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문제 정의
- 본 연구는 염증의 유발 및 심화, 조직 파괴에 직접 관여하는 임상효소에 대한 저해효과를 탐색하여 구강 내 염증 치료제 개발의 가능성을 평가하고자 하였다.
- 본 연구자들은 Aloe vera 가공산업에서 산업 페기물로 생성되는 Aloe vera 껍질 중 구강질환을 유발하는 Streptococcus mutans균에 대하여 항균 활성이 우수한 물질을 분리·정제하여 이물질이 aloe-emodin 및 barbaloin임을 규명하고, 그 항균활성 및 sucrose를 기질로 하여 치태 형성에 직접적으로 관여하는 Glhse(glucosyltransferase) 저해효과를 확인하여 보기로 하였다(16,17).
제안 방법
- 1% carrageenan saline solution을 주사하기 직전과 주사 후 1시간 간격으로 5시간까지 다리의 용적을 측정하였다. 1% carrageenan saline solution 투여전에 대한 투여 후의 다리용적의 증가분을 부종율로하여(Ⅰ)식에 의해 산출하였으며, 이 수치를 바탕으로 (Ⅱ)식으로 저해율을 산출하여 항염증 활성을 측정하였다(22).
- 생리식염수를 복강 내에 투여하고 30분 후 1% carrageenan saline solution 1mL를 오른쪽 뒷 발바닥에 피하 주사하여 부종을 유발하였다. 1% carrageenan saline solution을 주사하기 직전과 주사 후 1시간 간격으로 5시간까지 다리의 용적을 측정하였다. 1% carrageenan saline solution 투여전에 대한 투여 후의 다리용적의 증가분을 부종율로하여(Ⅰ)식에 의해 산출하였으며, 이 수치를 바탕으로 (Ⅱ)식으로 저해율을 산출하여 항염증 활성을 측정하였다(22).
- 0)을 넣어 총액량이 1mL가 되도록 하였다. 37℃에서 5분간 방치한 후 여기에 10mL의 20 mM NNN'N'-tettamethyl-p-phenylenediamine dichloride 와 10μL의 arachidonic acid를 넣고 611nm에서 흡광도의 변화 속도를 측정하였다. 비특이적인 흡광도 변화는 위의 반응혼합물 중에서 arachidonic acid를 제외한 효소 반응으로 측정하여 이것을 보정해 주었다.
- Aloe vera 껍질로부터 구내염 등 항염증 제재를 개발하기 위해 항염증 활성이 있는 분획을 분리, 동정하고, 염증과 관련된 효소 활성에 대한 저해효과를 조사하였다.
- Aloe vera 껍질의 추출물을 용매에 따라 분획하였고, 활성이 우수한 ethylacetate층을 silica gel column chromatography 및 preparative thin layer chromatography을 통해 두 가지 활성 물질을 정제하였다. 정제된 두 가지 물질은 UV spectrum 과 FT-IR, 1H-NMR, 및 Mass spectrum 분석을 통해 aloe-emodin과 barbaloin으로 동정하였다.
- Arachidonic acid 대사의 율속 단계 (rate-limiting step) 인 fatty acid cyclooxygenase 활성고} prostaglandin hydroperoxidase 활성이 동일한 단백질인 prostaglandin endoperoxide synthase에 의해 촉매되기 때문에 두 종류의 활성이 복합된 분석법으로 효소 활성을 측정하였다. 즉 100μL의 효소, 10μL 의 20μM hematin, 100μL의 시료 및 0.
- A와 Fr. B를 분리하고, UV/VIS 분광광도계(Sec-omam S1000, USA)를 이용한 UV spectrum, 질량분석은 Mass Spectrometer(JEOL JMS-DX 303, USA)로 분석하였으며, 1H-NMR 분석은 Broker AM 300 MHz Spectrometer (USA)를 사용하여 측정하였다. IR Spectrume Digilab Division FTS-165 FT-IR spectrometerl- 이용하여 분석한 결과 aloe-emodin과 barbaloin으로 판명되어 이후 실험에 사용하였다.
- Prostaglandin endoperoxide synthase의 활성1 unit는 1분 동안 1 μM의 NNN'N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dichloride를 산화시키는데 필요한 효소양으로 정하고 흡광도 변화에서 unit 산출은 다음과 같은 식에 의해 산출하여 IC50값으로 평가하였다. 이때 IC50은 효소 활성을 50% 저해하는 농도이다.
- Merck Art 7743)을 사용하였으며, preparative TLC로는 Kieselgel 60(Merck Art 5745)를 사용하였다. TLC spot 확인은 UV 365 ran 파장에서 5% ethonolic-KOH를 발색시약으로 사용하여 확인하였다. 추출 용매는 덕산이화학의 1급 시약을 사용하였다.
- 25% polyethylene 6000)와 leuckocyte elastase 효소액 100μL, 증류수 300μL 및 Aloe vera 껍질추출물 100 μL를 시험관에 담고 플라스틱 spatula를 이용하여 조심스럽게 혼합한 후 기질인 Suc-Ala-Ala-Ala-4Na 용액 (3 mM/L of dimethylsulfoxide) 100μL를 첨가하였다. 그 후 플라스틱 spatula를 이용하여 조심스럽게 혼합하여 5분간 반응시키고 405nm에서 흡광도를 측정하였다(19). 이때 효소의 limit는 분당 1 μM 4-nitroaniline이 방출되는 것으로 정의하였으며, 효소의 활성 저해율은 다음식에 의해 산출하여 IC50 값으로 평가하였고 이때 IC50은 효소 활성을 50% 저해하는 농도이다.
- , USA) 용액을 250 gL 씩 각 well에 넣고 4시간 동안 CO2 Incubator 에서 배양하였다. 배양액 중 MTT용액을 제거하고 formazon 결정을 용해시키기 위해 DMSO(DimethyI Sulfoxide, Sigma Co., USA)를 200μL씩 첨가한 후 96 well μLate로 옮겨 ELISA analyser(Spectra MAX 250, Molecular Devices, Co.,USA)로 570nm에서 흡광도를 측정하여 독성을 평가하였다(24). 실험 결과는 대조군에 대한 백분율로 다음식에 준하여 계산하였고 SAS system에 의해 통계처리하였다.
- , 습도, 100%,Vision)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액 중 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 FBS가 포함되지 않은 DMEM으로 세척한 후 aloe-emodin과 barbaloin이 처리된 DMEM(1% FBS 포함)과 함께 배양하였다. 배양 후 phosphate buffer solu- tion(PBS)로 용해한 MTT(3-4, 5-dimethylthiazol-2-yl-2, 5-diphenyl tetrazoHum bromide, Sigma Chemical Co.
- 37℃에서 5분간 방치한 후 여기에 10mL의 20 mM NNN'N'-tettamethyl-p-phenylenediamine dichloride 와 10μL의 arachidonic acid를 넣고 611nm에서 흡광도의 변화 속도를 측정하였다. 비특이적인 흡광도 변화는 위의 반응혼합물 중에서 arachidonic acid를 제외한 효소 반응으로 측정하여 이것을 보정해 주었다.
- 그 후 플라스틱 spatula를 이용하여 조심스럽게 혼합하여 5분간 반응시키고 405nm에서 흡광도를 측정하였다(19). 이때 효소의 limit는 분당 1 μM 4-nitroaniline이 방출되는 것으로 정의하였으며, 효소의 활성 저해율은 다음식에 의해 산출하여 IC50 값으로 평가하였고 이때 IC50은 효소 활성을 50% 저해하는 농도이다.
- 정제하였다. 정제된 두 가지 물질은 UV spectrum 과 FT-IR, 1H-NMR, 및 Mass spectrum 분석을 통해 aloe-emodin과 barbaloin으로 동정하였다. Aloe vera 분획물의 hyaluronidase 활성 저해를 측정한 결과는 aloe-emodine 40μg/mL, barbaloine 70μg/mL의 IC50값을 나타내었다.
- 반응 후 25 mM citric acid 용액 1 mL를 첨가하여 효소 반응을 정지 시 킨 다음, ethyl acetate 5 mLSL lipophilic 물질을 추출하여 비색정량하였다(20). 효소의 활성 저해는 다음의 수식에 따라 산출하여 IC50값으로 평가하였으며 이때 IC50은 효소활성을 50% 저해하는 농도이다.
대상 데이터
- Aloe vera 껍질 성분 및 점질물의 항염증 활성은 체중 110~ 130 g의 7주령 Vaster계 웅형(#) 쥐 5마리를 1군으로 하여 실험을 진행하였다. 생리식염수를 복강 내에 투여하고 30분 후 1% carrageenan saline solution 1mL를 오른쪽 뒷 발바닥에 피하 주사하여 부종을 유발하였다.
- B를 분리하고, UV/VIS 분광광도계(Sec-omam S1000, USA)를 이용한 UV spectrum, 질량분석은 Mass Spectrometer(JEOL JMS-DX 303, USA)로 분석하였으며, 1H-NMR 분석은 Broker AM 300 MHz Spectrometer (USA)를 사용하여 측정하였다. IR Spectrume Digilab Division FTS-165 FT-IR spectrometerl- 이용하여 분석한 결과 aloe-emodin과 barbaloin으로 판명되어 이후 실험에 사용하였다.
- leuckocyte elastase(Sigma Chemical Co., USA)를 1M NaCl-0.1% Biij35를 함유한 tris완충액으로 희석하여 단백질농도가 2mg/mL가 되도록 제조하였다. 효소의 활성 측정은 400 μL 의 triethanolamine buffer(TEA, 0.
- 8시간 열풍 건조하였다. 건조된 Aloe vera 껍질은 상온에 보관하면서 매번 실험시물 추출 또는 알코올 추출을 하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 column chromatography용 silica gele Kieselgel 60(70~230 mesh ASTM. Merck Art 7743)을 사용하였으며, preparative TLC로는 Kieselgel 60(Merck Art 5745)를 사용하였다. TLC spot 확인은 UV 365 ran 파장에서 5% ethonolic-KOH를 발색시약으로 사용하여 확인하였다.
- TLC spot 확인은 UV 365 ran 파장에서 5% ethonolic-KOH를 발색시약으로 사용하여 확인하였다. 추출 용매는 덕산이화학의 1급 시약을 사용하였다. 본 실험에 사용한 hyaluronidase, leuckocyte elastase, collagenase는 Sigma Chemical Co.
데이터처리
- incubation. Wean土standard deviation and means with the same lettered superscripts in a column are not significantly different at the 5% level by Duncan's multiple range test.
- ,USA)로 570nm에서 흡광도를 측정하여 독성을 평가하였다(24). 실험 결과는 대조군에 대한 백분율로 다음식에 준하여 계산하였고 SAS system에 의해 통계처리하였다.
이론/모형
- Aloe vera에서 추출, 정제한 aloe-emodin과 barbaloin이 인체치은 섬유 모세포의 활성에 미치는 영향을 측정하기 위해 김(23)의 방법에 준하여 실시하였다. 계대 배양을 통해 활성화된 인체치은 섬유모세포를 Trypsin-EDTA(0.
성능/효과
- 70 ppm 피크는 이웃 ring의 carbonyl group과의 conjugation 을 받고 있는 5번 proton으로 확인되었다. 11.94 ppm의 broad singlete 1, 8번의 hydroxy기의 proton으로 확인하였으며, 양상 또한 표준물질과 일치하여 aloe-emodin으로 동정하였다. 또한 fr.
- 항염제로 주로 사용되고 있는 indomethacin과 aspirine 각각 8 μg/mL, 80μg/mL] IC50값을 나타내었으며, 항염증 활성이 있는 것으로 알려진 acetyl-L-cysteine 및 tetracycline 은 각각 400μg/mL와 500μg/mL의 IC50값을 나타내었다. Aloe vera 추출물인 barbaloine 현재 사용되고 있는 비스테로이드성 항염증제인 aspirin과는 비슷한 항염증 효과가 있으며, aloe- emodin의 경우에는 약 2배의 효과가 있어 aloe-emodin과 barbaloine 비교적 결합조직의 염증 발생 및 염증의 심화를 사전에 막을 수 있는 효능을 가진 것으로 판단된다. 반면 현재 염증치료제로 사용되고 있는 aspirin과 비스테로이드성 항염제인 indomethacin의 경우와 비교하여 낮은 효소 활성 저해를 나타내었으나 indomethacin이 위 점막 손상, 위궤양 등의 위장관 장애 및 중추신경장애, 심혈관계 및 신기능 장애, 간 기능과 호흡기 장애 등 다양한 부작용을 유발하는 것을 감안한다면 아주 우수한 결과라고 판단된다.
- Aloe-emodine aspirin과 비슷한 효소 활성 저해를 보였으나 항염증 활성이 있는 것으로 알려진 acetyl-L-cysteine 및 tetracyclinee 각각 400μg/mLdhk 750μg/mL의 IC50값을 나타내어 aspirin, indomethacin에 비해 비교적 낮은 효소 활성 저해를 나타내었다. 그러나, 이들은 앞에서 열거한 일련의 심각한 부작용을 동반하기 때문에 이 부작용을 최소화할 수 있는 Aloe vera를 그 우위에 둘 수 있을 것으로 판단된다.
- 항염제로 주로 사용되고 있는 indomethacin과 aspirine 각각 50μg/mL, 100μg/mL의 IC50값을 나타내었으며, 항염증 활성이 있는 것으로 알려진 acetyl-L-cysteine 및 tetracyclinee 각각 700μg/mL와 800μg/mL의 IC50값을 나타내었다. Aloe-emodine indomethacin 에 비해 약간 높은 효소 활성 저해를 보였으며 aspirin보다는 2배 이상의 높은 효소활성 저해를 보였다. Barbaloine indomethacin보다는 약간 낮았고 aspirin보다는 높은 효소 활성 저해를 보였다.
- Aloe-emodine l00㎎/㎏의 투여량으로 52.9%의 억제 효과를 나타내었으며 이 억제 효과는 indomethacin의 약 1/10이었으며, Aspird과는 유사한 활성을 보였다. 반면 barbaloin의 경우 100㎎/㎏의 투여량으로 74.
- Aloe-emodine indomethacin 에 비해 약간 높은 효소 활성 저해를 보였으며 aspirin보다는 2배 이상의 높은 효소활성 저해를 보였다. Barbaloine indomethacin보다는 약간 낮았고 aspirin보다는 높은 효소 활성 저해를 보였다.
- Leucko- cyte elastase 활성 저해를 측정한 결과는 aloe-emodine 50μg/mL, barbaloine 60 μg/mL의 IC50값을 나타내었다. Col-lagenase 활성 저해를 측정한 결과는 aloe-emodine 40μg/mL, barbaloine 60μg/mL의 값을 나타내었다. 또한 prostaglandin endoperoxide synthase 활성 저해를 측정한 결과는 aloe-emodine 40μg/mL, barbaloine 70μg/mL의 IC50값을 나타내었다.
- 즉 aloe-cmodin과 barbaloin의 첨가 농도가 증가함에 따라 세포의 활성은 감소하였으며 aloe-cmodin에 비해 barbaloin의 독성이 비교적 낮은 것으로 평가되었다. aloe-emodin의 경우에 첨가 농도가 1, 5, 10 및 20μg/mL에서 세포의 활성은 대조군에 대한상대적인 활성값으로 100.5%, 99.7%, 16.1% 및 18.3%로 나타났으나 1 및 5μg/mL첨가 농도에서는 대조군과 유의적인 차이(p<0.05)가 없는 것으로 평가되었다. Barbaloin 의 경우의 세포 활성은 1, 5, 10 및 20μg/mL에서 101%, 101.
- 이들의 mass spectrum을 분석한 결과 aloe-emodine 분자 이온 피크로부터 분자량이 270임을 확인하였고 benzylic alcohol에서 CO가 떨어져나가고 생긴 [M-29]+ 피크를 m/z = 241에서 확인하였다. barbaloine 분자량이 418임을 확인하였으며 anthrone류에서 강하게 나타나는 [C15H12O4]+의 피크가 m/z = 256에서 base peak로 나타났다. 그 구조식은 Fig.
- 9%의 억제 효과를 나타내었으며 이 억제 효과는 indomethacin의 약 1/10이었으며, Aspird과는 유사한 활성을 보였다. 반면 barbaloin의 경우 100㎎/㎏의 투여량으로 74.9% 억제 효과를 나타내었으며 이 억제 효과는 indomethacin의 약 1/5이었으며, Aspirin의 약 1.5배 효과를 나타내어 비교적 우수한 항염증 활성을 갖는 것으로 판단된다.
- 9%의 억제 효과를 나타내었으며, 이 억제 효과는 indomethacin의 약 1/10이었으며, aspirin과는 유사한 활성을 보였다. 반면 barbaloin의 경우 100㎎/㎏의 투여량으로 74.9%의 억제 효과를 나타내었으며 이 억제 효과는 indomethacin의 약 1/5이었으며, aspirin의 약 1.5배 효과를 나타내어 우수한 항염증 활성을 갖는 것으로 판단된다. 인체 치은세포에 대한 독성은 aloe-emodin보다 bar- baloin이 적게 나타났으며 이 두 가지 물질은 1 및 5 μg/mL 농도에서는 독성이 전혀 나타나지 않으나 10 및 20μg/mL에서는 독성이 있는 것으로 나타났다.
- 실질적으로 aloe-emodine indomethacin과 거의 같은 효소 활성 저해를 보였으며, aspirin보다 2배 가량 높은 효소 활성 저해를 보였다.
- 31%이었다. 이들 물질에 대한 UV spectrum을 측정한 결과, 분획 A의 UV spectrum는 222.7, 255.4, 286.4, 432.2 nm에서 강한 흡수대를 나타내었으며, 분획 B 는 217, 252.6, 269.6, 295, 358.1 nm에서 강한 흡수대를 나타내었다. 또한 FT-IR spectrum을 분석한 결과 fr.
- 8 ppm 근처의 피크들은 C-glucosylated aloe-emodin anthracene nucleus에서 나타나는 유사한 proton series 때문인 것으로 보여지며, 이것은 10번 탄소가 β-glucose와 conjugation 으로 결합되어 있는 것으로 보여지며, 표준물질과의 비교에서도 일치하는 양상을 보여 barbaloin으로 동정하였다. 이들의 mass spectrum을 분석한 결과 aloe-emodine 분자 이온 피크로부터 분자량이 270임을 확인하였고 benzylic alcohol에서 CO가 떨어져나가고 생긴 [M-29]+ 피크를 m/z = 241에서 확인하였다. barbaloine 분자량이 418임을 확인하였으며 anthrone류에서 강하게 나타나는 [C15H12O4]+의 피크가 m/z = 256에서 base peak로 나타났다.
- 이러한 결과는 현재 류마치스 질환의 치료제로 이용되고 있는 비스테로이드성 항염제(non-steroidal antiimflammatoiy drugs)가 염증의 유발 및 진전에만 우수한 효소 활성 저해를 보이고 있는 것을 감안한다면 관절조직의 파괴를 막는 효능을 함께 갖고 있는 Aloe vera의 효과는 상당히 주목할 만한 결과라 할 수 있다.
- 5배 효과를 나타내어 우수한 항염증 활성을 갖는 것으로 판단된다. 인체 치은세포에 대한 독성은 aloe-emodin보다 bar- baloin이 적게 나타났으며 이 두 가지 물질은 1 및 5 μg/mL 농도에서는 독성이 전혀 나타나지 않으나 10 및 20μg/mL에서는 독성이 있는 것으로 나타났다. 그러나 상용되고 있는 chlorhexidin에 비해서는 유의적으로 독성이 적은 것으로 나타났다.
- 또한 prostaglandin endoperoxide synthase 활성 저해를 측정한 결과는 aloe-emodine 40μg/mL, barbaloine 70μg/mL의 IC50값을 나타내었다. 쥐를 이용한 carrageenan족 부종 억제 효과는 aloe-emodin의 경우 100㎎/㎏의 투여량으로 52.9%의 억제 효과를 나타내었으며, 이 억제 효과는 indomethacin의 약 1/10이었으며, aspirin과는 유사한 활성을 보였다. 반면 barbaloin의 경우 100㎎/㎏의 투여량으로 74.
- 즉 aloe-cmodin과 barbaloin의 첨가 농도가 증가함에 따라 세포의 활성은 감소하였으며 aloe-cmodin에 비해 barbaloin의 독성이 비교적 낮은 것으로 평가되었다. aloe-emodin의 경우에 첨가 농도가 1, 5, 10 및 20μg/mL에서 세포의 활성은 대조군에 대한상대적인 활성값으로 100.
후속연구
- 따라서 Aloe vera 껍질에서 추출, 정제한 aloe-emodin과 barbaloine 현재 가장 보편적으로 사용되고 있으며 치아의 착색, 구강상피세포의 박리 및 미각 이상 등의 여러 가지 부작용을 초래하는 chlorhexidine의 대체예방제재로 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 보아 aloe-emodin 과 barbaloine 항우식 및 항염증 활성이 우수할 뿐만 아니라 치은 세포의 독성이 비교적 낮아 구강병 예방 제재로의 개발 가능성이 우수하다고 사료된다.
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