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문제 정의
- 본 연구는 우리나라의 해산 양식어류 양식장에서 발생하는 연쇄구균증 원인균의 종 조성과 미생물학적 특성을 밝히고자 하였다 안구 백탁. 안구출혈, 아가미뚜껑 출혈 및 복부 팽만 등의 증상이관찰되는 해산 양^어류에서 분리된 연쇄상구균의여러 균주들을 jSctococcus garvieae 와 생리학적, 생화학적, 혈청학적 특성을 비교하였다.
- 본 연구에서는 우리나라의 대표적 해산 양식어종인 넙치, 조피볼락 및 방어 등의 연쇄구균증 감염어에서 분리되는 원인균에 대한 종 조성을 생화학적 성상과 혈청 학적 특성으로 밝히고, L. garvieae 에대한 특이 PCRprimer를 이용하여 유전학적 연관성을 조사하였다
- 본 연구에서는 하절기에 주로 발생되어 대량폐사를 유발하는 연쇄구균증에 걸린 여러가지 해산어류로부터 분리된 균주들에 대해 생화학적 성상과 혈청학적 특성을 조사하고 PCR 방법을 통해 L. garv/eoe와의 연관성을 분석하고자 하였다. 이에 따른 분석 결과로 넙치에서 분리한 32 균주 중 KS1, KS2, KS5, KS6, KS8, KS9, KS12, KS13, KS16, KS20, KS23 균주는 그 표현형적 특성과, PCR Assay에서의 분석 결과가 참조균주인 L.
제안 방법
- ATCC49156(KG+) 균주를 BHI Moth에 30℃, 24시간 배양한 후 formalin을0.5% 첨가하여 실온에서 24시간 정치시켜 불활화하였다. FormaHn 불활화균액(fommalin killed cells, FKC)은 4℃ 에서 10, 000xg로 30분간 원심 분리하여 집균하고 PBS로 3회 세척한 후 습중량 2g/2 PBS의 농도로 현탁하여 냉장 보관하였다.
- MacConkey agar, SS agar, S. faecalis broth 및 KF Streptococcal bioth에서의 발육 상태를 조사하였으며, 0.01%tetmzolium이 첨가된 BHIA와BHIbmh를이용하여 6.5%NaCl, 10℃, 45℃, pH9.6 등의 각 조건하에서 성장유무를 조사하였다(Table 3).
- PCM] 의한 L. garvieae 16S rRNA 유전자 증폭을 위하여 분리된 염색체 DNA 100 ng, pLG-1 및 pLG2를 각각 100pmole(l ㎕씩 섞은 후 lOxTaq polymerase reaction buffer(100 mM Tris pH 8.3, 400 mM KC1, 15 mM MgC12, 10 mM DTT, 500 ㎕/ml BSA) 5 ㎕를 넣고 2.5 mM dNTP4 ㎕를 첨가하였다. 여기에 1 ㎕(1 unit) Taq polymerase를 넣고이것에 HaO35 ㎕를 가하여 최종 volume을 50 ㎕되게 맞춘후, 이들 sample을 94℃ 에서 10분간 반응시킨 다음 94℃ 에서 [분간 denaturalization, 55℃ 에서 [분간 annealing, 72℃ 1분간 extension하여 35 cycle로 수행하였으며 마지막 cycle의 extension 반응은 72℃ 에서 5분간 수행하였다.
- 그리고 용혈성 시험은 5% sheep blooE agar에 30 ℃, 24~48시간 배양한 후 결과를 판정하였다.
- 안구출혈, 아가미뚜껑 출혈 및 복부 팽만 등의 증상이관찰되는 해산 양^어류에서 분리된 연쇄상구균의여러 균주들을 jSctococcus garvieae 와 생리학적, 생화학적, 혈청학적 특성을 비교하였다. 또한 polymerase chain reaction(PCR) assay로 분리 균주들과 L garvieae의 연관성을 조사하였으며 연쇄구균증 원인균들의 분포 특성을 조사하였다.
- 본 실험에서 분리된 시험균을 이용하여 Table 2 에 나타낸 여러가지 항목의 생화학적 성상 검사를하였다.
- 5%NaCl이 첨가된 BMA 배지에서 28℃, 18-48시간 배양하여 순수 분리하였으며. 분리된 병원균에 대해서는 Gram 염색한 다음 균의 형태와 크기를 조사하고 아울러 현미경하에서 운동성 유무를관찰하였다.
- 안구출혈, 아가미뚜껑 출혈 및 복부 팽만 등의 증상이관찰되는 해산 양^어류에서 분리된 연쇄상구균의여러 균주들을 jSctococcus garvieae 와 생리학적, 생화학적, 혈청학적 특성을 비교하였다. 또한 polymerase chain reaction(PCR) assay로 분리 균주들과 L garvieae의 연관성을 조사하였으며 연쇄구균증 원인균들의 분포 특성을 조사하였다.
- 양식 방어에서 분리된 KS3과 KS14 균주는 생리, 생화학적 특성 시험 결과와 PCRassay에서 PCR 산물에 의한 예상 band를 확인할 수 있어 L. garvieae로동정하였다. 이것은 Kusuda.
- 여기에 1 ㎕(1 unit) Taq polymerase를 넣고이것에 HaO35 ㎕를 가하여 최종 volume을 50 ㎕되게 맞춘후, 이들 sample을 94℃ 에서 10분간 반응시킨 다음 94℃ 에서 [분간 denaturalization, 55℃ 에서 [분간 annealing, 72℃ 1분간 extension하여 35 cycle로 수행하였으며 마지막 cycle의 extension 반응은 72℃ 에서 5분간 수행하였다. 증폭된 산물은 1.0% agarose gel상에서 전기영동하여 확인하였으며, DNA molecular weight marker는 1 Kb plus DNA LaddeiTM(Gib-coBRL)를 사용하였다
대상 데이터
- Zlotkin et al.(1998)이 디자인한 Z. garvieae의 특이 primers 인 pLG-l(5'-CATAA CAATGA-GAATCGC-3, ) 과 pLG-2(5'-GCACC-CTCGCGGGTG-3')를 주문 제작(Bioneer, Kors)하여 사용하였다.
- 2} 유사성을 보였다. Fig. 1의 D)는 99년도 경북 포항 지역 소재 2곳의 넙치 양^장에서 분리된 7 균주의 실험 결과로 KS35 균주에 band가 형성되었다. KS29, KS30, KS31 및 KS34 균주는 Streptococcus sp.
- 본 실험에 사용된 시험균주는 Table 1과 같이 참조균주 2 균주와 병어에서 분리된 분리균주 35 균주이다
- 본 연구에 사용된 균주들은 전형적인 연쇄구균증을 보이는 양식 중인 40~ 600g의 넙치(Paralichthys olivaceus), 500 ~ 800 g 의 방어 (Serz'o/a quinqueradiatd) 및 400 g 전후의 조피볼락(Seriola quinqueradiata)의 안구주위 농양액, 복수액, 뇌 간장 비장 신장 및 심장등에서 분리하였다. 비교를 위해 사용된 참조균주는 L.
- 분리하였다. 비교를 위해 사용된 참조균주는 L. garvieae ATCC49156(Kusuda et al., 1976)과 ATCC43921(Schlefa-etai, 1985)을 사용하였다Qable 1).
- 시험균주는 울진, 포항 통영, 거제, 제주, 여천 등의 해산 어류 양식장에서 분리, 배양된 것으로서안구 백탁, 아가미 뚜껑 출혈과 농양, 안구 돌출, 근육 농양 및 복부 팽만 등의 증상을 나타내며 폐사되는 병어들로부터 분리되었다. 어종별로는 넙치유래 32 균주 방어 유래 2 균주, 조피볼락 유래 1 균주이며, 분리 시기는 &월부터 11월 사이 이었다.
- FormaHn 불활화균액(fommalin killed cells, FKC)은 4℃ 에서 10, 000xg로 30분간 원심 분리하여 집균하고 PBS로 3회 세척한 후 습중량 2g/2 PBS의 농도로 현탁하여 냉장 보관하였다. 준비된 FKC 현탁액과 Freund's completea(yuvant(FCA)를 동량 혼합한 면역원 1 혼합한 면역원를 1.5kg 수컷 토끼의 귀정맥과 대퇴부 및 견갑골의 피하에 3일간 연속 주사하였2, 2주 후 다시 1 ㎖를 3일 연속 주사하였다 최종 주사일로부터 10일후 심장에서 전채혈한 다음 56℃에서 30분간 가열하여 비동화시킨 것을 시험용 항혈청으로서 실험에 사용하였다.
이론/모형
- Chromosomal DNA 분리 및 확인은 Ausubel et al. (1989)의 방법에 따랐다. 즉, 각 시험균주는 BHI Broth 배지를 이용하여 27℃ 에서 24시간 배양하여 5, 000 rpm에서 3분간 원심분리하고, pellete egg lysozyme( 10 mg/ml)이 함유된 TE(10 mM Tris-HCl, pH 8.
- 시험균주에 대한 응집시험은 PBS로 적절히 희석한 시험용 항혈청을 사용하여 슬라이드 응집시험법으로 실시하였다.
성능/효과
- (1996)은 이 세균의 16S ribosomal RNA의 염기 배열을 조사한 결과 Lactococcus garvieae와 상당히 유사하여 Laaococciw에 포함시킬 것을 주장하였고 Eldar ef M.(19%)은 이 세균의 생화학적 성상 및 DNA-DNA hybridization 결과를 토대로 E. seriolicida 는 L. garvieae의 아종이라고 하였다. 특히.
- 그러나, KS7 균주는생리, 생화학적 특성에서는 일치하였으나 PCR 산물에 의한 band의 형성에서 차이가 났다. Fig. 1의 B)는 98년도에 포항 지역의 넙치에서 분리된 12 균주와 통영 지역의 방어에서 분리된 1 균주, 제주 지역의 넙치에서 분리된 1 균주를 대상으로 실험한 결과서 KS10, KS11, KS12, KS13, KS14, KS16, KS18, KS19, KS20, KS22 및 KS23 균주가 PCR 반응에서 예상 band를 보였다. 그러나, 생리 .
- 또한 운동성 음성. indole 생성능, oxidase 시험 및 catalase 시험에서 음성, nitrate reduction 시험도 음성반응을 나타내었다 당 이용능에서는 lactose 85%, mannitol 91% 및 sorbitol 91%와 같이 균주에 따라 다소 차이를 나타내었으며, arabinase, glycerol, inulin, maltose, melibiose, raffinose, ribose, sucrose, trehalose 에서는 실험 결과가 참조균주와 일치하였다
- garvzkae 가 21 균주, Enterococcus sp. 가 5 균주, Streptococcus sp.7}- 조사된 지역에서 연쇄 구균에 의한 질병 발생은 L.garvieae가 우점을 차지함을 알 수 있었다.
- 결과적으로 넙치에서 분리된 연쇄구균증의 원인균은 LgarWeae가 우점을 차지하는 것으로 조사되었다. 그러므로 우리 나라에서 연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리되는 병원체의 분류학적 위치가 L.
- garvieae 와 유사한특성이 조사되었다. 그러나, KS10, KS11, KS18, KS19, KS22, KS24, KS35 균주는 10℃, 45℃, 6.5% NaCl, pH9.6에서의 성장 유무 등에서 다양한 결과를 보였으나 PCR 방법에 의한 유전자 증폭 결과는 예상 band를 형성하여 L. garw'eae로 동정하였다. 이들 균주들에 대한 표현형과 유전형에서 분류적특성의 차이는 다소 논란의 여지가 있으나, 최근 PCR 방법과 같은 유전학적 연구에 따른 L.
- 그러므로 우리 나라에서 연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리되는 병원체의 분류학적 위치가 L. gatvieae 보다는 S. iaiaw일 것이 라는 일본에서의보고(室賀 . 江草, 1998)와는 차이가 있었으며, 이는이 감염증의 원인균이 L. garvieae를 우점으로 하지만 일부 다른 병원체도 이 질병의 발생에 관여하고 있음을 알 수 있었다.
- 또한, L. garvieae의 특이 primers, pLG-1 (5'-CATAACAATGAGATCGC3)와 pLG-2 (5-GCAC-CCTCGCGGGTG-3)를 사용한 16S rRNA의 PCR시험 결과 분리균주 중 21 균주가 예상 band를 형성 하여 L. garvieae로 판단하였다
- 결과는 Table 2에 나타내었다. 병어에서 분리된 모든 균주는 TSA, BHIA 배지상에서 colony의형태는 circular, convex, entire, translucent한 상태로관찰되었으며, colony의 크기는 l~2mm이었다. Gram 염색에서는 양성으로 chain을 형성한 구균이관찰되었다.
- 본 연구에서 KG+ 항혈청을 이용하여 응집시험한결과, 시험 균주 35균주 중 7 균주 만이 양성반응을나타내었다. KG항혈청에 대한 응집시험을 실시하지 않았기 때문에 음성반응 균주에 대한 항혈청을판단할 수는 없었으나, Steptococcus 속 세균이 모두이 group에 속한다는 점에서 Lactococcus 속 세균과 이들 group 간에는 항원성에 차이가 있는 것으로 사료된다
- 분리균주를 참조균주인 ATCC49156 토끼 항혈청으로 슬라이드 응집 시험한 결과 L. garvieae KG+ type과 응집하는 균주가 7 균주로 관찰되었다.
- 그러나, 생리 . 생화학적 특성 시험 결과에서는 45℃ 및 6.5%NaCl에서의 성장과 40% Bile esculin반응에서 상이점이 관찰되었다. KS15 균주는 Smpfococciw sp.
- 실험에 사용된 모든 균주는 Streptococcus, Enterococcus 또는 Lactococcuse 군으로 나누었으며, 이는 Table 4에 나타내었다 특히, 참조균주와 유사한특성을 보이는 균주는 KS1, KS2, KS3, KS4, KS5, KS6, KS7, KS8, KS9, KS12, KS13, KS14, KS16, KS17, KS19, KS20, KS23, KS32 및 KS33 균주로 판단되었다 그리고 그 외의 균주들은 다양한 생리, 생화학적 특성을 보였다.
- 연쇄구균증을 나타내는 5종의 해산 양식어류로부터 연쇄상구균 35균주를 분리하였으며, 이 균주들의 생리, 생화학적 특성을 L. garwkae와 비교해본 결과 15 균주가 L. garvieaee 속하는 것을 알수 있었다.
- 이상의 결과에 따르면 35종의 분리균주 중 L. garvzkae 가 21 균주, Enterococcus sp. 가 5 균주, Streptococcus sp.
- garv/eoe와의 연관성을 분석하고자 하였다. 이에 따른 분석 결과로 넙치에서 분리한 32 균주 중 KS1, KS2, KS5, KS6, KS8, KS9, KS12, KS13, KS16, KS20, KS23 균주는 그 표현형적 특성과, PCR Assay에서의 분석 결과가 참조균주인 L. garvieae 와 유사한특성이 조사되었다. 그러나, KS10, KS11, KS18, KS19, KS22, KS24, KS35 균주는 10℃, 45℃, 6.
- 해산 양식 어류의 대량 피해를 내는 연쇄상구균증의 원인균에는 분류학적으로 다양한 연쇄상구균이 관련되어 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 그러나 분리 연도를기준으로 하여 볼 때, 1996년 이전의 시험군주에서는 모두 a용혈능을 나타내었고,1998년도 분리균주는 a와 #용혈형이 혼재되었으나 1999년도 분리균주는 모두 #용혈능을 보였다. 그 이유는 본 실험에서는 아직 밝히지 못하였으나 연쇄상구균증의 원인균이 가지는 용혈능이 a형에서 #형으로 강화되고 있다는 점은 앞으로의 병원성 기구를 해명하는데 중요한 자료가 될 것으로 생각되어 이에 관한계속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- garvieaeS} 동정이 보고됨 (Zlotkin et al, 1998)에 따라 본 연구에서도 같은 결과로 인정하였다. 이후, L. ga&e의 동정을 위한 표현형의 특성 연구에서는 40℃, 4.0% NaCl에서의 성장능, pyrrolidonylaiyamidase reaction, arginine hydrolysis 등과 같은 항목의 시험으로 좀더 명 확한 결과가 도출되리라 생 각된다.
- garvieae로 분류하는 것이 타당할것으로 생각된다. 조피볼락에서 분리된 KS4 균주역시 생리, 생화학적 특성과 PCR Assay 결과로 볼때 참조균주와 동일한 L. garvieae로 분류하였으나이 어종에서 연쇄구균증의 원인균에 관해 보고된예가 없어 앞으로 이에 대한 체계적 연구가 요구된다
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