서 변색되고 R3, R104, R105는 산에 의해 침전되어 색소산이 형성되었다.
- 각 타르색소마다 최대 흡수파장은 모두 다르나 식품에 사용되는 타르색소는 혼합색소 상태인 것이 많으므로 모든 색소의 검출이 가능한 254 nm와 황색과 적색, 청색 계통별로 한 파장씩을 선택하는 것이 바람직하다고 본다. 또, 동시분석법은 계통분석에 비하여 검출 한계가 높고 254nm에서 흡광도를 나타내는 물질이 식품으로부터 이행하여 색소의 검출을 방해할 수 있는 단점이 있으나 혼합색소를 동시에 모두 분리할 수 있는 장점이 있었다. 계통분석은 색소별 최대흡수파장에서 검출하므로 서로 다른 계통의 혼합색소는 2~3회 반복측정이 요구되나 검출 한계가 동시분석에 비해 훨씬 낮고 다른 계통의 색소는 높은 농도에서도 거의 검출되지 않아 정성· 정량분석이 용이하며 단시간내 분석이 가능하다(18,22).
- TBA-Br을 첨가한 이동상은 TBA-Br의 농도가 높아질수록 색소의 용출시간이 길어 분석에 장시간이 걸리는 단점이 있으므로 분리능에 영향을 미치지 않으면서도 분석시간을 단축시키기 위해 TBA-Bi과 함께 초산암모늄을 혼합하여 pH를 조절함으로서 해결하고자 하였다(25). 즉, 이동상에 첨가되는 초산암모늄의 농도에 따른 분리능을 비교한 결과 Fig. 3에서 볼 수 있듯이 초산암모늄의 농도가 낮을수록 분석시간이 많이 걸리는 것을 알 수 있었고 염의 농도가 높을 때는 컬럼의 분리능에 영향을 주었으므로 분석시간이 짧고 분리능에 영향주지 않는 0.025 M을 최적의 농도로 결정하였다. Lawrence 등(15)은 초산암모늄을 이동상에 첨가하여 분리능 향상과 분석시간 단축이 가능했다고 보고하였다.
- 6)와 비교하였을 때 동시분석에 소요된 시간은 35분, 계통분석은 18분이었다. 황색계통 색소들의 경우 동시분석시 검출되지 않았던 QY3와 QY4, GS1과 GS2가 계통분석시 검출되어 보다 정확한 정성· 정량 분석이 가능할 것으로 생각되며 청색과 녹색 계통 및 QY 계통 색소들의 피크 크기가 상대적으로 증가함을 보였다.
후속연구
- . 따라서 HPLC를 이용한 분석법은 혼합 타르색소를 포함하는 식품의 색소사용량까지 신속하고 정확하게 분석할 수 있으므로 현행 식품공전의 타르색소 분석법을 개선, 보완하고 식품관련 검사기관 및 식품업체에서 정확하고 원활한 검사를 수행할 수 있도록 기여하며 식이를 통한 합성착색료의 섭취량조사 등 위해도 평가시 분석 방법으로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 계통분석은 색소별 최대흡수파장에서 검출하므로 서로 다른 계통의 혼합색소는 2~3회 반복측정이 요구되나 검출 한계가 동시분석에 비해 훨씬 낮고 다른 계통의 색소는 높은 농도에서도 거의 검출되지 않아 정성· 정량분석이 용이하며 단시간내 분석이 가능하다(18,22). 따라서 식품에 첨가된 색소의 종류에 따라 동시분석법과 계통분석법을 선택하여 적용해야 할 것으로 사료된다.
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