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제안 방법
- 이는 리포좀을 구성하는 인지질이 HDL과 교환되면서 봉입된 약물이 유출되기 때문이며, HDL에 의한 인지질의 제거는 주로 리포좀 이중증의 outer lay er에서 일어나는 것으로 보고되었다.11) 이러한 HDL에 의한 리포좀의 불안정화는 cholesterol(CH)을 첨가함으로써 억제시킬 수 있으나, 이는 동결 건조시에 오히려 약물을 유출시켜 봉입률을 떨어뜨리는 것으로 보고되어 있어5) 본 실험에서는 CH를 첨가하지 않았다.
- CLe DSPC만을 사용하여 제조하였고, SSLe DSPC에 DSPE-PEG 2000를 5% 첨가하여 제조하였으며, CL 및 SSL 모두 지질의 총량은 30 μmol/ml로 하였다. 둥근바닥 플라스크에 지질을 넣고 클로로포름으로 녹인 후, 회전 증발 농축기에서 상전이 온도이상을 유지하면서 감압증류하여 유기용매를 제거하였다.
- Sephadex G-25 컬럼을 이용한 gel filtration에 의해 리포좀에 봉입되지 않은 약물을 분리하였다. 분리된 유리약물과 리포좀에 봉입된 약물은 다음과 같은 방법을 이용하여 HPLC로 정량하였다.
- 동결 건조 전후 흰쥐 혈장에서 SSL로부터의 약물 방출 특성을 관찰하기 위해 방출 실험을 실시하였다. 미리 활성화시킨 투석막(MWCO 12,000)의 한쪽 끝을 집게로 고정시킨 후 흰쥐 혈장 0.
- 동결 건조에 따른 입자도의 변화를 통해 동결건조가 리포좀의 물리적 안정성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 리포좀 현탁액 일정량을 취해 count per second(cps)가 8,000- 12,000의 범위가 되도록 희석한 뒤 laser particle analyzer로 측정하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 반감기가 짧으며 수용액상에서 비교적 불안정한 약물로 알려진 스트렙토조신을 모델 물질로하여 SSL을 제조한 뒤, 동결 건조 전후의 물리적 특성을 비교하였다. 즉 SSL의 혈장에서의 안정성을 확인하고, 동결 건조가 SSL에 미치는 영향을 알아보기 위하여 입자도와 봉입률, 탁도변화, 흰쥐혈장에서의 in vitm 약물 방출 특성 등을 평가하였다.
- Oml/min, 주입량은 20μl로 하였다. 리포좀에 봉입된 약물의 경우 Triton-X 100 5% 용액으로, 처리하여 분석한 뒤 리포좀내의 봉입률을 산출하였다.
- 봉입되지 않은 약물을 분리하였다. 분리된 유리약물과 리포좀에 봉입된 약물은 다음과 같은 방법을 이용하여 HPLC로 정량하였다. 분석조건은 역상 컬럼 Capcell PAK (C18, 4.
- 둥근바닥 플라스크에 지질을 넣고 클로로포름으로 녹인 후, 회전 증발 농축기에서 상전이 온도이상을 유지하면서 감압증류하여 유기용매를 제거하였다. 약물 3mg/ml과 cryoprotectant로서 sucrose를 함유한 액을 넣어 상전이 온도 이상에서 수화시켜 multilamella vesicle(MLV)을 만든 후, extrusion을 실시하여 입자 100 mtn 정도의 unilamellar vesicle을 제조하였고3) 동결 건조시 lipid:sucrose=l:3(W/W>의 비율로 충분량의 sucrose를 가하였으며, 동결 건조후에는 3차 증류수에 재분산하였다.
- 축적되는 것으로 보고하였다. 이러한 사실에 근거하여 SSL이 혈중에 장시간 체류하도록 하기 위하여 extrusion의 방법을 사용하여 약 114nm로 입자도를 조절하였다.
- 입체구조적으로 안정한 리포좀(SSL)의 혈장내 안정성을 확보하고 수용액중에서 불안정한 약물을 봉입할 수 있는 리포좀 제제를 개발하기 위해 동결건조의 방법을 도입하였으며, 그에 따른 물리적 특성을 관찰하였다. 동결 건조에 의해서 SSL의 입자도가 약간 증가하긴 하였으나, 혈중에서 장시간 체류할 수 있는 크기인 50~ 200nm를 유지하였으며 봉입률의 변화도 거의 없었다.
- 탁도변화를 관찰하였다. 제조된 리포좀을 30배 희석한 후 흰쥐 혈장의 농도가 20%가 되도록 리포좀 희석액에 흰쥐 혈장을 가하고 UV/VIS spectrophotometer를 사용하여 파장 540nm에서 시간에 따른 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 즉 SSL의 혈장에서의 안정성을 확인하고, 동결 건조가 SSL에 미치는 영향을 알아보기 위하여 입자도와 봉입률, 탁도변화, 흰쥐혈장에서의 in vitm 약물 방출 특성 등을 평가하였다.
- 5 ml을 가한 뒤 기포를 제거하였다. 투석막 주머니의 다른 한쪽 끝을 집게로 고정하고 잘 섞이도록 흔들어준 후 투석막 주머니를 방출 매질인 37℃ 인산완충액 29 ml에 넣고 100rpm으로 교반하면서 각 시간별로 방출 매질 200μl를 취해 HPLC로 분석하여 정량하였다. 100% 방출량은 Triton X-100 5T 용액으로 처리한 스트렙토조신의 양으로 하였다.
- 혈장 단백질에 의한 리포좀의 aggregation을 평가하기 위하여 탁도변화를 관찰하였다. 제조된 리포좀을 30배 희석한 후 흰쥐 혈장의 농도가 20%가 되도록 리포좀 희석액에 흰쥐 혈장을 가하고 UV/VIS spectrophotometer를 사용하여 파장 540nm에서 시간에 따른 흡광도의 변화를 측정하였다.
대상 데이터
- Streptozocin, distearoylphosphatidylcholine(DSPC)은 Sigma (U.S.A.)에서 구입하였고, distearoylphosphatidylethanolamine -N-poly(ethyleneglycol) 2000(DSPE-PEG2000)은 Avanti Polar Lipids(U.S.A.)에서 구입하여 그대로 사용하였으며, 그외의 일반 시약은 특급 및 1급 시약을 사용하였다.
- 기기로는 rotary vacuum evaporator(Eyela, Tbkyo Rika- kikai Co., Japan), exttuder(Liposofast, Avestin Inc., Canada), HPLC system(Chromatointegrator D2500, Pump L7100, UV detector L4200H, Hitachi, Japan), Masterflex(Cole- Parmer Instrument Co., U.S.A.), Economic centrifugal vacuum concentrator(Ecospin 314, Hanil Research and Development, Korea), laser particle analyzer(LPA PARIU, Ostuka Electronics, Japan), vacuum freeze dryer(BEIA-A, Martin Christ Co., Germany), UV/VIS spectrophotometer (Varian cany 3, Varian INC., Austrailia)를 사용하였다.
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