초록 ▼

본 발명은 유산균 세포내 외래 단백질 발현 벡터 및 이를 이용한 락토바실러스 균종의 형질전환방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 락토바실러스 애시도필러스의 높은 형질전환 효율을 위한 전기천공법 (ELECTROPORATION)의 조건을 설정하고 형질전환체를 빠르게 선별할수 있는 PCR 프라이머를 제조하였으며 GFP 단백질을 세포내에서 발현할 수 있는 유산균용 벡터 PKU::SLPA-GFP를 제조하고, 이를 락토바실러스 애시도필러스 ATCC 43121 (LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ATCC 43121)에 형질전환시

본 발명은 유산균 세포내 외래 단백질 발현 벡터 및 이를 이용한 락토바실러스 균종의 형질전환방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 락토바실러스 애시도필러스의 높은 형질전환 효율을 위한 전기천공법 (ELECTROPORATION)의 조건을 설정하고 형질전환체를 빠르게 선별할수 있는 PCR 프라이머를 제조하였으며 GFP 단백질을 세포내에서 발현할 수 있는 유산균용 벡터 PKU::SLPA-GFP를 제조하고, 이를 락토바실러스 애시도필러스 ATCC 43121 (LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ATCC 43121)에 형질전환시켜 보고유전자로써 GFP의 가능성을 제시하는 것이다. 본 발명의 형질전환 방법과 발현 백터를 이용하여 유산균을 형질전환하면 원래의 특성을 변화시키지 않으며 재조합 단백질을 세포내에서 안정하게 발현시킬 수 있다.

대표청구항 ▼

그람 양성균의 복제원점 (ori), 복제유도단백질 유전자 (repA), 선별유전자인 클로람페니콜 (choloramphenicol) 저항성 유전자(cmr), slpA 프로모터, 삽입 외래 유전자 서열, 및 종결 시퀀스를 포함하는 외래 단백질을 발현할 수 있는 도 5의 개열지도를 갖는 유산균용 발현 벡터(pKU::slpA-GFP).제 1항에 있어서, 상기 외래 유전자는 GFP(green fluorescent protein) 또는 GFP 융합 유전자인 것을 특징으로 하는 유산균용 발현 벡터.slpA 프로모터 (제한효소 EcoRⅠ과 Xba

그람 양성균의 복제원점 (ori), 복제유도단백질 유전자 (repA), 선별유전자인 클로람페니콜 (choloramphenicol) 저항성 유전자(cmr), slpA 프로모터, 삽입 외래 유전자 서열, 및 종결 시퀀스를 포함하는 외래 단백질을 발현할 수 있는 도 5의 개열지도를 갖는 유산균용 발현 벡터(pKU::slpA-GFP).제 1항에 있어서, 상기 외래 유전자는 GFP(green fluorescent protein) 또는 GFP 융합 유전자인 것을 특징으로 하는 유산균용 발현 벡터.slpA 프로모터 (제한효소 EcoRⅠ과 XbaⅠ)와 종결시퀀스 (제한효소 PstⅠ과 HindⅢ)를 락토바실러스의 염색체 (chromosome) DNA를 주형으로 하여 PCR 증폭하는 단계, 외래 유전자 (제한효소 XbaⅠ과 PstⅠ)를 준비하는 단계, 각각의 유전자 단편들을 연속적으로 대장균 형질전환 백터인 pUC18의 제한효소자리(EcoRⅠ, XbaⅠ, PstⅠ과 HindⅢ)에 삽입하여 재조합벡터 pUC18::slpA-GFP-T.T를 제조하는 단계, 상기 재조합 벡터를 EcoRⅠ과 HindⅢ로 절단하는 단계, 및 동일한 제한효소 EcoRⅠ과 HindⅢ로 절단된 pNZ123에 연결하는 단계를 포함하는 재조합 백터(pKU::slpA-GFP)의 제조방법.락토바실러스 균종의 형질전환에 있어서, 컴피턴트 락토바실러스를 전기충격 전압 12-13 kV/cm, 전기충격 횟수 8-12회, 전기충격의 시간간격 400-600 ms, 플라스미드의 농도 20-30 ng/ul의 조건으로 전기천공하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 균종의 전기천공법.제 1항의 유산균용 발현 벡터로 형질전환된 락토바실러스 균종.서열번호 4 또는 5의 염기서열을 갖는 pNZ123 유래의 재조합 벡터로 형질전환된 헝질전환체에서 클로람페니콜 저항 유전자가 들어있는 pNZ123 유래의 재조합벡터의 빠른 선별을 위한 PCR 프라이머.