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문제 정의
- 그러나 이러한 Cd의 면역반응계에 미치는 영향에 대한 연구는 포유류에서는 많은 보고가 되어 있으나 어류에 있어서는 혈청내 항체생성에만 국한되어져 이루어지고 있다. 그러므로 본 연구에서는 현재 우리나라의 연안과 육상 양식장에서 활발히 양식되고 있는 넙치를 Cd에 노출시킨 후 그 면역 반응에 미치는 영향을 특정 항원에 대한 혈청내 특이 항체량 변화와 특이 항체 생성 세포 (SASC) 수의 변화를 분석하고자 한다. 이는 단일 세포 수준에서까지 특이적 면역 반응을 분석함으 로써 어류가 오염된 환경의 변화에 어떻게 반응하고 있는지를 조사하여 어류질병예방을 위한 기초자료로서 활용 할 수 있을 것이다.
제안 방법
- Tween20이 첨가된 PBS (T-PBS)를 washing buffer로 각 well을 3회씩 세 척 하였으며 이 후로 모든 단계의 반응이 끝날 때마다 이와 동일하 게 세척하였다. 2% BSA를200 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 결합을 억제하였다 적출된 비장조직을 단일세포로 L-15 세포 배양 배지에 현탁하여 각 well에 lx 10 105, 104 Us의 농도로 duplicate로 넣고 항체 생성을 유도하기 위해 CO2 incubator (CO2 5%)에서 22℃, 6시간동안 배양 하였다. 세척 후 biotinylated rabbit anti-flmder Ig를 25 /ml 의 농도로 반응시키고 alkaline phosphate peroxidase (Sigma Chem.
- )< 1:1000으로 희석하여 75 씩 첨가하여 반응시켰다. 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl phosphate / nitro blue tetrazolium (BCIPZNBT, SigmaChentCo.)을 기질로 사용하여 200 씩 well에 첨가하였다 10분 후에 증류수를 첨가하여 반응 을 정지시키고 형성된 SASC는 해부 현미경으로 그 수를 직접 계수 하였다
- Cd이 넙치의 면역 반응에 미치는 영향을 단일 세포 수준에서 분석하기 위하여 특이 항체를 생산해내는 SASC 수의 변화를 추적하였다. SASC의 검 출은 면역 2주전부터 계속해서 Cd에 노출되었던 시험구 B가 양성 대조구 D와 비교해 볼 때 2주째에 빠른 속도의 항체 생성 세포증가를 보였으며 최대치 (450 spoBlO'splenocytes) 또한 현저하게 높은수치를 보여 주었다 이와 같은 반응은 면역전 2주 간 Cd에 노출되었던 시험구 A에서도 같은 경향으로 나타났다 그러나 이 두 시험구는 양성 대조구 에 비하여 약 2주정도 빠르게 최대치의 spot수를 나타낸 이후 빠른 속도로 감소하기 시작하여 면역 5주 후에는 오히려 낮은 수치를 나타내었다.
- Nitrocellulose nnembrams을 직경 6 mm의 원형으 - 로 자른 후 96 well polystylene micmiter plate 의 각 well 바닥에 부착시켜 ELISPOT을 위한 plate로 준 비하였다. SASC의 검출을 위하여 먼저 ethylenediamine tetra-acetic acid (20 mM, pH 7.
- Nitrocellulose nnembrams을 직경 6 mm의 원형으 - 로 자른 후 96 well polystylene micmiter plate 의 각 well 바닥에 부착시켜 ELISPOT을 위한 plate로 준 비하였다. SASC의 검출을 위하여 먼저 ethylenediamine tetra-acetic acid (20 mM, pH 7.2)로 추출 한 E. tarda KFE 항원을 Ha a (1999)의 방법에 따라 50 ml의 농도가 되게 조제 하고 이를 nitroceUu- lose membranes가 들어있는 96 well polystylene microtiter plate의 각 well에 100 씩 가하여 4℃ 에서 overnight 동안 바닥에 있는 membraries에 항원 을 부착시켰다. Tween20이 첨가된 PBS (T-PBS)를 washing buffer로 각 well을 3회씩 세 척 하였으며 이 후로 모든 단계의 반응이 끝날 때마다 이와 동일하 게 세척하였다.
- 연속적으로 생리식염수로2배씩 희석된 항혈청을 각 well에 50 #씩 가하고 . tarda KFE FKC 항원 (4 mg/ml) 을 50 # 씩 첨가하여 실온의 습윤기에서 overnight동안 반응시킨 후 응집괴가 형성되는 최대 희석 배수를 응집항체 가로 결정하였다
- 본 실험에서 사용한 농도는 Cd”의 농도를 의미하고 있다. 각각의 그룹 당 30마리씩 실험어를 150 i 수조에 수용한 다음 시-육수의 Cd 농도가 20ppb가 되도록 stock solution을 가하였고 매일 수조의 1/2 을 새로운 정상 또는 Cd 첨가 해수로 환수 시키면 서 7주간 실험하였다 이때 각각의 시기별 분석에 사용한 어류의 개체수는 5마리씩으로 하였다 Cd의노출과 E. tarda KFE FKC (E. tarda bacterin)의 immimiation scMEule 에 대한 것은 Tabled] 표시하였다.
- 6X104 cfb/ml로 한 후 이를 공격 실험용 세균액으로 사용하였다. 공격 실험은 면역전 2주와 면역 후 7주간 계속 Cd에 노출된 시험구와 면역 후 7주간 정상해수에 두었던 양성 대조구 그리고 immuniztion을 하지 않은 음성 대조구. 즉 그룹 B, D, E 각 20마리 씩에 준비한 E tarda KFE 균액을 개체당 0.
- 동해 연안양식장의 병어로부터 분리한 E. tarda KFE 균주를 5.6xl03cfb/nsh로 복강 주사하여 전 실험기간동안 Cd에 노출된 B 시험구를 대상으로 하여 누적 폐사율을 분석하였다. 그 결과 면역 전 후에 지속적인 침지로 Cd에 노출된 시험구 B와 음성 대조구 E는 6일 후 100%의 누적 폐사율을 나타내었다 (Fig.
- Cd이 넙치의 면역 반응에 미치는 영향을 보기 위하여 EKFEFKC를 복강 주사한 넙치에 Cd을 침지법으로 각기 다른 노출시기와 노출시간 으로 하여 처리 하였다. 면역 반응의 분석은 E. tardaKFEFKC 에 대한 응집 항체가를 측정하였다 (Fig. 1). 그 결과 Cd에 노출된 모든 시험구에서 혈청 내 특이항체가 2주째부터 증가하기 시작하였다.
- 2의 phosphate buffered saline (PBS) 완충용액에 습중량농도로 100 mg/rM으로 현탁시킨 다음 Freund's complete adju- vant(FCA)와 1 : 1로 혼합하여 어체 당 10㎎/㎏의 농도로 복강 주사하였다. 면역 후 1, 2, 3, 5, 7 주째에 각 그룹의 어류 미부 혈관으로 채혈을 실시하여 특이 항체 생성을 분석하였으며 항체 생성 세포 분석에는 신속하게 적출된 비장 조직을 단일 세포화하여 사용하였다
- 생리적 독성물질임에도 불구하고 일시적 어류의 면역반응 증가효과를 유도하는 것과 같이 보이는 Cd에의 노출이 실질적인 어류의 방어체계에서 어떠한 효과를 나타내는지를 직접 분석하기 위하여 항원 (FKC 형태)으로 사용한 E. tarda KFE 생균으로 공격실험을 실시하였다 (Fig. 3). 본 실험에서는 자연계의 어류가 Cd에 노출 되는 것은 환경의 변 화속에서 상당기간 지속적일 것이므로 면역 전과 면역 후 계속 Cd에 노출 시킨 실험구 B와 대조구들을 비교대상으로 하였는데.
- tarda KFE 항체의 측정은 U 형 96 well polystylene microtiter plate< 이용하여 연속적으로 희석 하는 microtiter법을 이용하였다. 연속적으로 생리식염수로2배씩 희석된 항혈청을 각 well에 50 #씩 가하고 . tarda KFE FKC 항원 (4 mg/ml) 을 50 # 씩 첨가하여 실온의 습윤기에서 overnight동안 반응시킨 후 응집괴가 형성되는 최대 희석 배수를 응집항체 가로 결정하였다
- 공격 실험은 면역전 2주와 면역 후 7주간 계속 Cd에 노출된 시험구와 면역 후 7주간 정상해수에 두었던 양성 대조구 그리고 immuniztion을 하지 않은 음성 대조구. 즉 그룹 B, D, E 각 20마리 씩에 준비한 E tarda KFE 균액을 개체당 0.1 ml씩 복강주사하여 9일 동안 관찰하였고 결과는 누적 폐사율로 나타내었다
대상 데이터
- tarda KFE 의 formalin killed cell (FKC)로 면역시키기 2주전부터 계속하여 실험 기간동안 침지법으로 Cd(20ppb)에 노출된 시험구는 노출되지 않은 시험 구와 양성 대조구보다 혈청내 특이 항체가가 빠르게 최고치에 이르렀으나, 감소속도는 노출시키지 않은 양성 대조구에 비하여 빠른 것으로 나타났다 이러한 경향은 splenocytes를 ELISPOT-assay (enzyme-linked immunospot assay)를 이용하여 특이 항체 생성 세포 (specific antibody secreting cell, SASC) 수를 분석해 보았을 때에도 동일하게 나타났다 그러나 면역전 2주 동안만 Cd에 노출시킨 시험구에서는 혈청내 항체생성 결과와는 달리 증가된 SASC의 수를 보여 주었다. 그리고 면역 2주 전부터 실험 전기간동안 계속해서 Cd에 노출시킨 넙치를 대상으로 하여 E. tarda KFE 생균으로 인위 감염 시켰을 때 100% 폐사율을 보여 주었다. 이것은 Cd에 지속적으로 노출된 어류에서의 방어 체 계는 면역반응뿐만 아니라 독성효과도 함께 고려되어야 하는 복합적인 것임을 확인할 수 있었다.
- 3). 본 실험에서는 자연계의 어류가 Cd에 노출 되는 것은 환경의 변 화속에서 상당기간 지속적일 것이므로 면역 전과 면역 후 계속 Cd에 노출 시킨 실험구 B와 대조구들을 비교대상으로 하였는데. 실험구 B 와 면역을 실시하지 않은 정상해수의 실험구 E는 모두 100% 의 폐사율을 나타내었다.
- 평균체중 40g의 병력이 없고 건강한 넙치 (Par- alichthys oivaceiMs)를 남해안의 한 양식장에서 분양받아 실험실 수조에서 수온 22℃로 유지하여 실험 전 2주간 순치시킨 후 실험에 사용하였다
이론/모형
- Cd이 넙치의 면역 반응에 미치는 영향을 보기 위하여 EKFEFKC를 복강 주사한 넙치에 Cd을 침지법으로 각기 다른 노출시기와 노출시간 으로 하여 처리 하였다. 면역 반응의 분석은 E.
- 미부 정맥을 통하여 채혈된 혈액을 4℃에서 12 시간 이상 정치시킨 후 원심 분리 (8, 000 rpm, 10 min)하여 혈청을 분리하였다 혈청 내 형성된 항 E. tarda KFE 항체의 측정은 U 형 96 well polystylene microtiter plate< 이용하여 연속적으로 희석 하는 microtiter법을 이용하였다. 연속적으로 생리식염수로2배씩 희석된 항혈청을 각 well에 50 #씩 가하고 .
성능/효과
- Cd이 넙치의 면역 반응에 미치는 영향을 단일 세포 수준에서 분석하기 위하여 특이 항체를 생산해내는 SASC 수의 변화를 추적하였다. SASC의 검 출은 면역 2주전부터 계속해서 Cd에 노출되었던 시험구 B가 양성 대조구 D와 비교해 볼 때 2주째에 빠른 속도의 항체 생성 세포증가를 보였으며 최대치 (450 spoBlO'splenocytes) 또한 현저하게 높은수치를 보여 주었다 이와 같은 반응은 면역전 2주 간 Cd에 노출되었던 시험구 A에서도 같은 경향으로 나타났다 그러나 이 두 시험구는 양성 대조구 에 비하여 약 2주정도 빠르게 최대치의 spot수를 나타낸 이후 빠른 속도로 감소하기 시작하여 면역 5주 후에는 오히려 낮은 수치를 나타내었다. 시험 구 C는 3주까지는 가장 낮은 항체 생성 세포가 검 출되었으나 5주째에는 많은 수의 항체 생성 세포가 생성되어 검출되었고 양성 대조구 D는 5주째까지 점차적으로 증가하다가 이후로 검출되는 의 수가 서서히 감소하였다 (fig.
- 각기 다른 조건으로 Cd에 노출시킨 넙치의 E. tarda KFE FKC에 대한 응집 항체 가를 1, 2, 3, 5, 7주째에 측정한 결과 모든 시험구의 혈청내 특이항체가 2주째부터 증가하기 시작하였으며 특히 시험구 B에서 가장 빠르게 증가하는 경향을 보여주었다 이러한 결과는 메기를 사용한 Albergoni and Viola(1995)의 보고와 유사 하였지만 5주째 이후로 는 특이 항체가가 다른 시험구에 비해 빠르게 감소하는 차이점을 나타내어 사용한 항원과 어종간의 특성 때문에 다르게 나타날 수 있음을 보여주었 다 (Fig. 1). 그리고 Cd이 미치는 체액성 특이 면역 반응의 변화를 단일세포수준에서 분석하기 위하여 SASC의 변화를 알아 본 결과 면역전 2주간 Cd에 노출되었던 시험구 A와 면역 전후로 계속해서 Cd 에 노출되었던 시험구 B가 양성 대조구인 D에비하여 2주째 부터 항체 생성 세포의 빠른증가를 보였고 최대치 또한 높게 나타났다 (Fig.
- 결론적으로 Cd에 지속적으로 노출된 어류는 특이 면역 반응에서 peaking timee 빠르나 SASC의 수 또는 항체량이 빨리 감소하는 반응을 보여주었으며 전체적인 방어 체계에서는 면역반응에 대한 것뿐만 아니라 독성효과도 함께 고려되어야 하는 복합적인 것임을 확인할 수 있었다
- 1). 그 결과 Cd에 노출된 모든 시험구에서 혈청 내 특이항체가 2주째부터 증가하기 시작하였다. 그러나 면역 전후로 계속해서 Cd에 노출된 시 험구 B의 혈청내 항 E tarda KFE 항체가는 면역 전후 정상해수에 있던 양성 대조구 D와 비교하여 볼 때 면역 후2주째부터 빠른 혈청 내 항체가의 증가를 보여 주었다.
- 6xl03cfb/nsh로 복강 주사하여 전 실험기간동안 Cd에 노출된 B 시험구를 대상으로 하여 누적 폐사율을 분석하였다. 그 결과 면역 전 후에 지속적인 침지로 Cd에 노출된 시험구 B와 음성 대조구 E는 6일 후 100%의 누적 폐사율을 나타내었다 (Fig. 3). 그러나 EaKFEFKC로 면역시킨 양성 대조구。에서도 약 30%의 폐사율을 나타내어 본 균주는 병원성이 상당히 강한 것으로 나타났다.
- 1). 그리고 Cd이 미치는 체액성 특이 면역 반응의 변화를 단일세포수준에서 분석하기 위하여 SASC의 변화를 알아 본 결과 면역전 2주간 Cd에 노출되었던 시험구 A와 면역 전후로 계속해서 Cd 에 노출되었던 시험구 B가 양성 대조구인 D에비하여 2주째 부터 항체 생성 세포의 빠른증가를 보였고 최대치 또한 높게 나타났다 (Fig. 2). 그러나 A, B 두 시험구는 최대치의 SASC수를 나타낸 이후에는 다른 시험구에 비하여 빠른 SASC수의 감소를 보여주어 시험구 B의 혈청내 항체량 변화 결과와 유사한 경향을 나타내었다.
- SASC의 검 출은 면역 2주전부터 계속해서 Cd에 노출되었던 시험구 B가 양성 대조구 D와 비교해 볼 때 2주째에 빠른 속도의 항체 생성 세포증가를 보였으며 최대치 (450 spoBlO'splenocytes) 또한 현저하게 높은수치를 보여 주었다 이와 같은 반응은 면역전 2주 간 Cd에 노출되었던 시험구 A에서도 같은 경향으로 나타났다 그러나 이 두 시험구는 양성 대조구 에 비하여 약 2주정도 빠르게 최대치의 spot수를 나타낸 이후 빠른 속도로 감소하기 시작하여 면역 5주 후에는 오히려 낮은 수치를 나타내었다. 시험 구 C는 3주까지는 가장 낮은 항체 생성 세포가 검 출되었으나 5주째에는 많은 수의 항체 생성 세포가 생성되어 검출되었고 양성 대조구 D는 5주째까지 점차적으로 증가하다가 이후로 검출되는 의 수가 서서히 감소하였다 (fig.2).
- 어류의 면역 반응에 대한 cadmium (Cd)의 영향을 분석하기 위하여 넙치 (Paralichthys olivaceus)^:각기 다른 방법으로 Cd에 노출시킨후 특이적 면역반응의 변화와 Edwardsiella tarda KFE (E. tarda KFE)의 인위감염에 대한 저항성을 분석하였다 E. tarda KFE 의 formalin killed cell (FKC)로 면역시키기 2주전부터 계속하여 실험 기간동안 침지법으로 Cd(20ppb)에 노출된 시험구는 노출되지 않은 시험 구와 양성 대조구보다 혈청내 특이 항체가가 빠르게 최고치에 이르렀으나, 감소속도는 노출시키지 않은 양성 대조구에 비하여 빠른 것으로 나타났다 이러한 경향은 splenocytes를 ELISPOT-assay (enzyme-linked immunospot assay)를 이용하여 특이 항체 생성 세포 (specific antibody secreting cell, SASC) 수를 분석해 보았을 때에도 동일하게 나타났다 그러나 면역전 2주 동안만 Cd에 노출시킨 시험구에서는 혈청내 항체생성 결과와는 달리 증가된 SASC의 수를 보여 주었다. 그리고 면역 2주 전부터 실험 전기간동안 계속해서 Cd에 노출시킨 넙치를 대상으로 하여 E.
- tarda KFE 생균으로 인위 감염 시켰을 때 100% 폐사율을 보여 주었다. 이것은 Cd에 지속적으로 노출된 어류에서의 방어 체 계는 면역반응뿐만 아니라 독성효과도 함께 고려되어야 하는 복합적인 것임을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 2), 이것은 Cd이 면역반응에 영향을 주기 위하여서는 생체 내 축적 기간이 필요하기 때문인 것으로 생각되어 진다. 그러나 특이 항체량의 분석 에서는 이러한 현상이 뚜렷하게 나타나지 않았는데 (Fig. 1) 이에 대하여서는 Cd의 축적속도 면역반응의 단계, 그리고 다른 면역 반응 관련세포(T세 포, Macrophage) 등의 변화가 보다 구체적으로 분석되어져야 할 것이다. 그리고 어종간.
- 그리고 어종간. 수온 등의 영향이 Cd의 노출농도 변화에 따라 어떠한 영향을 나타내는지에 대한 분석은 향후 다시 이루어져야 할 과제로 남아있다.
- 그러므로 본 연구에서는 현재 우리나라의 연안과 육상 양식장에서 활발히 양식되고 있는 넙치를 Cd에 노출시킨 후 그 면역 반응에 미치는 영향을 특정 항원에 대한 혈청내 특이 항체량 변화와 특이 항체 생성 세포 (SASC) 수의 변화를 분석하고자 한다. 이는 단일 세포 수준에서까지 특이적 면역 반응을 분석함으 로써 어류가 오염된 환경의 변화에 어떻게 반응하고 있는지를 조사하여 어류질병예방을 위한 기초자료로서 활용 할 수 있을 것이다.
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