[논문]웰니스 및 구강질환억제를 위한 천연물 유래물질 연구

박해령; 홍석진

doi:10.14400/jdc.2015.13.5.357

웰니스 및 구강질환억제를 위한 천연물 유래물질 연구
Research on Natural Medicine for Wellness and Oral Health 원문보기

디지털융복합연구 = Journal of digital convergence, v.13 no.5, 2015년, pp.357 - 363

박해령 (광주여자대학교 교양교직과정부) , 홍석진 (전남대학교 치의학전문대학원 예방치과학교실)

초록
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본 연구는 치아 치료를 위한 다양한 구강제품의 성분들을 천연물에서 발굴하여 부작용이 적고 저렴한 구강제품을 만들에 삶의 질적인 부분에서 웰니스를 위한 융복합 연구를 하고자함이다. 사람 골육종세포(MG-63)에 오배자(Galla Rhois) 추출물을 이용하여 구강염증질환에 있어서 항염증효과를 항산화작용기전의 지표로 사용하는 NO생성과 DPPH radical 소거능으로 확인하였다. 오배자 80% 메탄올추출물에서 62%, n-헥산 추출물에서 68%의 강한 NO생성 억제 활성을 나타냈다. DPPH radical 소거능을 살펴보면 오배자 80% 메탄올추출물은 27.8%, n-헥산 추출물은 30.5%, 디에틸에테르 추출물은 51.7%, 클로로포름 추출물은 66.4% 그리고 에틸아세테이트 추출물은 62.4%의 자유라디칼 소거억제능력을 확인할 수 있었다. 이에 본 연구는 오배자 메탄올 추출물이 항산화 작용에 있어서 탁월한 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 이러한 천연물 유래성분들을 적용하여 비용부담이 줄여서 삶의 질적 수준을 높여보고자 한다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study investigated the antioxidant and anti-inflammatory effects of Galla Rhois (Rhus verniciflua) on LPS (lipopolysaccharide)-stimulated human osteoblastic cells (MG-63). The aim of this study was to evaluate the LPS induced nitric oxide (NO) production and antioxidant radical in human osteoblast-like MG-63 cells. Therefore, the present work indicate that Galla Rhois extracts may be an ideal candidate for further research into their use for dental caries prevention component as well as, natural plant-based products. This suggested that 80% methanol and hexane extracts of Galla Rhois were inhibited NO generation and 1,1-diphenyl-2-pirylhydrazyl (DPPH) radical. Therefore, 80% methanol and hexane extracts of Galla Rhois may be utilized as a good source of protection against inflammation and oxidative stress. This study is intended to pursue wellness convergence in quality of life in the excavations in natural ingredients to create a variety of oral products with fewer side effects, cheap oral products for the dental treatment.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

오배자 추출물의 항산화효과(antioxidant)와 관련하여 그 효능 및 작용기전을 밝히고 약리학적 연구를 통하여 기존 구강질환이나 치주질환과 같은 산화적 스트레스로 인한 질병을 융복합적 응용방법으로 적용하여 구강질환의 예방 및 치료를 위한 기반을 제공하고자 한다. 또한 구강용품 및 구강관련 제품에 있어서 비용적인 측면에서는 저렴한 천연물 시료를 통한 물질을 사용함으로 인해 삶의 웰니스를 추구할 수 있으며, 부작용이 적은 천연물을 사용함으로 안정성을 유지 가능케 한 제품을 발굴하여 보급하고자 함이다.
치주질환의 치료방법에는 인위적인 치조골 이식수술이나 치조골형성증이 주종을 이루고 있으나 아직까지는 치주질환을 효과적으로 치료할 수 있는 약물은 개발되어 있지 않으며, 소염진통제 등 개개 증상을 완화시키는 약물에 의존하고 있는 실정이다[15]. 본 연구는 골흡수가 진행되는 치조골에 염증을 유발하는 기전을 알아보기 위해 천연물소재인 오배자 추출물을 이용하여 확인하였다.
LPS(lipopolysaccharide) 는 치은 조직에서 염증반응을 일으키고, 이 염증반응을 제거하기 위해서 치은조직 내부에서는 면역세포들에 의한 면역반응이 일으킨다[2]. 본 연구는 이러한 치조골을 형성하는데 관여하는 골육종 세포를 이용하여 이러한 염증반응을 억제하는 천연에서 추출한 물질들을 발굴하고자 한다.
본 연구는 치조골 소실의 예방과 치료를 위해 오배자 추출물을 이용하여 염증반응을 경감시키고 더불어 골형성 증가에 관여하는 인자들을 찾고자 한다.
오배자 추출물에서 얻어진 생리활성 성분을 이용하여 웰니스 융합 적용방법의 일환으로 구강질환에 대한 예방과 구강용품제 또는 건강보조제로서 활용가치가 높은 기초자료가 되고자 한다. 고령사회로 진입하는 사회 구조를 비춰볼 때 웰니스 융복합 접근이 절대적으로 필요한 시기이다.
오배자 추출물의 항산화효과(antioxidant)와 관련하여 그 효능 및 작용기전을 밝히고 약리학적 연구를 통하여 기존 구강질환이나 치주질환과 같은 산화적 스트레스로 인한 질병을 융복합적 응용방법으로 적용하여 구강질환의 예방 및 치료를 위한 기반을 제공하고자 한다. 또한 구강용품 및 구강관련 제품에 있어서 비용적인 측면에서는 저렴한 천연물 시료를 통한 물질을 사용함으로 인해 삶의 웰니스를 추구할 수 있으며, 부작용이 적은 천연물을 사용함으로 안정성을 유지 가능케 한 제품을 발굴하여 보급하고자 함이다.
생화학적 작용으로는 'Gallotannins' 성분은 수렴 작용이 있으며, 간 기능 보호 작용과 항산화 작용을 한다[4,5]. 웰니스를 위한 융합 적용 방법에 있어서 오배자(Galla Rhois)를 이용하여 다양한 분자 생화학적 실험 방법을 통해 그 효능과 작용기전을 알아보고자 한다. 오배자에 대한 치태억제에 관한 논문은 일부 보고 된바 있으나[6] 이는 구강세균억제 측면에서 설명하였으며, 구강세포측면에서 검증하는 치아 우식억제활성 및 골소실에 관한 연구는 찾아보기 어렵다.

제안 방법

0-50 μΜ의 농도별로 제조한 질산염(Sodium nitrate)으로 표준곡선을 작성하여 NO함량을 산출하였다[9].
건조된 오배자 시료를 구입하여 300g을 분쇄하여 1L의 80% 메탄올을 분쇄한 오배자 시료에 첨거하여, 상온(25℃)에서 3일 동안 정치시켜 추출물을 얻었다. 80% 메탄올을 이용하여 추출한 오배자 추출물을여과지(ADVANTEC, NO. 2)로 감압하여 여과를 실시하였다.
DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)는 Hatano 등의 방법에 의하여[10], 각 추출물 및 단일 물질별 농축 건조물을 100, 200, 500, 1000, 2000 그리고 3000 ppm(99.5% ethanol)의 6가지 농도로 조제한 용액 100 μl(control :99.5% ethanol)에 0.1 mM DPPH용액(99.5% ethanol) 150μl 를 가하였다.
blank엔 시료대신 메탄올 100 μl를 첨가 하여 시료와 흡광도를 비교하였다. L-ascorbic acid(vitamin C)를 25, 50, 100, 200, 500 그리고 1000 ppm(99.5% ethanol)의 6가지 농도로 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화작용은 DPPH에 대한 전자공여능(Electron donating ability, EDA%)과 IC₅₀(DPPH radical 형성을 50% 억제하는데 필요한 μl 농도)로 나타내었다.
LPS(lipopolysaccharide)로 활성화를 유도한 사람 골육종 세포주인 MG-63을 대상으로 안정한 산화 생성물인 질산이온(NO3-)의 생성에 미치는 각각의 추출물의 영향을 측정하였다. 사람 MG-63세포를 24-well 배양접시에 1×105 cells/ml의 농도로 도말하여 12시간 배양한후, 오배자 각 추출물 분획을 처리한 후에 100 ng/ml의 LPS를 첨가하여 20시간 배양하였다.
blank엔 시료대신 메탄올 100 μl를 첨가 하여 시료와 흡광도를 비교하였다.
즉 극성이 낮은 용매부터 극성이 높은 용매순으로 순차적으로 용매분획하여 분획물들을 획득하였다. n-헥산과물을 동량의 비율로 분획 추출하여 n-헥산층을 분리하였고, 동일한 방법으로 디에틸에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물층으로 분획하여 얻어진 각각의 용매 분획물들을 감압 농축시켜서 분획물을 얻었다[Fig. 1].
각 시료의 항산화작용은 DPPH에 대한 전자공여능(Electron donating ability, EDA%)과 IC50(DPPH radical 형성을 50% 억제하는데 필요한 μl 농도)로 나타내었다.
각 오배자 추출물의 염증 억제 효과를 분석하기 위해서 질산이온(NO3¯)의 생성 억제 여부를 확인하였다.
분획한 각각의 오배자 추출물의 세포독성 유무를 확인하기 위해서 사람의 골육종 세포인 MG-63 (Human osteosarcoma cell line)세포를 가지고 EZ- CyTox kit로 측정 하여 확인하였다. 대조군의 중앙값을 기준으로 실험군의 O.D 측정값을 퍼센트로 환산한 결과 각각의 오배자 추출물 투여 24시간 후에 세포 생존률(Cell viability)을 확인하였다.
여과된 추출액은 진공농축기(Centrifugal Vacuum Concentrotor)를 이용하여 감압 농축하여 추출물을 회수하였다. 보다 세분화된 분획물을 회수하기 위해 용매의 극성을 달리하여 순차적으로 용매분획물을 회수하였다. 즉 극성이 낮은 용매부터 극성이 높은 용매순으로 순차적으로 용매분획하여 분획물들을 획득하였다.
분획한 각각의 오배자 추출물의 세포독성 유무를 확인하기 위해서 사람의 골육종 세포인 MG-63 (Human osteosarcoma cell line)세포를 가지고 EZ- CyTox kit로 측정 하여 확인하였다. 대조군의 중앙값을 기준으로 실험군의 O.
정상세포인 MG-63세포를 control로 하여 80% 메탄올 추출물은 농도별로 독성 실험을 실시한 결과 100 μg/ml 에서는 약 20%정도의 세포 독성이 나타남을 확인 하였다. 비교군으로 DMSO를 사용하였으며 세포 독성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다[Fig. 3].
생체 내 산화적 스트레스와 관련 있는 DPPH radical 소거 활성을 측정하여 오배자 추출물의 효과를 알아보았다. DPPH는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 자유라디칼로서 항산화제에 의해 환원되어 색이 탈색된다.
세포 생존율을 알아보기 위해 실시한 실험방법은 96 well plate에 1 × 104 cells/100 μl/well이 되도록 동일하게 분주하여 하룻밤 키운 후 시약을 농도 별로(1, 3, 10, 30그리고 100 μg/ml)처리 후 48시간 동안 배양하였다.
안전한 농도는 100 μg/ml 이하로 처리 하였을 때 세포에 독성이 없는 것으로 확인 되어 본 세포 독성 실험의 확인으로 in vitro 실험에 있어서 세포에 직접처리 할 수있는 최적의 농도를 결정하였다.
양성대조물로 강력한 항산화 물질인 비타민 C(ascorbic acid)를 시료 농도와 같이 희석해 사용하여 시료와 항산화 활성을 농도별로 비교하도록 하였다. blank엔 시료대신 메탄올 100 μl를 첨가 하여 시료와 흡광도를 비교하였다.
여과된 추출액은 진공농축기(Centrifugal Vacuum Concentrotor)를 이용하여 감압 농축하여 추출물을 회수하였다. 보다 세분화된 분획물을 회수하기 위해 용매의 극성을 달리하여 순차적으로 용매분획물을 회수하였다.
각 시료의 항산화작용은 DPPH에 대한 전자공여능(Electron donating ability, EDA%)과 IC₅₀(DPPH radical 형성을 50% 억제하는데 필요한 μl 농도)로 나타내었다. 이후 효과가 좋은 fraction과 단일물질 등은 농도를 낮게(25, 50, 100, 200 그리고 500 ppm) 하여 같은 방법으로 측정하였다.
보다 세분화된 분획물을 회수하기 위해 용매의 극성을 달리하여 순차적으로 용매분획물을 회수하였다. 즉 극성이 낮은 용매부터 극성이 높은 용매순으로 순차적으로 용매분획하여 분획물들을 획득하였다. n-헥산과물을 동량의 비율로 분획 추출하여 n-헥산층을 분리하였고, 동일한 방법으로 디에틸에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물층으로 분획하여 얻어진 각각의 용매 분획물들을 감압 농축시켜서 분획물을 얻었다[Fig.
각 well에 10 ul의 Ez-Cytox 시약을 첨가하여 37℃에서 3시간 배양한 후 흡광도를 ELISA reader(Emax, Molecular Device)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 측정된 흡 광도 값은 시료를 처리하지 않는 군을 100으로 했을 때 산출한 %값으로 세포 생존율을 계산하였다.

대상 데이터

)는 2014년에 채취한 국산 제품을 청명약초(한국)에서 구입한 후 정량하여 사용하였다. 건조된 오배자 시료를 구입하여 300g을 분쇄하여 1L의 80% 메탄올을 분쇄한 오배자 시료에 첨거하여, 상온(25℃)에서 3일 동안 정치시켜 추출물을 얻었다. 80% 메탄올을 이용하여 추출한 오배자 추출물을여과지(ADVANTEC, NO.
본 실험의 시료로 사용한 오배자(Gallnut, Galla Rhois, GR, Rhus javanica L.)는 2014년에 채취한 국산 제품을 청명약초(한국)에서 구입한 후 정량하여 사용하였다. 건조된 오배자 시료를 구입하여 300g을 분쇄하여 1L의 80% 메탄올을 분쇄한 오배자 시료에 첨거하여, 상온(25℃)에서 3일 동안 정치시켜 추출물을 얻었다.
사람의 골육종 세포에서 유래한 MG-63세포는 human MG-63 osteoblast-like osteosarcoma cells line으로 전남대학교 치의학전문대학원에서 분양을 받아 본 실험에 사용하였다. MG-63 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, GIBCO)와 100 unit/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin(GIBCO)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM, GIBCO)에 접종하여 습도가 유지된 37℃, 5% CO₂항온기에서 배양하였다.

데이터처리

실험결과의 통계처리는 window용 SPSS 21.0 version(SPSS Inc)을 사용하였으며, 모든 측정값은 평균±표준오차(Mean±SEM)로 표시하였고, 분석에 대한 유의성은 Student's t-test로 검증 하였으며, p<0.05 에서 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

이론/모형

세포 독성평가는 Naramwongsatit[8]가 기술한 방법을 참고하였으며, EZ-CyTox Enhanced cell viability assay kit (Daeil Lab)을 사용하여 측정하였다.

성능/효과

80% 메탄올 추출물은 95.9%, n-헥산 추출물은 93.1%, 디에틸에테르 추출물은 91.1%, 클로로포름 추출물은 92.0% 그리고 에틸아세테이트 추출물은 90.5%로 나타났다. 따라서 오배자를 이용한 각 추출물에 의한 세포 독성은 유발되지 않음을 확인하였다[Fig.
¯)의 생성 억제 여부를 확인하였다. [Fig. 4]에서 보는 바와 같이 얻어진 각 오배자 추출물 모두 NO 생성 억제 활성을 나타냈으며, 특히 80% 메탄올 추출물과 n-헥산 추출물에서 62%, 68%의 강한 NO생성 억제 활성을 나타냈다. 이를 양으로 계산하면 LPS를 단독으로 처리했을 때 NO 생성량이 23 μM 생성되었으나, 오배자 80% 메탄올 추출물에서는 9 μM, 핵산 추출물에서는 8 μM의 NO 생성량이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
5%로 나타났다. 따라서 오배자를 이용한 각 추출물에 의한 세포 독성은 유발되지 않음을 확인하였다[Fig. 2].
4%이다. 오배자 80% 메탄올 추출물은 27.8%, n-헥산 추출물은 30.5%, 디에틸에테르 추출물은 51.7%, 클로로포름 추출물은 66.4% 그리고 에틸아세테이트 추출물은 62.4%의 자유라디칼 소거 억제능을 알 수 있다.
오배자 n-헥산 추출물에서 100 μg/ml 농도까지 세포독성이 없음을 확인하였고, 80% 메탄올 추출물은 100 μg/ml 이상에서의 약 20%정도의 세포 독성이 나타남을 확인 하였다.
오배자 n-헥산 추출물은 100 μg/ml 처리 하였을 때 세포는 약 3%가량이 사멸함을 알 수 있었다.
선행 연구에서 높은 농도의 NO는 조골세포(osteoblast)의 증식과 분화를 억제하지만 낮은 농도의 NO는 조골세포의 기능을 자극한다고 알려져 있었다[16,17]. 오배자 추출물은 염증반응을 억제하고 조골세포의 분화능을 향상시켜 치주염에 대한 예방 및 치료 활성을 가짐을 예측 할 수 있었다. 장기간 사용해도 부작용이 적은 천연물 유래소재를 발굴을 위한 시도로 오배자 80% 메탄올추출물과 n-헥산 추출물에서 NO 생성량도 현저하게 감소하였으며, DPPH radical 소거능도 탁월하게 감소하는 것을 확인하였다.
오배자 추출물을 실험에 사용하기 위해 세포독성 평가를 통하여 오배자 추출물이 독성이 없는 것임을 확인하였다. 선행 연구에서 높은 농도의 NO는 조골세포(osteoblast)의 증식과 분화를 억제하지만 낮은 농도의 NO는 조골세포의 기능을 자극한다고 알려져 있었다[16,17].
이를 양으로 계산하면 LPS를 단독으로 처리했을 때 NO 생성량이 23 μM 생성되었으나, 오배자 80% 메탄올 추출물에서는 9 μM, 핵산 추출물에서는 8 μM의 NO 생성량이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
오배자 추출물은 염증반응을 억제하고 조골세포의 분화능을 향상시켜 치주염에 대한 예방 및 치료 활성을 가짐을 예측 할 수 있었다. 장기간 사용해도 부작용이 적은 천연물 유래소재를 발굴을 위한 시도로 오배자 80% 메탄올추출물과 n-헥산 추출물에서 NO 생성량도 현저하게 감소하였으며, DPPH radical 소거능도 탁월하게 감소하는 것을 확인하였다.
정상세포인 MG-63세포를 control로 하여 80% 메탄올 추출물은 농도별로 독성 실험을 실시한 결과 100 μg/ml 에서는 약 20%정도의 세포 독성이 나타남을 확인 하였다.

후속연구

고령사회로 진입하는 사회 구조를 비춰볼 때 웰니스 융복합 접근이 절대적으로 필요한 시기이다. 본 연구의 결과로 오배자의 유효성분 추출을 통한 항염증물질의 개발 연구에 있어서 중요한 기초자료가 될 것이라고 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	오배자의 주요성분과 효능은?	오배자는 매미목의 진딧물과의 곤충인 오배자 면충이 야생에 기생하는 붉나무의 새잎에 기생함으로써 형성된 충영으로서 일본, 중국과 함께 우리나라 각지에 분포한다. 주요성분인 탄닌이 50-60% 정도 차지하고 있으며 대부분 지혈작용과 항균작용을 한다고 알려져 있다[3]. 생화학적 작용으로는 'Gallotannins' 성분은 수렴 작용이 있으며, 간 기능 보호 작용과 항산화 작용을 한다[4,5].
	치태와 치석은 어떠한 질환을 일으키는가?	구강내 염증반응은 박테리아나 바이러스에 의해 치아와 잇몸(치은) 주변부에서 치태(dental plaque)가 생성되고, 생성된 치태는 점차 석회화되어 치아의 표면에 치석(dental calculus)을 형성하게 된다. 치태와 치석은 구강 세균의 증식 거점이 되어 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis)과 같은 잇몸 염증질환을 일으킨다. 이러한 잇몸질환은 치조골 소실이 진행이 되면 더 이상 치아는 회복할 수 없는 상태가 된다[1].
	천연물의 장점은?	천연물은 구강 내에서 치아 우식유발을 억제하는데 있어서 부작용이 없이 지속적으로 사용할 수 있다는 장점 때문에 많은 관심을 받고 있다. 최근 이슈가 되었던 파라벤은 전세계적으로 안정성을 인정을 받아 장기간 사용되어 오다가 최근에 그 위험성이 대두되면서 논쟁의 중심에 있는 성분이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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