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문제 정의
- 따라서 본 연구는 한국인의 특성에 맞는 정장제용 우량균주를 개발하고, 그 기본 특성규명을 위해 건강한 한국인 분변으로부터 Lactobacilli를 분리, 동정하고, 분리균의 종별 출현빈도, 산생성 능력, 인공위액 및 인공 담즙에 대한 내성 및 cholesterol 저하능력 등 몇 가지 생리적 특성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 한국인 분변으로 부터 분리, 동정된 Lacto-bacillus 속 균주의 종별 출현빈도, 산 생성능, 인공 위액 및 인공 담즙에 대한 내성, cholesterol 저하능력 등이 검토되었다.
- plantarum 순이었다. 분리주 중 L. acidophilus로 동정된 17주와 L. casei로 동정된 3주에 대해서 생리적 특성을 검토한 바 각각 다음과 같은 결과가 얻어졌다. 인공위액에 대한 내성 실험결과 L.
- 상기의 분리된 총 52주 중에서 예비실험 결과(data not shown) 내산성이 우수한 것으로 나타난 L. acidophilus 19주 중 보관 및 계대 배양 과정에서 사멸한 2주를 제외한 17주 와 3주의 L. casei에 대하여 몇 가지 생리적 특성을 파악하 기 위한 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 5 로 조정한 인공위액(MRS broth + 1% pepsin)에 접종하였다. 37℃에서 3시간 가볍게 진탕 배양 후 0.1 mL 취하여 MRS agar 상에 도말하여 동일 온도에서 배양 후 생성된 집락을 계수하여 배양전의 집락수와 비교하였다. 생존율은 인공위액에서 배양 전의 생균수에 대한 배양한 후의 생균수의 비를 백분율(%)로 표시하였다.
- Cholesterol assimilation activity를 즉정하기 위해, Walker와 Gilliland(26)의 방법을 변형하여 실시하였다. 먼저 cholesterol phosphatidyl choline micelle의 제조는 Razin 등(27)의 방법에 따라 수행하였다.
- L. acidophilus 및 L. casei로 분류된 균종을 MRS broth에 2회 계대 배양 후 멸균된 12%(w/v) 환원 탈지유에 l%(v/v) 접종하여 37℃에서 정치 배양하면서 적정산도 및 pH를 측정하였다. 적정 산도는 상법에 준하여 실시하였으며 젖산의 양으로 환산하여 %로 표시하였다.
- 따라서 다음과 같이 실시하였다. 분리 균주를 MRS broth에 2회 계대 배양한 후 균체를 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 회수하고 세척한 다음, HCI 을 사용하여 pH 2.5 로 조정한 인공위액(MRS broth + 1% pepsin)에 접종하였다. 37℃에서 3시간 가볍게 진탕 배양 후 0.
- 분리된 20 주를 상기 MRS broth에 2회 계대 배양 후 0.3% oxgall이 포함된 MRS agar에 도말하여 3기에서 48시간 배양한 후 생성된 집락수를 계수하였다. 대조구는 oxgall이 포함되지 않은 MRS agar를 사용하였다.
- 실시하였다. 상기 MRS broth(Difco) 중에서 현탁된 시료를 멸균 생리적식염수(0.85% NaCl 용액)로 적절한 배수만큼 희석하고, 토마토 즙이 함유된 LBS agar(BBL)(22) 상에 가급적 50~100개의집락(colony)이 형성되도록 도말한 후 37℃ 배양기 내에서 48시간 배양하였다. 일단 배지 상에 형성된 집락에 대하여 외관의 모양이 유사하고 출현 빈도가 많은 것을 우선적으로 선별하고, 동일 배지에 2~3회 획선 배양하여 순수 분리한 후 MRS broth 중에서 37<>C로 배양 후 5℃로 냉장 보관하면서 사용하였다.
- 상기의 분리된 Lactobacillus 속 균주를 Gram 염색하고 현미경 관찰에 의하여 형태를 확인한 후, 당 이용능력 및 몇가지 생화학적 특성에 따라 최종 동정하였다. 당 이용성은 분리된 각 균주를 MRS agar 배지에 37℃에서 48시간 anaerobic system(Becton Dickinson)에서 혐기적으로 배양한 후 원심분리(3000×g, 3 min) 하여 생리적 식염수로 2회 세척한 후멸균 증류수에 현탁시켜 API 50 CHL strip(bioMerieux, France)에 첨가하고 37℃(2에서 48시간 배양하였다.
- 생후 13일부터 37세까지의 총 13명의 남·여로부터 분리 된 260개의 균주 중 현미경 관찰을 통해 Gram 양성이며 catalase 반응이 음성인 균주로서 특징적인 집락의 모양을 나타낼 뿐만 아니라 지속적으로 LBS 및 MRS배지에서 성장하는 Lactobacillus 속으로 판단되는 52 주를 일차적으로 분리하였다. 각 분리균은 API 50 CHL kit(bioMerieux, France)를 사용하여 당 발효능을 실험한 바, Table 1과 같은 결과가 얻어졌다.
- 당 이용성은 분리된 각 균주를 MRS agar 배지에 37℃에서 48시간 anaerobic system(Becton Dickinson)에서 혐기적으로 배양한 후 원심분리(3000×g, 3 min) 하여 생리적 식염수로 2회 세척한 후멸균 증류수에 현탁시켜 API 50 CHL strip(bioMerieux, France)에 첨가하고 37℃(2에서 48시간 배양하였다. 이 결과를 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(23), 에 기술된 특징과 bioMerieux의 database system(Apilab plus V3.2.2)의 결과를 토대로 하여 각 균주를 동정하였다.
- 85% NaCl 용액)로 적절한 배수만큼 희석하고, 토마토 즙이 함유된 LBS agar(BBL)(22) 상에 가급적 50~100개의집락(colony)이 형성되도록 도말한 후 37℃ 배양기 내에서 48시간 배양하였다. 일단 배지 상에 형성된 집락에 대하여 외관의 모양이 유사하고 출현 빈도가 많은 것을 우선적으로 선별하고, 동일 배지에 2~3회 획선 배양하여 순수 분리한 후 MRS broth 중에서 37<>C로 배양 후 5℃로 냉장 보관하면서 사용하였다.
- 분변의 채취는 식이조절 후 즉시 실시하였고, 혐기성 미생물의 채취가 가능한 Culturette(BBL, USA)를 사용하였다. 채취된 시료는 재빨리 10mL의 MRS broth(pH 6.8)가 들어 있는 시험관(외경 16 mm)에 투입 후 얼음 box 중에서 보관하면서 48시간 이내에 분리 실험을 사용하였다.
대상 데이터
- 3% oxgall이 포함된 MRS agar에 도말하여 3기에서 48시간 배양한 후 생성된 집락수를 계수하였다. 대조구는 oxgall이 포함되지 않은 MRS agar를 사용하였다. 생존율은 oxgall이 포함되지 않은 MRS agar의 생균수에 대한 0.
- Lactobacilli를 분리하였다. 분변 채취에 응한 모든 지원자는 유아기 때 모유를 섭취한 경험이 있으며 특별한 장질환이나 지병이 없는 건강한 사람을 선발하였고, 1개월간 발효 유제품의 섭취를 제한하고, 항생물질의 투약이나 주사를 금하는 등의 식이 조절을 받게 하였다. 분변의 채취는 식이조절 후 즉시 실시하였고, 혐기성 미생물의 채취가 가능한 Culturette(BBL, USA)를 사용하였다.
- 생후 3일부터 37세까지의 남자 8명, 여자 5명, 총 13명으로부터 Lactobacilli를 분리하였다. 분변 채취에 응한 모든 지원자는 유아기 때 모유를 섭취한 경험이 있으며 특별한 장질환이나 지병이 없는 건강한 사람을 선발하였고, 1개월간 발효 유제품의 섭취를 제한하고, 항생물질의 투약이나 주사를 금하는 등의 식이 조절을 받게 하였다.
이론/모형
- 방법을 변형하여 실시하였다. 먼저 cholesterol phosphatidyl choline micelle의 제조는 Razin 등(27)의 방법에 따라 수행하였다. 22 mg phosphatidyl-choline (L-a-lecithin, Sigma)과 10 mg의 cholesterol (Sigma)을 시험관에 넣고 클로로포름(CHCl3 Merck)을 첨가하여 혼합한 후 질소가스 중에서 완전히 건조하였다.
- casei로 분류된 균종을 MRS broth에 2회 계대 배양 후 멸균된 12%(w/v) 환원 탈지유에 l%(v/v) 접종하여 37℃에서 정치 배양하면서 적정산도 및 pH를 측정하였다. 적정 산도는 상법에 준하여 실시하였으며 젖산의 양으로 환산하여 %로 표시하였다. pH의 측정은 pH meter(model 691, Metrohm)를 사용하여 20℃에서 측정하였다.
- 콜레스테롤 정량분석은 Rudel과 Morris(28)의 방법에 의하여 실시하였으며, Assimilation activity는 대조구의 cholesterol 값 에 대한 실험구 균체의 cholesterol 값(대조구 시료에서 실험 구 상등액의 cholesterol 값을 뺀 수치)의 백분율로 정의하여 percent(%)로 표시하였다.
성능/효과
- 20개 분리균주(L. acidophilus 17주 및 L. casei 3주)에 대한 내산성을 실험한 결과 L. acidophilus로 동정된 a-4 주는 pH 2.5에서 3시간 경과 후에도 전혀 사멸하지 않고 100% 생 존하였으며, L. acidophilus a-2와 L. casei b-3도 75% 이상의 높은 생존율을 나타내었다. 이에 반해서 L.
- 3%까지 도달하여 산 생성능력이 상당히 우수함을 알 수 있었다. 60시간 경과 후 적정산도가 0.8%에 도달하지 못한 균주는 총 10주였으며 L. acidophilus a-6은 pH 5.2, 적정 산도 0.5로 산 생성 능력이 가장 미약하였다.
- L. acidophilus 17주 및 L. casei 3주를 12%(w/v) 환원 탈 지유 배지 중에서 배양하면서 산 생생능을 측정한 결과(Table 4), L. acidophilus a-2 및 a-16은 60시간 경과 후 pH가 3.5~3.6에 도달하였으며, 적정산도도 2.1~2.3%까지 도달하여 산 생성능력이 상당히 우수함을 알 수 있었다. 60시간 경과 후 적정산도가 0.
- 3% 포함된 MRS 배지에서 내담즙성을 측정한 결과는 Table 3에 표시한 바와 같다. L. acidophilus a-3, a-8, a-13, a-17의 4주는 담즙의 존재에도 불구하고 균체 증식에 지장을 받지 않고 배양 시간이 증가함에 따라 생균수가 비슷하거나 오히려 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 L.
- acidophilus a-2 주와 a-6 주가 70% 이상의 우수한 저하능력을 나타냈고, 12 균주가 60% 이상의 저하능을 나타냈다. cholesterol 저하능은 동일 균종이라 하더라도 분리원(사람)은 물론 동일 분리원에서 유래된 균주 간에도 큰 차이가 나타났다. 담즙산에 대한 내성과 cholesterol 저하능력과의 관련성은 상호간의 유의적인 관계가 없는 것으로 나타났다.
- 담즙산에 대한 내성과 cholesterol 저하능력과의 관련성은 상호간의 유의적인 관계가 없는 것으로 나타났다. 결론적으로 본 실험에서 얻은 몇 균주는 인체에 섭취될 경우 사멸하지 않고 소화관 하부까지 도달할 수 있는 잠재성이 있었으며, 따라서 이들 분리주는 정장제로 이용될 수 있다고 생각되었다.
- acidophilus a-3, a-8, a-13, a-17의 4주는 담즙의 존재에도 불구하고 균체 증식에 지장을 받지 않고 배양 시간이 증가함에 따라 생균수가 비슷하거나 오히려 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 L. acidophilus 중 a-2 및 a-16은 이 농도에서 50% 이상 생균수가 감소하는 것으로 나타났고 나머지 13주도 54%에서 99% 정도로 생존율이 감소하는 것으로 나타나 전반적으로 균주에 따라 내담즙성의 정도 차가 큰 것으로 나타났다.
- 나머지 13주는 40%이하의 생존율을 나타내어, 균주 별로 인공위액에 대한 내성은 큰 차이를 나타났다. 내 담즙성을 측정한 결과 L. acidophilus a-3를 포함한 4주는 성장에 지장을 받지 않았으나 대부분의 분리 균주는 생균수가 처리전 보다 54-99% 정도로 감소되는 것으로 나타나 인공위액 내성과 마찬가지로 균주에 따라 편차가 큰 것으로 나타났다. 환원 탈지유를 이용한 산생성능에 있어서는 두 L.
- cholesterol 저하능은 동일 균종이라 하더라도 분리원(사람)은 물론 동일 분리원에서 유래된 균주 간에도 큰 차이가 나타났다. 담즙산에 대한 내성과 cholesterol 저하능력과의 관련성은 상호간의 유의적인 관계가 없는 것으로 나타났다. 결론적으로 본 실험에서 얻은 몇 균주는 인체에 섭취될 경우 사멸하지 않고 소화관 하부까지 도달할 수 있는 잠재성이 있었으며, 따라서 이들 분리주는 정장제로 이용될 수 있다고 생각되었다.
- casei에 대하여 cholesterol 저하 능력을 측정한 결과는 표 5와 같다. 시험에 사용된 총 20주중에서 L. acidophilus a-2주 와 a-6주가 70% 이상의 현저한 저하능력을 나타냈다. 그밖에 10주가 60% 이상의 저하율을 나타냈으며, 4주는 50%이하의 저하율을 나타내었다.
- 각 분리균은 API 50 CHL kit(bioMerieux, France)를 사용하여 당 발효능을 실험한 바, Table 1과 같은 결과가 얻어졌다. 연령이 생후 13일부터 13개월까지의 영·유아에서는 L. acidophilus 9주 및 L. plantarum이 8주로 가장 많이 검줄되었고, 다음으로는 L. casei 3주, L. salivarius 2주, L. rhamnosus 1주 및 L. brevis 1주의 순이었다. 한편, 13세 이상의 성인에게서도 L.
- casei b-3도 75% 이상의 높은 생존율을 나타내었다. 이에 반해서 L. acidophilus a-1을 포함한 4주는 40% 내외의 생존율을 나타내었고, 그 밖의 13 주는 40% 미만의 생존율을 나타내어 균주 별로 인공위액에 대한 내성은 큰 차이가 있음이 관찰되었다(Table 2).
- casei로 동정된 3주에 대해서 생리적 특성을 검토한 바 각각 다음과 같은 결과가 얻어졌다. 인공위액에 대한 내성 실험결과 L. acidophilus a-4는 pH 2.5에서 3시간 경과 후에도 전혀 사멸하지 않고 100% 생존하는 것으로 나타났으며, L. acidophilus a-2와 L. casei b-3도 75%이상의 높은 생존율을 나타내었다. 나머지 13주는 40%이하의 생존율을 나타내어, 균주 별로 인공위액에 대한 내성은 큰 차이를 나타났다.
- 8%에 도달하지 못한 것은 총 20주중 10주였다. 한편 cholesterol 저하능을 측정한 결과 공시한 20개 분리주 중에서 L. acidophilus a-2 주와 a-6 주가 70% 이상의 우수한 저하능력을 나타냈고, 12 균주가 60% 이상의 저하능을 나타냈다. cholesterol 저하능은 동일 균종이라 하더라도 분리원(사람)은 물론 동일 분리원에서 유래된 균주 간에도 큰 차이가 나타났다.
후속연구
- In vitro 상태와 인체에서 미생물에 의한 콜레스테롤 저하 능력의 관련성에서 Gilliland 등(30)은 in vitro에서 콜레스테롤 저하능력이 우수한 균주가 동물실험에서도 콜레스테롤 저하능력이 우수하였다고 발표한 바 있으나, 그 증거는 아직 불충분 한 상태이다. 따라서 본 실험에서 콜레스테롤 저하능력이 우수하게 나타난 균주에 대하여 향후 동물실험을 통한 연구의 보완이 필요하다고 생각된다.
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