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문제 정의
- 17). 본 실험에서는 민간 및 한방에서 애용되고 있는 결명자의 효능을 검정하고 소재화 하는 연구의 일환으로 결명자가 간 기능에 미치는 영향을 검토하고자 결명자 에탄올 추출물이 사염화탄소로 간 손상을 유발한 흰쥐에 있어서 간 기능 관련 효소 활성도 및 과산화 지질함량에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 간 1 g에 1.15% KCl 9mL을 가하여 Teflon Potter-Elvehjem homogenizer로 마쇄한 후 600 X g에서 10분간 원심분리하여 그 상층액을 과산화지질 분석을 위한 시료로 사용하였다. 과산화지질의 분석은 Ohkawa 등의 방법(21)에 따라 분석하였으며 표준물질로서는 1, 1, 3, 3, -tettaethoxypropane을 사용하였다.
- 결명자는 이물질을 골라내고, 물로 씻어 30℃ 건조기에서 건조시킨후, 40 mesh로 분쇄하여 70%에 탄올 용액을 시료 중량의 10배를 가하여 16시간 동안 shaking한 다음 Toyo No.2 여지를 사용하여 여과하였다. 여액은 감압 농축 시킨 후 동결건조하여 추출물 시료로 사용하였으며 추출물의 수울은 약 11.
- 결명자의 에탄올 추출물이 사염화탄소를 투여한 흰쥐의 간 손상에 미치는 영향을 알아보기 위하여 정상군, 사염화탄소 대조군, 결명자 에탄올 추출물 0.25% 첨가군 및 0.5% 첨가 군으로 나누어 5주간 사육한 후 혈청 중 간기능 관련 효소의 활성 변화, 혈청 및 간장의 지질 및 지질과 산화물의 함량, 간조직 중의 catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase의 활성변화를 관찰하였다. 체중 증가량 및 식이 섭취량은 각 군간 유의적 차이가 없었고, 간 중량은 정상군에 비해 사염화탄소 처리군에서 증가하였으며, 혈청지질함량 및 간 조직 중의 지질함량에는 각군간 유의차가 없었다.
- 5% 추출물 투여군으로 나누어 5주간 사육하였으며 물과 실험식이는 자유롭게 공급하였다. 본 실험에 사용한 식이는 AIN-76 diet조성(com starch 45%, casein 20%, sucrose 20%, com oil 5%, cellulose 5%, mineral mix 3.5%, vitamin mix 1%, methionine 0.3%, choline chloride 0.2%)에 준하여 결명자 에탄올 추출물을 각각 0.25%, 0.5%되게 기본식이에 더하여 공급하였고 식이 섭취량은 격일에 한 번 측정하였으며 체중은 매주 측정하였다. 실험군에는 사염화탄소: 올리브유를 1:1의 비율로 혼합한 용액을 1 mL/kg.
- 5%되게 기본식이에 더하여 공급하였고 식이 섭취량은 격일에 한 번 측정하였으며 체중은 매주 측정하였다. 실험군에는 사염화탄소: 올리브유를 1:1의 비율로 혼합한 용액을 1 mL/kg.bw.day씩 1일 간격으로 2회복강내로 투여하였고 대조군에는 동량의 올리브유를 동일한 방법으로 투여하였다. 실험동물은 처치 전 12시간 동안 물만 주고 금식시켰으며 마지막 사염화탄소투여 24시간 후 에테르마취하에 개복한 후 복부대동맥으로부터 채혈하고 간, 심장, 신장, 비장을 적출하여 식염수로 씻은 후 trimming하여 무게를 측정한 후 측정시까지 -70℃에서 보관하였다.
- day씩 1일 간격으로 2회복강내로 투여하였고 대조군에는 동량의 올리브유를 동일한 방법으로 투여하였다. 실험동물은 처치 전 12시간 동안 물만 주고 금식시켰으며 마지막 사염화탄소투여 24시간 후 에테르마취하에 개복한 후 복부대동맥으로부터 채혈하고 간, 심장, 신장, 비장을 적출하여 식염수로 씻은 후 trimming하여 무게를 측정한 후 측정시까지 -70℃에서 보관하였다. 채취한 혈청은 실온에서 1시간 이내로 방치시킨 다음 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였으며, 분석 전까지 -70℃에서 보관하였다.
- 혈청중 총콜레스테롤과 중성지방 함량 측정 및 AST, ALT, alkaline pholphotase(ALP), Γ-GTP활성측정은 (주)신양화학의 kit을 이용하여 분석하였다. 즉, 총 콜레스테롤은 Cholestezyme- V 중성지방은 Triglyzyme-V를 이용하여 측정하였으며, AST, ALT활성측정은 Reitman-Frankel법에 준한 혈청지오티 지피티 측정 세트로, ALP는 King-king법을 변경 개량한 뉴케어-포스로, Γ-GTP는 Γ-Glutamyl-p-nitroanilide기질법에 의한 Γ-GTP-S를 사용하여 활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 실험 재료로 사용한 결명자는 1998년 경북 고령산을 구입하였다. β-NADPH, glutathione reductase, CDNB는 sigma사로부터 구입하였고, 혈청지질 및 효소활성 측정에 사용한 kit는 (주)신양화학으로부터 구입하여 사용하였으며 나머지 시약은 일급 이상의 것을 사용하였다.
- 실험 재료로 사용한 결명자는 1998년 경북 고령산을 구입하였다. β-NADPH, glutathione reductase, CDNB는 sigma사로부터 구입하였고, 혈청지질 및 효소활성 측정에 사용한 kit는 (주)신양화학으로부터 구입하여 사용하였으며 나머지 시약은 일급 이상의 것을 사용하였다.
- 실험동물은 6주령된 Sprague Dawley계 수컷 흰 쥐를 대한 바이오링크(주)로부터 구입하여 1주일간 기본식이로 적응시킨 후, 난괴법에 의해 정상군, 사염화탄소 투여 대조군, 0.25% 추출물 투여군, 0.5% 추출물 투여군으로 나누어 5주간 사육하였으며 물과 실험식이는 자유롭게 공급하였다. 본 실험에 사용한 식이는 AIN-76 diet조성(com starch 45%, casein 20%, sucrose 20%, com oil 5%, cellulose 5%, mineral mix 3.
데이터처리
- Values are mean ± S.E (n=8) and those in the same column not sharing common superscript letters are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- Values are mean±S.E (n=8) and those in the same row not sharing common superscript letters are significantly different at p<0.05 by Duncan'smultiple range test.
- 실험 결과는 SAS를 이용하여 실험군 당 평균±표준 오차로 나타내었으며 각군의 유의차 검정은 분산분석을 한 후 α=0.05 수준에서 Duncan의 다중비교법에 의해 검증하였다.
이론/모형
- 조제된 시료는 분석 시까지 -70℃에서 냉동 보관하였다. Catalase의 활성측정은 기질인 hydroxide peroxide가 분해되는 정도를 측정하는 Abei(18)의 방법에 준하였고, superoxide dismutase 활성도는 Marklund와 Marklund(19)의 방법, glutathione peroxidase는 Lawrence와 Burk(20)의 방법에 의하여 측정하였다.
- 각효소원의 단백질량은 Lowry법(23)에 의해 정량하였고 표준단백질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
- 과산화지질의 분석은 Ohkawa 등의 방법(21)에 따라 분석하였으며 표준물질로서는 1, 1, 3, 3, -tettaethoxypropane을 사용하였다. 간조직 중의 지질은 Folch법(22)으로 추출한 후 분석 kit을 사용하여 cholesterol과 triglyceride의 함량을 측정하였다.
- 15% KCl 9mL을 가하여 Teflon Potter-Elvehjem homogenizer로 마쇄한 후 600 X g에서 10분간 원심분리하여 그 상층액을 과산화지질 분석을 위한 시료로 사용하였다. 과산화지질의 분석은 Ohkawa 등의 방법(21)에 따라 분석하였으며 표준물질로서는 1, 1, 3, 3, -tettaethoxypropane을 사용하였다. 간조직 중의 지질은 Folch법(22)으로 추출한 후 분석 kit을 사용하여 cholesterol과 triglyceride의 함량을 측정하였다.
- 이용하여 분석하였다. 즉, 총 콜레스테롤은 Cholestezyme- V 중성지방은 Triglyzyme-V를 이용하여 측정하였으며, AST, ALT활성측정은 Reitman-Frankel법에 준한 혈청지오티 지피티 측정 세트로, ALP는 King-king법을 변경 개량한 뉴케어-포스로, Γ-GTP는 Γ-Glutamyl-p-nitroanilide기질법에 의한 Γ-GTP-S를 사용하여 활성을 측정하였다.
성능/효과
- 사염화탄소 대조군의 AST, A1T활성은 정상군에 비하여 2배 이상 유의하게 증가하였으나 결명자 에탄올 추출물 처리군은 대조군에 비하여 유의하게 감소하였으며 추출물의 첨가농도가 증가할수록 더 많이 감소하였다. ALP, Γ-GTP의 활성도 같은 경향을 나타내었으며, TBARS함량도 대조군에 비하여 결명자 에탄올 추출물투여군이 유의하게 낮아졌다. 간조직 중의 catalase활성은 사염화탄소투여에 의해유의하게 활성이 감소되었다가 추출물투여군에서 증가하는 경향을 나타내었으며 SOD활성에는 유의차가 없었다.
- 또한 ALT. AST와 함께 간, 담도계 질환의 지표효소로 알려진 ALP 활성도 사염화탄소 처리로 유의하게 증가하였고 결명자 추출물 첨가시 증가된 활성이 감소하여 0.5% 첨가군에서는 거의 정상군 수준으로 회복되었다. Γ-GTP도 침윤성 간질환 및 알코올에 의한 간 손상 지표효소의 하나로서 이러한 병변시 유의하게 증가하는 것으로 알려져 있는데 본 실험에서도 사염화탄소에 의하여 유의하게 증가하였고 결명자 추출물의 첨가 농도에 따라 유의하게 감소하여 농도의존성을 나타내었으나 0.
- 간조직 중의 catalase활성은 사염화탄소투여에 의해유의하게 활성이 감소되었다가 추출물투여군에서 증가하는 경향을 나타내었으며 SOD활성에는 유의차가 없었다. GHS-Px활성은 사염화탄소 투여에 의해 높아진 대조군의 효소 활성이 추출물 투여군에서 유의하게 낮아짐을 볼 수 있었으며 추출물의 농도가 높을수록 더 많이 감소하였다. 이상의 실험 결과 사염화탄소의 투여로 인해 높아진 혈청 중의 간기능 관련 각종 효소 및 지질과 산화물의 함량이 결명자 에탄올 추출물을 투여함으로써 감소되었으며 추출물의 첨가농도가 증가함에 따라 그 효과가 뚜렷한 것으로 보아 결명자 에탄올 추출물이 흰쥐에 있어서 사염화탄소 처리로 인한 간 손상을 감소시키는 효과가 있는 것으로 판단되었다.
- 5% 첨가군에서는 거의 정상군 수준으로 회복되었다. Γ-GTP도 침윤성 간질환 및 알코올에 의한 간 손상 지표효소의 하나로서 이러한 병변시 유의하게 증가하는 것으로 알려져 있는데 본 실험에서도 사염화탄소에 의하여 유의하게 증가하였고 결명자 추출물의 첨가 농도에 따라 유의하게 감소하여 농도의존성을 나타내었으나 0.5% 첨가 수준에서도 정상군까지는 회복되지 못하였다. 이상과 같이 결명자 에탄올 추출물은 사염화탄소에 의하여 증가된 간질환 관련 효소들의 활성을 유의하게 감소시킨 것으로 보아 사염화탄소에 의해 유발되는 간 조직의 손상을 억제하는 작용이 뚜렷한 것으로 판단되었다.
- ALP, Γ-GTP의 활성도 같은 경향을 나타내었으며, TBARS함량도 대조군에 비하여 결명자 에탄올 추출물투여군이 유의하게 낮아졌다. 간조직 중의 catalase활성은 사염화탄소투여에 의해유의하게 활성이 감소되었다가 추출물투여군에서 증가하는 경향을 나타내었으며 SOD활성에는 유의차가 없었다. GHS-Px활성은 사염화탄소 투여에 의해 높아진 대조군의 효소 활성이 추출물 투여군에서 유의하게 낮아짐을 볼 수 있었으며 추출물의 농도가 높을수록 더 많이 감소하였다.
- 그 중 간장에 가장 많이 존재하며 효소 내부의 이러한 금속의 산화환원작용으로 인하여 superoxide radical에 전자를 전달하여 독성을 가지는 superoxide radical을 H2O2로 전환시켜 해독하는 역할을 한다(34). 결명자 추출물 첨가군의 경우, 사염탄소 투여 대 조군에 비해 SOD 활성이 증가하는 경향을 나타내었으며 통계적 유의차는 없었다. GSH-Px는 selenium을 가진 항산화계 효소로서 체내에 존재하는 glutathione(GSH)을 기질로 하여 과산화지질과 H2O2의 무독화에 관여하며, catalase와 기능은 유사하나 생체 내 분포 부위가 다르고(35), 철분, 비타민E, 필수지방산의 결핍 시 그 활성이 감소되고, 산화적 스트레스에 의해 활성이 증가하는 것으로 보고되어있다(36).
- 과산화지질의 지표로서 TBARS량을 측정한 결과 사염화탄소로 간 손상을 유발시켰을 때 정상군에 비해 150% 정도 증가하였다. 이는 사염화탄소를 투여함으로써 간 조직의 지질과 산화물함량이 현저하게 증가했다고 보고한 Noll 등(3)의 연구 결과와도 일치하였다.
- GSH-Px는 selenium을 가진 항산화계 효소로서 체내에 존재하는 glutathione(GSH)을 기질로 하여 과산화지질과 H2O2의 무독화에 관여하며, catalase와 기능은 유사하나 생체 내 분포 부위가 다르고(35), 철분, 비타민E, 필수지방산의 결핍 시 그 활성이 감소되고, 산화적 스트레스에 의해 활성이 증가하는 것으로 보고되어있다(36). 본 실험에서 사염화탄소 단독 투여군의 GSH-Px는 정상군보다 높았으며, 결명자 추출물을 공급한 군은 사염화탄소 단독 투여군보다 유의하게 감소되었는데 이는 결명자 추출물이 사염화탄소에 의한 free radical의 생성을 저하시킨 것으로 추측된다. 이와 같이 사염화탄소 투여시 생체 내에서 효소적 항산화계를 담당하는 catalase, SOD, GSH-Px의 변화를 검토한 결과 catalase 와 SOD는 감소한 반면 GSH-Px는 증가하는 경향을 나타내었는 데이는 사염화탄소를 투여한 흰쥐의 항산화계 효소 활성도를 조사한 한과 조(37)의 연구 결과와 유사하다.
- 체중 증가량 및 식이 섭취량은 각 군간 유의적 차이가 없었고, 간 중량은 정상군에 비해 사염화탄소 처리군에서 증가하였으며, 혈청지질함량 및 간 조직 중의 지질함량에는 각군간 유의차가 없었다. 사염화탄소 대조군의 AST, A1T활성은 정상군에 비하여 2배 이상 유의하게 증가하였으나 결명자 에탄올 추출물 처리군은 대조군에 비하여 유의하게 감소하였으며 추출물의 첨가농도가 증가할수록 더 많이 감소하였다. ALP, Γ-GTP의 활성도 같은 경향을 나타내었으며, TBARS함량도 대조군에 비하여 결명자 에탄올 추출물투여군이 유의하게 낮아졌다.
- Catalase는 간에 가장 많이 존재하며, 체내에서 지방의 자동산화 및 유기물의 산화로 생긴H2O2를 분해하여 무독화시키는 free radical scavenging효소중의 하나이다. 사염화탄소 투여대조군의 catalase 활성은 정상군에 비해 유의하게 감소하였고 이는 Rex 등(32)즈의 연구 결과와 일치하며, 사염화탄소 처리 시 결명자 추출물에 의하여 catalase활성이 증가하는 경향을 보였다. SOD활성역시 사염화탄소 투여에 의해 유의성은 없었으나 활성이 감소하는 경항을 보였는데 이는 사염화탄소 투여에 의해 SOD 활성이 감소하였다는 윤 등(33)의 보고와 일치하는 결과이다.
- 나타내었다. 우선 체중 증가량을 보면 사염화탄소 투여 대조군은 정상군에 비하여 크게 감소하였고 결명자 추출물군은 대조군에 비하여 높은 값을 나타내었으나 통계적 유의차는 없었다. 식이섭취량도 유의차는 없었으나 사염화탄소투여 대조군에서 낮은 값을 나타내었고 결명자 추출물군은 정상군과 비슷한 수준이었다.
- 우선 혈청 중의 AST, ALT활성을 보면, 정상군에 비해 사염화탄소투여 대조군에서 유의하게 증가하였고, 추출물 첨가 군에서는 사염화탄소 처리로 인하여 증가된 활성을 유의하게 감소 시켜 정상군과 거의 비슷한 값을 유지하였으며 이러한 효과는 추출물의 첨가 농도가 높을수록 높게 나타났다. 사염화탄소처리등 급성 간 손상시는 혈중 ALT, AST활성도가 급격하게 증가하며, 또한 심한 바이러스성 간염, 독성물질에 의한 간 손상, 등과 같이 상당한 간괴사가 있는 경우에 혈액 중으로 유리되어 높은 활성을 나타내게 된다.
- Table 2에 나타내었다. 우선 혈청지질함량을 보면,cholesterol함량은 통계적 유의차는 없었으나 정상군에 비해 약간 낮은 경향을 나타내었고 결명자 추출물 투여군은 대조군과 거의 차이가 없었다. Triglyceride함량의 경우에도 cho- lesterol과 마찬가지로 사염화탄소 처리 및 결명자 추출물을 첨가함에 따른 통계적 유의차는 없었다.
- 또한 윤 등(30)은 사염화탄소 처리시 혈청 콜레스테롤 함량이 감소하며 α-lipoprotein의 분획비도 저하하였다고 보고하고 있다. 이러한 점 등을 종합해 볼 때, 사염화탄소 처리 시 체내지질함량은 흰쥐의 사육 상태, 사염화탄소 처리조건 등 실험조건에 따라 영향을 받으며 결명자 추출물은 본 실험조건하에서의 체내 지질 함량에는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 사료되었다.
- 5% 추출물 첨가군 모두 사염화탄소 투여대조군에 비해 TBARS함량이 유의하게 감소하였다. 이러한 점으로 미루어 볼 때, 결명자 에탄올 추출물에는 간장조직의 과산화 지질 생성을 억제하는 뚜렷한 역할이 있는 것으로 판단되었다.
- 5% 첨가 수준에서도 정상군까지는 회복되지 못하였다. 이상과 같이 결명자 에탄올 추출물은 사염화탄소에 의하여 증가된 간질환 관련 효소들의 활성을 유의하게 감소시킨 것으로 보아 사염화탄소에 의해 유발되는 간 조직의 손상을 억제하는 작용이 뚜렷한 것으로 판단되었다. 또한 본 연구팀에서 결명자 추출물에는 강한 항산화 작용이 있는 것을 확인한 바 있으며 (data 생략), Choi 등 ⑬도 결명자 메탄올 추출물에서 강한 radical scavenging 활성이 있는 것으로 보고한 점 등을 미루어 볼 때, 결명자 에탄올 추출물이 사염화탄소와 같은 zenobiotics 에 의하여 생성되는 free radical의 scavenging 작용도 이러한 효과를 나타내는 한 요인으로 사료되며 이에 대한 자세한 연구가 요구된다.
- GHS-Px활성은 사염화탄소 투여에 의해 높아진 대조군의 효소 활성이 추출물 투여군에서 유의하게 낮아짐을 볼 수 있었으며 추출물의 농도가 높을수록 더 많이 감소하였다. 이상의 실험 결과 사염화탄소의 투여로 인해 높아진 혈청 중의 간기능 관련 각종 효소 및 지질과 산화물의 함량이 결명자 에탄올 추출물을 투여함으로써 감소되었으며 추출물의 첨가농도가 증가함에 따라 그 효과가 뚜렷한 것으로 보아 결명자 에탄올 추출물이 흰쥐에 있어서 사염화탄소 처리로 인한 간 손상을 감소시키는 효과가 있는 것으로 판단되었다.
- 5% 첨가 군으로 나누어 5주간 사육한 후 혈청 중 간기능 관련 효소의 활성 변화, 혈청 및 간장의 지질 및 지질과 산화물의 함량, 간조직 중의 catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase의 활성변화를 관찰하였다. 체중 증가량 및 식이 섭취량은 각 군간 유의적 차이가 없었고, 간 중량은 정상군에 비해 사염화탄소 처리군에서 증가하였으며, 혈청지질함량 및 간 조직 중의 지질함량에는 각군간 유의차가 없었다. 사염화탄소 대조군의 AST, A1T활성은 정상군에 비하여 2배 이상 유의하게 증가하였으나 결명자 에탄올 추출물 처리군은 대조군에 비하여 유의하게 감소하였으며 추출물의 첨가농도가 증가할수록 더 많이 감소하였다.
후속연구
- 이상과 같이 결명자 에탄올 추출물은 사염화탄소에 의하여 증가된 간질환 관련 효소들의 활성을 유의하게 감소시킨 것으로 보아 사염화탄소에 의해 유발되는 간 조직의 손상을 억제하는 작용이 뚜렷한 것으로 판단되었다. 또한 본 연구팀에서 결명자 추출물에는 강한 항산화 작용이 있는 것을 확인한 바 있으며 (data 생략), Choi 등 ⑬도 결명자 메탄올 추출물에서 강한 radical scavenging 활성이 있는 것으로 보고한 점 등을 미루어 볼 때, 결명자 에탄올 추출물이 사염화탄소와 같은 zenobiotics 에 의하여 생성되는 free radical의 scavenging 작용도 이러한 효과를 나타내는 한 요인으로 사료되며 이에 대한 자세한 연구가 요구된다.
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