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문제 정의
- 본 연구에서는 포유 동물세포에서 외부 유전자 발현을 mRNA의 안정도와 RNA polymerase Ⅱ의 turn-over율을 증가시킬 수 있는 효과적인 polyadenylation과 전사 종결을 통해 더욱 증가시키고자 하였다. 포유 동물세포 발현 벡터의 terminator로 작용하는 SV40 small T-antigen에 인간 gastrin 유전자의 transcription terminator를 도입한 결과 기존 포유 동물세포의 발현 벡터에서보다 외부 유전자 발현을 증가시켰다는 보고가 있어6) 본 연구에서는 terminator로 작용하는 SV40 p(A), SV40 small T-antigen, 인간 gastrin 3'UTR을 S2 세포에 적용시켜, 외래 단백질 발현에 미치는 영향을 검토하였다.
- 하였다. 포유 동물세포 발현 벡터의 terminator로 작용하는 SV40 small T-antigen에 인간 gastrin 유전자의 transcription terminator를 도입한 결과 기존 포유 동물세포의 발현 벡터에서보다 외부 유전자 발현을 증가시켰다는 보고가 있어6) 본 연구에서는 terminator로 작용하는 SV40 p(A), SV40 small T-antigen, 인간 gastrin 3'UTR을 S2 세포에 적용시켜, 외래 단백질 발현에 미치는 영향을 검토하였다.
제안 방법
- 6) 이 연구를 바탕으로 각각 SV40 p(A), SV40 small T-antigen, 인간 gastrin 3'UTR을 terminator로 지니는 발현 벡터를 S2 세포에서 한시적 발현 시킨 뒤 36시간 동안 배양하여 endostatin의 발현 정도를 Western blot 분석으로 비교해 보았다. 그 결과 SV40 small T-antigen, 인간 gastrin 3'UTR을 terminator로 사용할 때보다 SV40 p(A)를 tenninator로 사용했을 때 endostatin의 발현이 가장 높게 나타남을 알 수 있었다(Fig.
- 9) pMT/BiP-Endo-V5-His/SV40 p(A) 플라스미드를 Bgl Ⅱ와 Xho Ⅰ으로 절단하여 endostatin 유전자를 얻고 NEBlot Phototope Kit(New England BioLabs, USA)를 사용하여 biotin-dATP를 함유한 non-radiolabeled cDNA probe를 제조하고 hybridization에 이용하였다.
- Lipofectin 방법을 이용해 플라스미드 pMT/BiP-Endo-V5-His/ SV40 p(A), pMT/BiP-Endo-V5-His/SV40 T-antigen, pMTZBiPEndo-V5-His/SV40 T-antigen/HG 3'UTR 및 pMT/BiP-EndoV5-His/SV T-antigen/HG 3'UTR dimer는 플라스미드 pMT/ BiP-GFP-V5-His/SV40 p(A)과 동일한 방법으로 S2 세포에 transfection시켰다. 단지 endostatin은 lipofctin을 제거하기 위해 6-well plate의 transfection 배지를 1 ml의 항생제가 포함되지 않은 10% IMS가 첨가된 M3 배지로 바꿔주고 0.
- Sense primer는 5'-GTCGACGAIAAIAIA TGG-3'이며 anti-sense primer는 5'-GTCGACCTGCAGCTC-3'이다. PCR을 통해 증폭된 인간 gastrin 3'UTR을 Sal Ⅰ 제한 효소로 부분절단하였다. 여기서 얻은 88 bp 유전자 조각을 아가로스 겔 전기영동을 통하여 정제한 뒤 pGEM-T 벡터(Promerga, USA)에 삽입시켜 pGEM-T/HG 3'UTR을 만들었다.
- S2 세포에서의 외래 단백질 발현 시스템을 이용한 단백질의 한시적 발현 시간의 최적화를 위하여, 플라스미드 pMT/BiP-GFP-V5-His/SV40 p(A)를 한시적 발현시켰다. Lipofectin 방법을 이용하여 수행한 GFP의 한시적 발현의 경우 transfection 시킨 후 transfection 배지를 제거한 뒤 36-48시간 배양한 경우 가장 높은 GFP 발현을 보였다(Fig.
- 여기서 얻은 88 bp 유전자 조각을 아가로스 겔 전기영동을 통하여 정제한 뒤 pGEM-T 벡터(Promerga, USA)에 삽입시켜 pGEM-T/HG 3'UTR을 만들었다. pMT/BiP/V5-His(3.6 kb)를 Sal Ⅰ 제한 효소로 부분절단하고 그 사이에 HG 3'UTR을 삽입시켜 pMT/BiP-V5-His/SV 40p(A)/HG 3'UTR을 만들었다(Fig. 1). 이 재조합 플라스미드를 E.
- 단백질 시료는 Laemmli's 방법9)에 따라 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다. 겔에서 전기영동시킨 GFP 또는 endostatin 단백질을 nitrocellulose(Amersham, USA)로 전달시킨 뒤, mouse anti-V5(Invitrogen, USA) polyclonal antibody(l: 1000 v/v)와 rabbit anti-mouse IgG(Sigma, MO, USA) alkaline phosphatase conjugate (1:1000 v/v)를 사용하여 확인 하였다. BM purple AP substrate 용액 (Boehringer Mannheim, Germany)이나 BCIP/ NBT AP substrate 용액(Amresco, USA)을 첨가하여 반응 시킨 뒤 TBS buffer를 사용하여 반응을 중단시켰다.
- Lipofectin 방법을 이용해 플라스미드 pMT/BiP-Endo-V5-His/ SV40 p(A), pMT/BiP-Endo-V5-His/SV40 T-antigen, pMTZBiPEndo-V5-His/SV40 T-antigen/HG 3'UTR 및 pMT/BiP-EndoV5-His/SV T-antigen/HG 3'UTR dimer는 플라스미드 pMT/ BiP-GFP-V5-His/SV40 p(A)과 동일한 방법으로 S2 세포에 transfection시켰다. 단지 endostatin은 lipofctin을 제거하기 위해 6-well plate의 transfection 배지를 1 ml의 항생제가 포함되지 않은 10% IMS가 첨가된 M3 배지로 바꿔주고 0.5mM CuSO4를 첨가한 뒤 12, 24, 36, 48시간 동안 배양하여 발현을 유도하였다.
- 본 연구에서는 Hpofectin 방법8)을 이용해 플라스미드 pMT/BiP-GFP-V5-His/SV40 p(A)를 S2 세포에 transfection 시켰다. S2 세포는 2시간 전에 3×106 cells/well로 6-weD plate에 미리 접종 시킨다.
-
서로 다른 terminator를 이용하였을 때 외래 단백질의 발현정도 비교.
- PCR을 통해 증폭된 인간 gastrin 3'UTR을 Sal Ⅰ 제한 효소로 부분절단하였다. 여기서 얻은 88 bp 유전자 조각을 아가로스 겔 전기영동을 통하여 정제한 뒤 pGEM-T 벡터(Promerga, USA)에 삽입시켜 pGEM-T/HG 3'UTR을 만들었다. pMT/BiP/V5-His(3.
- 3 kb, Invitrogen, USA)를 사용하였다(Fig 1A). 이 실험으로 최적의 한시적 발현시간을 결정한 뒤 SV40 p(A)와 SV40 small T-antigen의 서로 다른 terminator를 이용하였을 때의 단백질 발현 및 mRNA 발현 정도를 비교 검토하기 위하여 pMT/BiP-Endo-V5-His/SV40 p(A), pMT/BiP-Endo-V5-His/SV40 T-antigen, pMT/BiP-Endo-V5-His/SV40 T-antigen/ HG 3'UTR, pMT/BiP-Endo-V5-His/SV40 T-antigen/HG 3' UTR dimer를 클로닝하였다(Fig. 1B, C, D, E).
- coli JM109는 50 μg/ml ampicillin이 함유된 LB고체 배지를 사용하였다. 인간 gastrin 3'UTR의 방향은 DNA sequencing7)을 통해 확인하였다.
대상 데이터
- DNA 제한효소는 TaKaRa(Tokyo, Japan)에서 구입하였고, T4 DNA ligase도 TaKaRa에서 구입하여 사용하였다. S2 세포 배양을 위한 M3 배지는 Sigma(MO, USA) 제품을 사용하였고, 선별을 위해 사용한 Hygromycin B는 DUCHEFA(Amsterdam, Netherland) 제품을 사용하였다.
- coli JM109을 사용하였다. E. coli JM109의 생육 배지로는 Luria-Bertani(LB) 액체 배지(l%(w/v) trypton, 0.5%(w/v) yeast extract, 0.5%(w/v) NaCl)와 고체 배지(1.5%(w/v) agar를 포함한 LB배지)에서 37℃로 배양하였으며, 형질전환된 E. coli는 ampicillin(50μg/ml)을 포함한 LB 배지를 사용하여 배양하였다.
- 형질전환된 S2 세포는 항생제 Hygromycin B(300μg/ml)를 포함하는 10% IMS가 포함된 M3 배지를 사용하여 배양하였다. GFP 또는 쥐 endostatin 유전자를 포함하는 pMT/BiP-GFP or Endo-V5-His/SV40 p(A) 플라스미드는 methallothionein promoter, BiP signal sequence, V5 epitope tag, polyhistidine 부위, SV 40 late polyadenylation signal 및 poly (A) signal을 포함하는 SV 40 small T-antigen을 포함하며, SV 40 small T-antigen은 pSV-β-galactosidase 벡터의 것을 사용하였다. 발현 벡터의 클로닝과 증식을 위한 숙주로는 E.
- T4 DNA ligase도 TaKaRa에서 구입하여 사용하였다. S2 세포 배양을 위한 M3 배지는 Sigma(MO, USA) 제품을 사용하였고, 선별을 위해 사용한 Hygromycin B는 DUCHEFA(Amsterdam, Netherland) 제품을 사용하였다. 한시적 발현에 사용된 lipofectin은 GIBCO/BRL(NY USA) 제품을 구입하여 사용하였다.
- GFP 또는 쥐 endostatin 유전자를 포함하는 pMT/BiP-GFP or Endo-V5-His/SV40 p(A) 플라스미드는 methallothionein promoter, BiP signal sequence, V5 epitope tag, polyhistidine 부위, SV 40 late polyadenylation signal 및 poly (A) signal을 포함하는 SV 40 small T-antigen을 포함하며, SV 40 small T-antigen은 pSV-β-galactosidase 벡터의 것을 사용하였다. 발현 벡터의 클로닝과 증식을 위한 숙주로는 E. coli JM109을 사용하였다. E.
- 한시적 발현에 사용된 lipofectin은 GIBCO/BRL(NY USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 세포 배양을 위해 사용된 T-25, F75, 6-well plate는 Nunc(NY USA) 제품을 사용하였다
-
인간 gastrin 3'UTR 유전자 클로닝.
- S2 세포 배양을 위한 M3 배지는 Sigma(MO, USA) 제품을 사용하였고, 선별을 위해 사용한 Hygromycin B는 DUCHEFA(Amsterdam, Netherland) 제품을 사용하였다. 한시적 발현에 사용된 lipofectin은 GIBCO/BRL(NY USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 세포 배양을 위해 사용된 T-25, F75, 6-well plate는 Nunc(NY USA) 제품을 사용하였다
- coli JM109 숙주 세포에 형질전환하였다. 형질전환된 재조합 E. coli JM109는 50 μg/ml ampicillin이 함유된 LB고체 배지를 사용하였다. 인간 gastrin 3'UTR의 방향은 DNA sequencing7)을 통해 확인하였다.
이론/모형
- 6-well plate의 배양액을 630×g value에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 분리한 뒤 상등액을 시료로 얻었으며, 재조합 단백질 확인에 상등액을 사용하였다. 단백질 시료는 Laemmli's 방법9)에 따라 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다. 겔에서 전기영동시킨 GFP 또는 endostatin 단백질을 nitrocellulose(Amersham, USA)로 전달시킨 뒤, mouse anti-V5(Invitrogen, USA) polyclonal antibody(l: 1000 v/v)와 rabbit anti-mouse IgG(Sigma, MO, USA) alkaline phosphatase conjugate (1:1000 v/v)를 사용하여 확인 하였다.
성능/효과
- 3) 세포내의 조건에 따라 합성되는 양이 급격히 변하는 단백질인 성장인자 단백질이나 유전자 조절단백질을 암호화하는 mRNA는 일반적으로 매우 불안정하며 mRNA 자체에 분해를 촉진하는 특정 서열이 존재한다. 예를 들어 몇몇 mRNA의 3'UTR에 존재하는 A와 U 염기가 풍부한 특정 서열을 DNA 재조합 기술에 의해 안정된 mRNA의 3'UTR에 이식하면, 그 mRNA는 불안정한 RNA로 전환된다.
- 각각 SV40 p(A), SV40 small T-antigen, 인간 gastrin 3'UTR을 terminator로 지니는 expression vector를 한시적 발현시킨 뒤 36시간 동안 배양하여 endostatin의 mRNA의 발현정도를 Northern blot 분석으로 확인해 본 결과, 역시 SV40 p(A)를 terminator로 이용한 경우 mRNA 발현량이 가장 높았다(Fig. 4, Lane 2).
- 6) 이 연구를 바탕으로 각각 SV40 p(A), SV40 small T-antigen, 인간 gastrin 3'UTR을 terminator로 지니는 발현 벡터를 S2 세포에서 한시적 발현 시킨 뒤 36시간 동안 배양하여 endostatin의 발현 정도를 Western blot 분석으로 비교해 보았다. 그 결과 SV40 small T-antigen, 인간 gastrin 3'UTR을 terminator로 사용할 때보다 SV40 p(A)를 tenninator로 사용했을 때 endostatin의 발현이 가장 높게 나타남을 알 수 있었다(Fig. 3). 포유 동물 세포 시스템과는 달리 S2 세포에서는 인간 gastrin 3'UTR을 ternmlator로 사용한 경우가 그렇지 않은 경우보다 외래 단백질 발현이 감소하였다.
- 포유 동물 세포 시스템과는 달리 S2 세포에서는 인간 gastrin 3'UTR을 ternmlator로 사용한 경우가 그렇지 않은 경우보다 외래 단백질 발현이 감소하였다. 이 실험 결과로 인간 gastrin 3'UTR의 transcription terminator가 동물 세포 시스템에서는 termiiiatioii에 영향을 미치지만 S2 세포에는 거의 영향을 주지 못하며, S2 세포에서는 포유 동물 세포와는 달리 SV40 p(A)가 가장 효과적인 teminator로 작용함을 확인할 수 있다.
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