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문제 정의
- 한편, 부원료인 콩물 및 콩가루가 유과의 품질에 미치는 영향을 조사한 연구는 보고된 바가 있으나(4-7) 최종 제품인 유과의 특성에 관한 연구만이 이루어졌을 뿐 콩물의 작용기전에 관한 연구는 아직까지 미흡한 실정이다. 즉, 콩물의 첨가에 의한 유과 품질의 개선 효과가 amylase의 작용에 의한 것이라는 추측만 있을 뿐, 유과 제조 과정에 이용되는 콩물이나 반죽 내 효소 활성에 관한 연구는 이루어진 바가 없으므로 이에 본 연구에서는 유과 제조 시 부재료인 콩물의 작용기전에 중점을 맞추어 실험하였다.
가설 설정
- 유과 제조시 이렇게 장기간 수침을 시키는 이유는, 수침시 수침액 내의 미생물이 분비하는 a-amylase에 의한 찹쌀 전분의 분해 효과에 기인한 amylopectin 구조상의 변화로 조직감이 부드러워지고 팽화가 잘 일어나기 때문이다. 그런데, 유과 반죽시 부재료로 콩물을 첨가하는 이유도 콩물의 a-amylase 작용에 의한 전분 분해에 따른 품질 개선이라는 점을 고려할 때, 콩물을 넣어 바로 반죽하는 것보다 콩물 안의 전분분해효소가 최대의 활성을 지니는 온도를 찾아내어 효소 활성 최적 온도에서 반죽을 0~24시간 정도 incubation시켜서 전분 분해 효소의 작용 시간을 늘려주면 장기간 수침의 번거로움을 없애고 질감이 부드럽고 전체적 인수 용도가 높은 유과를 만들 수 있을 것이라는 가정하에 본 실험을 실시하였다.
제안 방법
- a-amylase 활성은 1% 전분 용액 (0.02 M phosphate buffer, pH 6.9) ImL를 기질로 사용하여, 미리 조제한 효소액을 1 mL 첨가하고 incubation 온도를 각각 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃,70℃로 하여 30분간 반응시킨 후, 1 M 초산 10 ml로 반응을 정지시키고 N/3000 요오드화 용액 10mL를 넣고 발색시킨 후 660nm에서 흡광도를 측정하였다(9). 초기 흡광도 값의 10%을 감소시키는 것을 1 unit로 하였고, 효소의 단백질 량을 구하여 enzyme 1 mg당 unit로 환산시킨 후 표시하였다.
- β-amylase 활성은 DNS법으로 활성을 측정하였으며, 0.5% soluble starch(0.4 M acetic acid buffer, pH 4.8) 1 mL를 기질로 사용하여 효소액 1 mL와 혼합한 후 incubation 온도를 각각 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃,70℃로 하여 항온 수조에서 정확히 30분간 반응시킨 후 dinitrosalycylic acid reagent 3mL 첨가하여 발색시켜 535nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 maltose를 이용하여 작성하였고 효소액 1 mL가 1mg의 maltose를 유리시킬 때의 효소량을 1 unit으로 하고, Bradford법 으로 효소의 단백질 량을 구하여 enzyme 1 mg당 unit로 환산시킨 후 표시하였다.
- 02 M sodium phosphate buffer를 200 mL 가하고 원심 분리한 후 상증액을 조효소액 (crude enzyme solution)으로 사용하였다 (8). 기질은 생전분과 호화전분 기질용액의 두가지로 하였고 콩물 amylase 활성의 최적 온도를 찾기 위하여, 효소 반응시 incubation 온도만 각각 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃,70℃로 달리하여 측정하였다. 반응 pH는 6.
- 단백질량은 Bradford법에 기초한 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하였다. 단백질의 표준곡선은 Bovine Serum Albumin(BSA)을 이용하여 작성하였다.
- 시료의 입자 표면 구조는 시료를 Freeze dryer(Heto FD 8.0, USA)로 냉동 건조시킨 후, 주사전자 현미경(S-2700, Hitachi, JapanX 사용하여 3,000배로 확대하여 관찰하였다(14).
- 유과 반죽에 첨가한 콩물의 amylase가 생전분에 대한 최대 활성을 나타내는 온도에 장시간 incubation시켜 찹쌀의 장기 수침시 일어나는 미생물의 효소에 의한 전분 분해 효과를 대체할 수 있기를 기대하였는데, 위의 결과에서 α-amylase 의 최대 활성 온도는 50℃, β-amylase, 이ucoamylase는 70℃ 를 나타내었으므로 실험에서는 중간 온도인 60℃에서 incubation 시키기로 결정하였다.
- 유과 반죽의 찹쌀가루와 부재료의 첨가량은 여러 번의 예비실험을 통하여 찹쌀가루 700g, 청주 150mL, 콩물 또는 물 270 mL로 정하였으며, 찹쌀가루에 각각 0%(증류수 사용), 7%, 14%의 콩물을 각 군별로 첨가하고 청주를 첨가하여 5분간 반죽한 후 60℃에서 0, 3, 6, 9, 12시간씩 incubation 시켜 제조하였다.
- 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 동일한 buffer에 녹인 후 원심 분리하고 상층 액을 취하여 잔류 단백질 분자량이 12,000 이상인 dialysis sacks에 넣고 24시간 투석하였다(11-12). 염이 제거된 효소액을 유과 반죽의 조효소액으로 4℃에서 보관하면서 사용하였다.
- 찹쌀가루는 태안군에서 수확한 추청 논찰을 상온에서 2시간 수침한 후 1시간 동안 체에 받쳐 물기를 뺀 다음 제분하여 얻었다. 콩은 충북 괴산군에서 수확한 백태를 물에 불려 껍질을 제거한 후, 시료의 농도를 콩 건량 기준으로 7%, 14% (W/V)농도로 증류수를 첨가하여 믹서로 갈고, 간 콩은 체에 걸러 콩물을 얻었다.
- 콩물 넣은 반죽을 incubation 시간을 달리하여 방치한 후에 각 시료들의 점도를 측정하였다(9). 점도는 Brookfield Viscometer(Model: DV-Ⅱ, Germany)를 사용하여 측정하였으며 #5 spindle을 사용하여 lOOrpm에서 Spindle이 돌기 시작한 후 1분이 되는 순간의 점도를 centipose(cp)단위로 읽었다.
- 얻었다. 콩은 충북 괴산군에서 수확한 백태를 물에 불려 껍질을 제거한 후, 시료의 농도를 콩 건량 기준으로 7%, 14% (W/V)농도로 증류수를 첨가하여 믹서로 갈고, 간 콩은 체에 걸러 콩물을 얻었다. 주류는, 백화청주'를 이용하였고 튀김용 기름은 동방유량 제품의 '해표 면실유'를 사용하였다.
대상 데이터
- 콩은 충북 괴산군에서 수확한 백태를 물에 불려 껍질을 제거한 후, 시료의 농도를 콩 건량 기준으로 7%, 14% (W/V)농도로 증류수를 첨가하여 믹서로 갈고, 간 콩은 체에 걸러 콩물을 얻었다. 주류는, 백화청주'를 이용하였고 튀김용 기름은 동방유량 제품의 '해표 면실유'를 사용하였다.
데이터처리
- 나타내었다. SAS package를 이용하여 반복 측정된 다요인 분산 분석으로 유의성을 검증하였고, 평가 결과로부터 평균과 표준편차를 구하여 one way ANOVA를 가정하여 유의성 검증을 하였다. 유의성이 인정되면 Duncan's Multiple Range Test를 하여 grouping 하였다.
- SAS package를 이용하여 반복 측정된 다요인 분산 분석으로 유의성을 검증하였고, 평가 결과로부터 평균과 표준편차를 구하여 one way ANOVA를 가정하여 유의성 검증을 하였다. 유의성이 인정되면 Duncan's Multiple Range Test를 하여 grouping 하였다.
- 최소 3회 이상 반복 측정한 실험결과를 평균값과 표준오차로 나타내었다. SAS package를 이용하여 반복 측정된 다요인 분산 분석으로 유의성을 검증하였고, 평가 결과로부터 평균과 표준편차를 구하여 one way ANOVA를 가정하여 유의성 검증을 하였다.
이론/모형
- Glucoamylase 활성은 β-amylase와 동일한 방법으로 실시하였으며 glucose를 이용하여 표준곡선을 작성한 후 효소액 1 mL가 1 mg의 glucose를 유리시킬 때의 효소량을 1 unit으로 하고, Bradford법으로 효소의 단백질량을 구하여 enzyme 1 mg당 unit로 환산시킨 후 표시하였다.
- 기질에 대한 반죽 amylase 활성 변화 측정은 콩물의 glucoamylase의 활성 측정과 동일한 방법으로 측정하였다. 단, 활성 측정시 incubation 온도는 박 등(13)의 방법에 준하여 각각 40℃, 30℃, 30℃로 고정시킨 후 측정하였다.
- 초기 흡광도 값의 10%을 감소시키는 것을 1 unit로 하였고, 효소의 단백질 량을 구하여 enzyme 1 mg당 unit로 환산시킨 후 표시하였다. 단백질량은 Bradford법에 기초한 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하였다. 단백질의 표준곡선은 Bovine Serum Albumin(BSA)을 이용하여 작성하였다.
- 실온으로 냉각시킨 후 10 mL의 증류수를 가하여 잘 섞어 540nm에서 흡광도(Beck- man DU 650, USA)를 측정하였다. 콩물 첨가 반죽의 발효 진행에 따른 환원당의 양은 반죽의 건조 중량당 mg으로 나타냈으며 반죽의 수분 정량은 105℃ 건조법으로 하였다. 동일한 방법으로 Convotherm(Geprutte Qualiat, Germany)에서100℃로 10분간 익힌 반죽의 환원당량을 측정하였다.
- 8) 1 mL를 기질로 사용하여 효소액 1 mL와 혼합한 후 incubation 온도를 각각 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃,70℃로 하여 항온 수조에서 정확히 30분간 반응시킨 후 dinitrosalycylic acid reagent 3mL 첨가하여 발색시켜 535nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 maltose를 이용하여 작성하였고 효소액 1 mL가 1mg의 maltose를 유리시킬 때의 효소량을 1 unit으로 하고, Bradford법 으로 효소의 단백질 량을 구하여 enzyme 1 mg당 unit로 환산시킨 후 표시하였다.
성능/효과
- 반죽의α.β-amylase, glucoamylase 역시 콩물 농도가 증가할수록 활성이 증가하였고 생전분보다 호화전분에 대한 활성이 매우 높게 나타났다. 유과 반죽을 동결 건조시켜 미세구조를 관찰한 결과 콩물 무첨가군에 비해 콩물 첨가군에서 incubation 시간이 증가함에 따라 입자의 크기가 작아지고, 입자 표면에 구멍이 관찰되어 콩물 첨가시 전분 분해 효소 작용이 일어났음을 알 수 있었다.
- 유과 반죽의 pH는 콩물 농도 증가에 따라 증가하였고 incubation 시간 증가에 따라서 감소하였으며, 점도는 콩물 농도가 증가할수록 incubation 시간이 길어질수록 감소하였다. 반죽의 환원당 함량은 생반죽, 호화 반죽 모두 콩물 농도가 증가할수록, incubation 시간이 길어질수록 높게 나타났으며, 특히 호화 반죽에서는 0% 콩물 첨가군보다 7%, 14% 콩물 첨가군의 환원당 함량이 3~4배 이상 높게 나타났다. 반죽의α.
- 4와 같다. 생반죽의 환원당량은 incubation시간이 길어질수록, 콩물 농도가 증가할수록 높게 나타났고, 이는 호화 반죽에서 더욱 높게 나타났다. 신 등(21)에 의하면 쌀가루를 60℃ 물로 반죽하여 6CFC에서 incubation시킨 반죽으로 유과를 제조할 경우, 처리시간이 길어질수록 반죽의 환원 당량이 증가한다고 하여 본 연구 결과와 일치하였다.
- β-amylase, glucoamylase 역시 콩물 농도가 증가할수록 활성이 증가하였고 생전분보다 호화전분에 대한 활성이 매우 높게 나타났다. 유과 반죽을 동결 건조시켜 미세구조를 관찰한 결과 콩물 무첨가군에 비해 콩물 첨가군에서 incubation 시간이 증가함에 따라 입자의 크기가 작아지고, 입자 표면에 구멍이 관찰되어 콩물 첨가시 전분 분해 효소 작용이 일어났음을 알 수 있었다.
- 호화전분 기질에 대한 활성이 높게 나타났다. 유과 반죽의 pH는 콩물 농도 증가에 따라 증가하였고 incubation 시간 증가에 따라서 감소하였으며, 점도는 콩물 농도가 증가할수록 incubation 시간이 길어질수록 감소하였다. 반죽의 환원당 함량은 생반죽, 호화 반죽 모두 콩물 농도가 증가할수록, incubation 시간이 길어질수록 높게 나타났으며, 특히 호화 반죽에서는 0% 콩물 첨가군보다 7%, 14% 콩물 첨가군의 환원당 함량이 3~4배 이상 높게 나타났다.
- 3에 나타내었다. 콩물 농도에 따른 효소 활성은 동일한 기질에 대해 7%보다 14%에서 효소활성이 더 높았고, 온도에 따라서는 7%, 14% 모두 생전분에 대해서는 70℃, 호화전분에 대해서는 30℃에서 활성이 가장 높게 나타났다. 이와 같은 결과는 이 등(15) 의 연구에서 무증자 전분의 당화율을 높일 수 있는 glucoamy-lase의 최적 온도가 60℃라고 보고한 것보다 다소 높게 나타났다.
- 5에 나타내었다. 콩물농도가 높을수록 반죽의 효소 활성이 높았고, 생전분보다 호화 전분을 기질로 사용했을 때 현격히 증가하였는데 이는 콩물의 α-amylase 활성 결과와 일치하였다. 호화 전분에 대한 반죽의 효소 활성은 콩물 무첨가군에 비해, 콩물 첨가 군에서 활성이 크게 증가하였고, 7% 첨가군과 14% 첨가군 간에는 차이를 나타내지 않았다.
- 콩물의 α-amylase 활성은 콩물 농도에 따른 유의적인 차이가 없었으나, β-amylase와 glucoamylase의 활성은 7% 콩물보다 14% 콩물의 활성이 유의적으로 높았으며, 각각의 효소는 온도 변화 및 기질에 따른 차이를 나타내었고, 생전분보다 호화전분 기질에 대한 활성이 높게 나타났다. 유과 반죽의 pH는 콩물 농도 증가에 따라 증가하였고 incubation 시간 증가에 따라서 감소하였으며, 점도는 콩물 농도가 증가할수록 incubation 시간이 길어질수록 감소하였다.
- 따라서 콩물의 농도보다는 콩물 첨가 유무가 반죽의 효소 활성을 결정하는 요인이라 할 수 있다. 한편, incubation 시간은 α-amylase 활성에 별다른 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. Fig.
- 콩물농도가 높을수록 반죽의 효소 활성이 높았고, 생전분보다 호화 전분을 기질로 사용했을 때 현격히 증가하였는데 이는 콩물의 α-amylase 활성 결과와 일치하였다. 호화 전분에 대한 반죽의 효소 활성은 콩물 무첨가군에 비해, 콩물 첨가 군에서 활성이 크게 증가하였고, 7% 첨가군과 14% 첨가군 간에는 차이를 나타내지 않았다. 따라서 콩물의 농도보다는 콩물 첨가 유무가 반죽의 효소 활성을 결정하는 요인이라 할 수 있다.
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